發(fā)酵工藝學(xué)講訴

1、第第19章章 核酸類藥物核酸類藥物“ 珍奧核酸”的爭論?1998年4月，大連珍奧核酸科技發(fā)展有限公司在大連開發(fā)區(qū)建成一期工程。? 珍奧核酸說明書摘錄增強(qiáng)基因自我修復(fù)能力，顯著改善腦機(jī)能，促進(jìn)新陳代謝及細(xì)胞分裂，提高免疫力，美容養(yǎng)顏潤膚。核酸具有抗病毒，抑腫瘤，抗衰老，健腦益智的功效。在臨床實驗中，令醫(yī)學(xué)界十分驚奇的是：在 糖尿病及并發(fā)癥，肝臟疾病，高脂血癥，腦血栓后遺癥等心腦血管疾病， 老年癡呆癥，肢體震顫麻痹（帕金森氏?。?，關(guān)節(jié)炎，白細(xì)胞減少癥，神經(jīng)系統(tǒng)疾病，肝腎受損等諸多方面，核酸都顯現(xiàn)出獨特的保健功效。在廣告中加入在廣告中加入38位因研究核酸而獲得諾貝爾獎的科學(xué)家的材料位因研究核酸而獲得

2、諾貝爾獎的科學(xué)家的材料?“ 珍奧核酸” 成為大連的重點推薦產(chǎn)品。? 在兩年的時間里，“ 珍奧核酸”獲得：? “全國第十二屆發(fā)明展覽金獎 ”? 中國保健科技協(xié)會“ 向消費(fèi)者推薦產(chǎn)品向消費(fèi)者推薦產(chǎn)品 ”? 衛(wèi)生部“2000年中老年保健國際學(xué)術(shù)論壇暨中國保健品國際博年中老年保健國際學(xué)術(shù)論壇暨中國保健品國際博覽會金獎覽會金獎”? 遼寧省政府“ 醫(yī)藥行業(yè)科技進(jìn)步一等獎醫(yī)藥行業(yè)科技進(jìn)步一等獎 ”? 方舟子方舟子：“核酸營養(yǎng)是個商業(yè)大騙局核酸營養(yǎng)是個商業(yè)大騙局”? 中國“人類基因組計劃”項目負(fù)責(zé)人楊煥明楊煥明“所謂核酸食所謂核酸食品在營養(yǎng)價值上和米粉沒有太大的差別品在營養(yǎng)價值上和米粉沒有太大的差別”? 加州

3、理工學(xué)院院長戴維戴維巴爾的摩巴爾的摩（1975年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎）：“據(jù)我所知，沒有證據(jù)表明核酸是一種營養(yǎng)物或有益健康。據(jù)我所知，沒有證據(jù)表明核酸是一種營養(yǎng)物或有益健康。在我看來它不可能有任何益處在我看來它不可能有任何益處?！比绾畏智搴怂帷⒑怂崴幬铩⒄鋳W核酸三者之間的區(qū)別？?第19章?第一節(jié)?第二節(jié)?第三節(jié)核酸類藥物核酸類藥物概述天然核酸類物質(zhì)的制取核酸類結(jié)構(gòu)改造藥物的制備第十四章 核酸類藥物?第一節(jié)?第二節(jié)?第三節(jié)核酸類藥物概述1.核酸類藥物概述2.核酸類藥物分類天然核酸類物質(zhì)的制取核酸類結(jié)構(gòu)改造藥物的制備第十四章 核酸類藥物? 第一節(jié) 核酸類藥物概述? 第二節(jié) 天然核酸類物質(zhì)的制取1.RNA與

4、DNA的提取與制備（一）RNA的提取與制備（二）DNA的提取與制備2.單核苷酸的制備（一）酶解法（二）發(fā)酵法生產(chǎn)核苷酸（三）半合成法制備核苷酸3.核苷的制備（一）RNA化學(xué)水解法制備核苷（二）發(fā)酵法生產(chǎn)核苷? 第三節(jié) 核酸類結(jié)構(gòu)改造藥物的制備?第一節(jié)?第二節(jié)?第三節(jié)核酸類藥物概述天然核酸類物質(zhì)的制取核酸類結(jié)構(gòu)改造藥物的制備1.疊氮胸苷（AZT）2.阿糖腺苷3.三氮唑核苷4.阿糖胞苷5.聚肌胞苷酸 (PolyI:C）6.胞二磷膽堿核酸類藥物概述?在1869年，F(xiàn). Mischer從細(xì)胞核中分離得到一種酸性物質(zhì)，即現(xiàn)在被稱為 核酸的物質(zhì)。?1939年，E. Knapp等第一次用實驗方法證實核酸是生

5、命遺傳的基礎(chǔ)物質(zhì)。?核酸不僅攜帶有各種生物所特有的 遺傳信息而且影響生物的蛋白質(zhì)合成和脂肪、糖類的代謝。核酸類藥物概述核酸類藥物概述胰核酸酶胰核酸酶胰、腸核苷酸酶胰、腸核苷酸酶核苷酶核苷酶核酸類藥物概述核酸類藥物概述?核酸類藥物則正是在核酸類藥物則正是在 恢復(fù)它們的正常代謝恢復(fù)它們的正常代謝 或或干擾干擾某些異常代謝某些異常代謝中發(fā)揮作用的。中發(fā)揮作用的。? 高尿酸血癥：尿酸鹽結(jié)晶沉積于關(guān)節(jié)、軟組織、軟骨及腎，導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎、尿路結(jié)石和腎臟疾病。? 治療:別嘌呤醇? 核苷及其衍生物干擾病毒干擾病毒DNA的合成，治療病毒疾病的合成，治療病毒疾病。? 腺苷、肌苷、尿苷、核苷酸、脫氧核苷酸、雙丁酰環(huán)腺苷

6、酸、胞二磷膽堿、核苷三磷酸等核酸組分及衍生物，是天然的代謝激活劑，有助于改善機(jī)體的物質(zhì)代謝和能量代謝，加速受損組織的修復(fù)。臨床廣泛用于放射病、血小板減少、急慢性肝炎、血細(xì)胞減少、心血管疾病等。? 輔酶A是調(diào)節(jié)糖、脂肪及蛋白質(zhì)代謝的重要因子，用于治療動脈硬化、脂肪肝、各種肝炎等。?嘌呤核苷酸AMPGMP?嘧啶核苷酸的結(jié)構(gòu)核酸類藥物分類1、具有天然結(jié)構(gòu)的核酸類物質(zhì)、具有天然結(jié)構(gòu)的核酸類物質(zhì)?如：如：ATP、GTP、CTP、UTP、IMP、輔、輔酶酶A、輔酶、輔酶。? 這類藥物有助于改善物質(zhì)代謝和能量平衡，修復(fù)受損組織，促使缺氧組織恢復(fù)正常生理機(jī)能。? 臨床上廣泛用于放射病、血小板減少癥、白細(xì)胞減少

7、癥、急慢性肝炎、心血管疾病和肌肉萎縮等的治療。?這些藥物多數(shù)是生物體自身能夠合成的物質(zhì)，在這些藥物多數(shù)是生物體自身能夠合成的物質(zhì)，在具有一定臨床功能的前提下，毒副作用小，它們具有一定臨床功能的前提下，毒副作用小，它們的生產(chǎn)基本上都可以經(jīng)微生物發(fā)酵或從生物資源的生產(chǎn)基本上都可以經(jīng)微生物發(fā)酵或從生物資源中提取。中提取。? ATP:ATP:用于心肌炎、心肌梗死、心力衰竭、及動脈或冠狀動脈硬化、肝用于心肌炎、心肌梗死、心力衰竭、及動脈或冠狀動脈硬化、肝炎等的治療或輔助治療。炎等的治療或輔助治療。? 肌苷肌苷: :用于急慢性肝炎、肝硬化、白細(xì)胞減少、血小板減少等。用于急慢性肝炎、肝硬化、白細(xì)胞減少、血小

8、板減少等。二、自然結(jié)構(gòu)核酸類物質(zhì)的類似物和聚合物二、自然結(jié)構(gòu)核酸類物質(zhì)的類似物和聚合物?它們是當(dāng)今人類治療病毒、腫瘤、艾滋病它們是當(dāng)今人類治療病毒、腫瘤、艾滋病的重要藥物，也是產(chǎn)生干擾素、免疫抑制的重要藥物，也是產(chǎn)生干擾素、免疫抑制的臨床藥物。的臨床藥物。?主要有主要有疊氮胸苷疊氮胸苷、阿糖腺苷阿糖腺苷、阿糖胞苷阿糖胞苷、聚肌胞聚肌胞等。等。OHNONCF3OHNOCH3NOHNOOIH N2NNNNOHOHOOOHOOHOOH三氟 代 胸 苷N3疊氮 胸 苷OH5- 碘脫氧 尿 苷OHOHOH三 氮唑核苷OHOHNHH2NNOHNHNNNHHOHONONNNNONHH2NNNNH2NNOOH

9、OHCH2OHCH2OHHOOH無環(huán) 鳥 苷丙氧 鳥 苷OH阿糖腺苷雙 脫氧 肌苷? 它們大部分通過由自然結(jié)構(gòu)的核酸類物質(zhì)進(jìn)行它們大部分通過由自然結(jié)構(gòu)的核酸類物質(zhì)進(jìn)行半合成半合成為結(jié)為結(jié)構(gòu)改造物，或者采用構(gòu)改造物，或者采用化學(xué)一酶合成法化學(xué)一酶合成法。珍奧核酸究竟是什么？是從動植物組織中提取的核酸類物質(zhì)，并不一定含有上述核酸類藥物。因而珍奧核酸是一種保健品，服用珍奧核酸起不到上述治療作用，保健品也不應(yīng)作為藥物使用。（一）（一）RNA的提取與制備的提取與制備在工業(yè)上主要由在工業(yè)上主要由RNA生產(chǎn)生產(chǎn)5-核苷酸。核苷酸。RNA經(jīng)經(jīng)桔青酶桔青酶作用可得鮮厚味強(qiáng)的作用可得鮮厚味強(qiáng)的 5-呈味核苷呈味核

10、苷酸；在醫(yī)藥上，可治肝炎、心臟病、關(guān)節(jié)炎、酸；在醫(yī)藥上，可治肝炎、心臟病、關(guān)節(jié)炎、抗癌和抗病毒；抗癌和抗病毒；RNA還可應(yīng)用于洗滌劑、乳化還可應(yīng)用于洗滌劑、乳化劑、奶液和雪花膏等，在日用化妝品中，有潤劑、奶液和雪花膏等，在日用化妝品中，有潤膚養(yǎng)顏的效果；在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，膚養(yǎng)顏的效果；在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中， RNA的使用可的使用可使農(nóng)作物早熟和增產(chǎn)使農(nóng)作物早熟和增產(chǎn) 。? 1. RNA的工業(yè)來源的工業(yè)來源從微生物中提取從微生物中提取RNA，是工業(yè)上最實際和有效的方法，是工業(yè)上最實際和有效的方法，一些最常見的菌體含有豐富的核酸資源。一些最常見的菌體含有豐富的核酸資源。通常在細(xì)菌中RNA占5-25，在酵母中占

11、2.715，在霉菌中占0.7%28%, 面包酵母含RNA4.17.2。? 2. 高高RNA含量酵母菌體的篩選含量酵母菌體的篩選酵母菌體收率高，易于提取RNA 。可以可以從自然界篩選從自然界篩選并可用并可用誘變育種誘變育種的方法提高酵母的的方法提高酵母的RNA含量。含量。發(fā)酵法生產(chǎn)高含量發(fā)酵法生產(chǎn)高含量RNARNA酵母及其酵母及其RNARNA提取工藝提取工藝流程見圖。流程見圖。?3用工業(yè)廢水培養(yǎng)高含量用工業(yè)廢水培養(yǎng)高含量RNA酵母酵母使用工業(yè)廢水培養(yǎng)高含量使用工業(yè)廢水培養(yǎng)高含量 RNA酵母減少環(huán)境污酵母減少環(huán)境污染，降低糧食消耗，如染，降低糧食消耗，如 味精生產(chǎn)廢水味精生產(chǎn)廢水中的成份基中的成份

12、基本上可供酵母生長。本上可供酵母生長。?4.RNA提取實例（二）（二）DNA的提取與制備的提取與制備DNA，可以促進(jìn)細(xì)胞的活化，調(diào)節(jié)新陳代謝，延緩機(jī)體衰老，維護(hù)正常免疫功能有積極的作用。? 1工業(yè)用工業(yè)用DNA的提取的提取從冷凍魚精中提取。魚精中主要含有核蛋白、酶類以及多種微量元素。核蛋白的主要成分是脫氧核糖核酸(DNA)和堿性蛋白質(zhì)(魚精蛋白)，其中DNA 占大約23。纖維狀纖維狀DNADNA沉淀沉淀? 2具有生物活性具有生物活性DNA的制備的制備可從可從動物內(nèi)臟動物內(nèi)臟（肝、脾、胸腺）中提取制備，操作條件（肝、脾、胸腺）中提取制備，操作條件03。動物內(nèi)臟加4倍量生理鹽水經(jīng)組織搗碎機(jī)搗碎1分

13、鐘，勻漿于2500rpm離心30分鐘，沉淀用同樣體積的生理鹽水洗滌3次，每次洗滌后離心，將沉淀懸浮于20倍量的冷生理鹽水中，再搗碎3分鐘，加入2倍量5十二烷基磺酸鈉，并攪拌23小時，在0 2500rpm離心，在上層液中加入等體積的冷乙醇，離心即可得纖維狀DNA，再用冷乙醇和丙酮洗滌，減壓低溫干燥得粗品DNA。（一）酶解法（一）酶解法1. 酶解法制備脫氧核苷酸酶解法制備脫氧核苷酸 ，參見吳梧桐主編，參見吳梧桐主編， p3302. 酶解法制備戊糖核苷酸，酶解法制備戊糖核苷酸，參見吳梧桐主編，參見吳梧桐主編， p331? 3雙酶法生產(chǎn)肌苷酸和雙酶法生產(chǎn)肌苷酸和鳥苷酸（鳥苷酸（I+G）。）。? 呈味核

14、苷酸的主要品種是呈味核苷酸的主要品種是肌苷酸鈉和鳥苷酸鈉，商肌苷酸鈉和鳥苷酸鈉，商品名稱為（品名稱為（I+G），用核），用核酸酶酸酶P1降解降解RNA可獲得可獲得GMP和和AMP，其中，其中AMP經(jīng)脫氨生成經(jīng)脫氨生成IMP。? 雙酶法生產(chǎn)肌苷酸和鳥苷雙酶法生產(chǎn)肌苷酸和鳥苷酸的工藝流程酸的工藝流程?參見吳梧桐主編，參見吳梧桐主編，p330?4.菌體自溶法生產(chǎn)核苷酸菌體自溶法生產(chǎn)核苷酸?磷酸二酯酶磷酸二酯酶在合適的條件下降解細(xì)胞內(nèi)的在合適的條件下降解細(xì)胞內(nèi)的 RNA可產(chǎn)生可產(chǎn)生5-核苷酸。在國內(nèi)用核苷酸。在國內(nèi)用谷氨酸產(chǎn)生菌體谷氨酸產(chǎn)生菌體自溶自溶法生產(chǎn)法生產(chǎn)5 -核苷酸。工藝流程如下：核苷酸。工

15、藝流程如下：?5堿水解法生產(chǎn)堿水解法生產(chǎn)2 、3 -混合核苷酸?；旌虾塑账帷?用用酶法酶法降解降解RNA得到的是得到的是5-核苷酸，可用于生產(chǎn)核苷酸，可用于生產(chǎn)呈味核苷酸。呈味核苷酸。?2 2、3 3 - -混合核苷酸混合核苷酸在醫(yī)藥上有它的特殊用途。對血小板減少，白血球減少癥和癌癥化療后升白血球均有較好療效。? 用用堿水解堿水解RNA 可產(chǎn)生可產(chǎn)生2、3 -混合核苷酸。實際上，是由混合核苷酸。實際上，是由于稀堿水解過程中，先形成一個中間環(huán)狀物于稀堿水解過程中，先形成一個中間環(huán)狀物2、3 環(huán)狀環(huán)狀核苷酸，它很不穩(wěn)定，進(jìn)一步水解生成核苷酸，它很不穩(wěn)定，進(jìn)一步水解生成2，3 核苷酸。核苷酸。（二）

16、發(fā)酵法生產(chǎn)核苷酸（二）發(fā)酵法生產(chǎn)核苷酸IMP生成總反應(yīng)過程生成總反應(yīng)過程（二）發(fā)酵法生產(chǎn)核苷酸（二）發(fā)酵法生產(chǎn)核苷酸AMP和和GMP的生成的生成SAMPSAMP 合成酶合成酶IMP脫氫酶脫氫酶SAMP 裂解酶裂解酶GMP合成酶合成酶（二）發(fā)酵法生產(chǎn)核苷酸（二）發(fā)酵法生產(chǎn)核苷酸?1.發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷酸（發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷酸（IMP）?肌苷酸鈉是一種肌苷酸鈉是一種高效增鮮劑高效增鮮劑，在谷氨酸鈉中，在谷氨酸鈉中添加添加2%，鮮度可以增加，鮮度可以增加3倍。因此在味精中倍。因此在味精中添加肌苷酸鈉后成為第二代特鮮味精。添加肌苷酸鈉后成為第二代特鮮味精。?(1)產(chǎn)氨短桿菌嘌呤核苷酸生物合成途徑，代產(chǎn)氨短桿菌

17、嘌呤核苷酸生物合成途徑，代謝調(diào)控和肌苷酸發(fā)酵機(jī)制。謝調(diào)控和肌苷酸發(fā)酵機(jī)制。（參見吳梧桐主編，（參見吳梧桐主編，p333）?對對5 -IMP的生物合成來說，關(guān)鍵的酶是的生物合成來說，關(guān)鍵的酶是 PRPP轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)酰胺酶，利用酰胺酶，利用產(chǎn)氨短桿菌產(chǎn)氨短桿菌直接發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷酸直接發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷酸的關(guān)鍵：的關(guān)鍵：?使用使用腺嘌呤缺陷型腺嘌呤缺陷型菌株。菌株。?提供提供亞適量腺嘌呤亞適量腺嘌呤從而解除了對從而解除了對PRPP轉(zhuǎn)酰胺轉(zhuǎn)酰胺酶的活性影響。酶的活性影響。?選育選育Mn 不敏感性不敏感性變異株變異株2+?菌本身的菌本身的5 -核苷酸核苷酸降解酶降解酶活力低活力低?2.發(fā)酵法生產(chǎn)黃苷酸（發(fā)酵法生產(chǎn)黃

18、苷酸（ XMP）及酶法轉(zhuǎn)化成鳥苷）及酶法轉(zhuǎn)化成鳥苷酸（酸（GMP）。）。鳥苷酸鈉鳥苷酸鈉是比肌苷酸鈉更強(qiáng)的增鮮劑，它還是三氮唑是比肌苷酸鈉更強(qiáng)的增鮮劑，它還是三氮唑核苷和無環(huán)鳥嘌呤的原料，因此在食品工業(yè)和制藥行業(yè)中核苷和無環(huán)鳥嘌呤的原料，因此在食品工業(yè)和制藥行業(yè)中需求量很大。需求量很大。然而直接發(fā)酵生產(chǎn)然而直接發(fā)酵生產(chǎn)GMP產(chǎn)量很低，沒有生產(chǎn)價值。產(chǎn)量很低，沒有生產(chǎn)價值。?黃苷酸黃苷酸（XMP）是鳥苷酸（）是鳥苷酸（GMP）的前體產(chǎn)物，）的前體產(chǎn)物，可以通過累積黃苷酸（可以通過累積黃苷酸（ XMP），之后再用酶轉(zhuǎn)化），之后再用酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)法生產(chǎn)GMP。?菌種菌種A：喪失：喪失GMP合成酶的鳥嘌

19、呤缺陷型和腺嘌合成酶的鳥嘌呤缺陷型和腺嘌呤缺陷型。呤缺陷型。?菌種菌種B：5-核苷酸分解力微弱，核苷酸分解力微弱， GMP合成酶活性合成酶活性強(qiáng)強(qiáng).?控制控制A、B菌接種比例，混合培養(yǎng)，大量產(chǎn)生菌接種比例，混合培養(yǎng)，大量產(chǎn)生XMP并高效轉(zhuǎn)化成并高效轉(zhuǎn)化成GMP。（三）（三）半合成法半合成法制備核苷酸制備核苷酸? 由于由于發(fā)酵法發(fā)酵法生產(chǎn)核苷的生產(chǎn)核苷的產(chǎn)率很高產(chǎn)率很高，因此可由發(fā)酵法生產(chǎn)核，因此可由發(fā)酵法生產(chǎn)核苷后經(jīng)提取，精制再經(jīng)磷酸化制取核苷酸。苷后經(jīng)提取，精制再經(jīng)磷酸化制取核苷酸。? 方法方法：將核苷懸浮于磷酸三甲酯或磷酸三乙酯中，在冷卻：將核苷懸浮于磷酸三甲酯或磷酸三乙酯中，在冷卻條件下

20、加入氯化氧磷，進(jìn)行磷酸化。從核苷生成條件下加入氯化氧磷，進(jìn)行磷酸化。從核苷生成5 -核苷核苷酸收率可達(dá)酸收率可達(dá)90%。 氯化氧磷氯化氧磷 肌苷，懸浮于磷酸三乙酯中肌苷，懸浮于磷酸三乙酯中 肌苷酸（肌苷酸（IMPIMP） 0 0 核苷的制備核苷的制備? 核苷核苷是多種核苷類藥物的原料，這些藥物通常是生物自身是多種核苷類藥物的原料，這些藥物通常是生物自身能夠合成的組成遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)類似物，目前已用于臨床能夠合成的組成遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)類似物，目前已用于臨床的此類藥物有幾十種。的此類藥物有幾十種。? 另外，核苷的另外，核苷的發(fā)酵法發(fā)酵法生產(chǎn)水平大大高于同類結(jié)構(gòu)核苷酸的生產(chǎn)水平大大高于同類結(jié)構(gòu)核苷酸的發(fā)

21、酵水平，因此肌苷酸鈉，鳥苷酸鈉可分別由肌苷和鳥苷發(fā)酵水平，因此肌苷酸鈉，鳥苷酸鈉可分別由肌苷和鳥苷經(jīng)經(jīng)化學(xué)磷酸化化學(xué)磷酸化方法合成，方法合成，ATP由由腺苷酯法腺苷酯法合成。合成。（一）（一）RNA化學(xué)水解法制備核苷化學(xué)水解法制備核苷? RNA 以以 甲甲 酰酰 胺胺 化化學(xué)水解，樹脂分離、學(xué)水解，樹脂分離、結(jié)晶，可制得結(jié)晶，可制得 4種種核苷。核苷。（二）發(fā)酵法生產(chǎn)核苷（二）發(fā)酵法生產(chǎn)核苷?發(fā)酵法生產(chǎn)核苷是近代發(fā)酵工程領(lǐng)域中的杰出成發(fā)酵法生產(chǎn)核苷是近代發(fā)酵工程領(lǐng)域中的杰出成果，產(chǎn)率高，周期短，控制容易，產(chǎn)量大。果，產(chǎn)率高，周期短，控制容易，產(chǎn)量大。?菌種菌種：枯草芽孢桿菌或短小芽孢桿菌變異株

22、，嘌：枯草芽孢桿菌或短小芽孢桿菌變異株，嘌呤核苷分解活性低，而嘌呤核苷酸酶活性高。呤核苷分解活性低，而嘌呤核苷酸酶活性高。? 枯草桿菌枯草桿菌的嘌呤核苷酸合成途徑。的嘌呤核苷酸合成途徑。（二）發(fā)酵法生產(chǎn)核苷（二）發(fā)酵法生產(chǎn)核苷ATP? 在右邊的合成途徑中，嘌呤在右邊的合成途徑中，嘌呤核苷酸生物合成的第一個酶核苷酸生物合成的第一個酶PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶轉(zhuǎn)酰胺酶受受AMP、ADP、以及腺嘌呤衍生物的、以及腺嘌呤衍生物的強(qiáng)烈抑制而受鳥嘌呤衍生物強(qiáng)烈抑制而受鳥嘌呤衍生物的抑制很弱。的抑制很弱。IMP脫氫酶脫氫酶受受最終產(chǎn)物最終產(chǎn)物GMP及鳥嘌呤衍生及鳥嘌呤衍生物反饋抑制，物反饋抑制，SAMP合成酶合成酶受

23、受AMP反饋抑制的。反饋抑制的。? 枯草桿菌的枯草桿菌的當(dāng)培養(yǎng)基中提供當(dāng)培養(yǎng)基中提供腺嘌呤腺嘌呤缺陷型，缺陷型，時就累積肌苷。時就累積肌苷。限量腺嘌呤限量腺嘌呤? 而枯草桿菌的而枯草桿菌的呤缺陷型，當(dāng)培養(yǎng)基中提供呤缺陷型，當(dāng)培養(yǎng)基中提供腺嘌呤、腺嘌呤、黃嘌黃嘌限量鳥嘌呤限量鳥嘌呤時就累積腺苷。時就累積腺苷。GTPADPGDPAMPGMPSAMP裂解酶AMPGMPGMP合脫氨還原成酶SAMSAMP酶酶IMPIMP脫合成酶氫酶XMPPAICARSAICARPRPPPRPP轉(zhuǎn)酰胺酶PRPP枯草桿菌的嘌呤核苷酸合成途徑1.發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷（發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷（I或或Iou）? 肌苷生產(chǎn)菌（肌苷生產(chǎn)菌（AJ1

24、1102）遺傳性狀：）遺傳性狀：? 腺嘌呤缺陷型（腺嘌呤缺陷型（A-）；）；? GMP還原酶缺失（還原酶缺失（GMPred-）；）；? 磺胺脒抗性（磺胺脒抗性（SGr）；）；? 精氨酸缺陷型（精氨酸缺陷型（Arg-）。）。? 選育出從遺傳上解除正常代謝控制的理想菌株。肌苷產(chǎn)率選育出從遺傳上解除正常代謝控制的理想菌株。肌苷產(chǎn)率達(dá)達(dá)20g/L.1.發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷（發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷（I或或Iou）? 工藝要點：工藝要點：? 保證培養(yǎng)基有保證培養(yǎng)基有充足充足N源源。? 短小芽孢桿菌受短小芽孢桿菌受PO43-的抑制。的抑制。? Mg2+、Ca2+對肌苷生產(chǎn)有促進(jìn)作用。對肌苷生產(chǎn)有促進(jìn)作用。? 提供的生長因

25、子腺嘌呤或酵母粉必須提供的生長因子腺嘌呤或酵母粉必須亞適量亞適量。? 發(fā)酵條件，發(fā)酵條件，3034，pH6.06.2，高溶氧，低分壓。，高溶氧，低分壓。2.發(fā)酵法生產(chǎn)鳥苷和黃苷（發(fā)酵法生產(chǎn)鳥苷和黃苷（G，X）? 鳥苷生產(chǎn)菌性狀鳥苷生產(chǎn)菌性狀：以肌苷產(chǎn)生菌為出發(fā)菌株，再增加德夸：以肌苷產(chǎn)生菌為出發(fā)菌株，再增加德夸菌素抗性，菌素抗性，解除解除GMP對酶對酶PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶轉(zhuǎn)酰胺酶、 IMP脫氫酶、GMP合成酶的反饋抑制的反饋抑制? 黃苷生產(chǎn)菌性狀與鳥苷產(chǎn)生菌株相類似，關(guān)鍵是要黃苷生產(chǎn)菌性狀與鳥苷產(chǎn)生菌株相類似，關(guān)鍵是要缺失缺失GMP合成酶合成酶。選育鳥嘌呤和腺嘌呤雙重缺陷型（。選育鳥嘌呤和腺嘌呤雙

26、重缺陷型（G 和和A），培養(yǎng)基中限量供給腺嘌呤、鳥嘌呤。），培養(yǎng)基中限量供給腺嘌呤、鳥嘌呤。-3.發(fā)酵法生產(chǎn)腺苷（發(fā)酵法生產(chǎn)腺苷（A或或Ado）? 腺苷產(chǎn)生菌遺傳性狀：腺苷產(chǎn)生菌遺傳性狀：? 腺嘌呤回復(fù)（腺嘌呤回復(fù)（A ）；）；+? 黃嘌呤缺陷（黃嘌呤缺陷（Xn）；）；? AMP脫氨酶缺失；脫氨酶缺失；? GMP還原酶還原酶(GMPred ) 缺失；缺失；-? 抗抗8雜氮黃嘌呤（雜氮黃嘌呤（8AXr）? 注意防止黃嘌呤缺陷型標(biāo)記的回復(fù)，保存期間斜面的反復(fù)注意防止黃嘌呤缺陷型標(biāo)記的回復(fù)，保存期間斜面的反復(fù)移植是黃嘌呤回復(fù)，腺苷產(chǎn)量下降的主要原因。移植是黃嘌呤回復(fù)，腺苷產(chǎn)量下降的主要原因。小結(jié)：小

27、結(jié)：? 以以產(chǎn)氨短桿菌產(chǎn)氨短桿菌為出發(fā)株，用為出發(fā)株，用發(fā)酵法發(fā)酵法直接產(chǎn)生直接產(chǎn)生AMP或或GMP是很困難的。因為其生物合成途徑經(jīng)是很困難的。因為其生物合成途徑經(jīng)IMP然后分成兩條直然后分成兩條直鏈途徑，最終合成鏈途徑，最終合成AMP和和GMP。? 而使用而使用枯草桿菌枯草桿菌為出發(fā)株，其合成途徑經(jīng)為出發(fā)株，其合成途徑經(jīng)IMP分成兩條環(huán)分成兩條環(huán)形途徑，只要阻塞某一代謝途徑，就能產(chǎn)生另一途徑相應(yīng)形途徑，只要阻塞某一代謝途徑，就能產(chǎn)生另一途徑相應(yīng)累積產(chǎn)物。累積產(chǎn)物。（一）疊氮胸苷（一）疊氮胸苷（AZT）? 商品名商品名：Refrovir，中文商品名齊多中文商品名齊多夫定。是第一種被美國夫定。是

28、第一種被美國FDA批準(zhǔn)用于批準(zhǔn)用于臨床的治療艾滋病臨床的治療艾滋病的新藥。的新藥。? 藥理作用藥理作用：在體內(nèi)經(jīng)磷酸化后生成疊：在體內(nèi)經(jīng)磷酸化后生成疊氮胸苷酸，取代了正常的胸嘧啶核苷氮胸苷酸，取代了正常的胸嘧啶核苷酸（酸（TMP）參與病毒）參與病毒DNA合成，而合成，而含含AZT成分的成分的DNA不能繼續(xù)復(fù)制，從不能繼續(xù)復(fù)制，從而阻止病毒增殖。而阻止病毒增殖。（三）三氮唑核苷（三）三氮唑核苷? 三氮唑核苷三氮唑核苷又名利巴韋林又名利巴韋林（ribavirin）,商品名病毒商品名病毒唑，為唑，為廣譜抗病毒藥物廣譜抗病毒藥物。? 經(jīng)經(jīng)X X光衍射解析，它的立光衍射解析，它的立體結(jié)構(gòu)與腺苷、鳥苷非常

29、體結(jié)構(gòu)與腺苷、鳥苷非常類似，在體內(nèi)被磷酸化成類似，在體內(nèi)被磷酸化成三氮唑核苷酸，抑制肌苷三氮唑核苷酸，抑制肌苷酸脫氫酶，阻斷鳥苷酸的酸脫氫酶，阻斷鳥苷酸的生物合成，從而抑制病毒生物合成，從而抑制病毒DNADNA合成。合成。（三）三氮唑核苷（三）三氮唑核苷? 三氮唑核苷三氮唑核苷 的另一特點是的另一特點是 對病毒作用點多對病毒作用點多 ，不易，不易使病毒產(chǎn)生抗藥性。適用于流感、副流感、腺病使病毒產(chǎn)生抗藥性。適用于流感、副流感、腺病毒肺炎、口腔和眼皰疹、小兒呼吸系統(tǒng)等疾病的毒肺炎、口腔和眼皰疹、小兒呼吸系統(tǒng)等疾病的治療。特別在臨床上經(jīng)艾滋病患者試用，能明顯治療。特別在臨床上經(jīng)艾滋病患者試用，能明顯

30、的改善患者癥狀，而且不良反應(yīng)比的改善患者癥狀，而且不良反應(yīng)比AZT小，藥物小，藥物價格與價格與AZT相差相差50倍倍.（三）三氮唑核苷（三）三氮唑核苷?酶合成法酶合成法?以各種核苷為底物，在嘌呤核苷磷酸化酶以各種核苷為底物，在嘌呤核苷磷酸化酶（Pynpase）催化下水解生成核糖）催化下水解生成核糖 -1-磷酸，再與磷酸，再與TCA反應(yīng)、直接生成三氮唑核苷反應(yīng)、直接生成三氮唑核苷（三）三氮唑核苷（三）三氮唑核苷?在兩步反應(yīng)中用同一種嘌呤核苷磷酸化酶，在兩步反應(yīng)中用同一種嘌呤核苷磷酸化酶，由于降解產(chǎn)物次黃嘌呤對酶比由于降解產(chǎn)物次黃嘌呤對酶比TCA具有更具有更大的親和性，致使次黃嘌呤再與核糖大的親和

31、性，致使次黃嘌呤再與核糖-1-磷磷酸縮合，可逆反應(yīng)促使總收率僅酸縮合，可逆反應(yīng)促使總收率僅20%左右，左右，這是采用菌種所產(chǎn)生的酶的局限性。為解這是采用菌種所產(chǎn)生的酶的局限性。為解決這一問題，設(shè)計了決這一問題，設(shè)計了2種直接生產(chǎn)的方法。種直接生產(chǎn)的方法。（三）三氮唑核苷（三）三氮唑核苷? 1采用前段與后段由兩個不同的酶催化，即前段使用采用前段與后段由兩個不同的酶催化，即前段使用嘧嘧啶核苷磷酸化酶啶核苷磷酸化酶（upase），后段使用），后段使用嘌呤核苷磷酸化酶嘌呤核苷磷酸化酶（Pynpase），而且已經(jīng)篩選到一株同時產(chǎn)生這兩種酶的），而且已經(jīng)篩選到一株同時產(chǎn)生這兩種酶的菌株，即產(chǎn)氣腸桿菌。菌株

32、，即產(chǎn)氣腸桿菌。? 以尿苷或胞苷為底物時，使用產(chǎn)氣腸桿菌，菌株經(jīng)以尿苷或胞苷為底物時，使用產(chǎn)氣腸桿菌，菌株經(jīng)24h24h培培養(yǎng)，經(jīng)收集菌體后在養(yǎng)，經(jīng)收集菌體后在6060反應(yīng)反應(yīng)96h96h，可獲得較高產(chǎn)率的三，可獲得較高產(chǎn)率的三氮唑核苷。氮唑核苷。產(chǎn)氣腸桿菌AJ11125由尿苷和胞苷生成三氮唑核苷（mmol/L） 核 苷 尿苷（100） 尿苷（200） 尿苷（300） 尿苷（100） 三氮唑核苷 61 103 110 62 （三）三氮唑核苷（三）三氮唑核苷? 2前段及后段反應(yīng)均利用嘌呤核苷磷酸化前段及后段反應(yīng)均利用嘌呤核苷磷酸化酶，但注意到使用的底物含有溶解度很小酶，但注意到使用的底物含有溶解

33、度很小的嘌呤堿基的核苷或者生成的降解產(chǎn)物在的嘌呤堿基的核苷或者生成的降解產(chǎn)物在后階段反應(yīng)時它對酶的親和力要比后階段反應(yīng)時它對酶的親和力要比 TCA低低得多。如使用鳥苷、肌苷、黃苷為底物。得多。如使用鳥苷、肌苷、黃苷為底物。最優(yōu)秀菌株是乙酰短桿菌最優(yōu)秀菌株是乙酰短桿菌AJ1442。（六）胞二磷膽堿（六）胞二磷膽堿? 1954年年Kennedy博士等人發(fā)現(xiàn)了博士等人發(fā)現(xiàn)了胞二磷膽堿胞二磷膽堿? 1957年年Rossiter研究發(fā)現(xiàn)，胞二磷膽堿與磷脂代研究發(fā)現(xiàn)，胞二磷膽堿與磷脂代謝十分密切，是卵磷脂生物合成的重要輔酶謝十分密切，是卵磷脂生物合成的重要輔酶? 1963年日本武田公司首次開發(fā)，用于治療意識障年日本武田公司首次開發(fā)，用于治療意識障礙獲得成功，商品名礙獲得成功，商品名 Nicholin，譯名，譯名尼可林尼可林。（六）胞二磷膽堿（六）胞二磷膽堿? 胞二磷膽堿的化學(xué)名稱為胞嘧啶核苷胞二磷膽堿的化學(xué)名稱為胞嘧啶核苷