蛋白酶酶活的測定方法福林法

1、蛋白酶酶活的測定方法(福林法)1.酶單位定義：1g固體酶粉(或1mL液體酶)，在一定溫度和pH值條件下，1min水解酪 素產(chǎn)生1ug酪氨酸為一個酶活力單位，以u /g (u/mL)表示。2.原理蛋白酶在一定溫度和pH值條件下，水解酪素底物，產(chǎn)生含有酚基的氨基酸 (如酪氨酸、 色氨酸等)，在堿性條件下，將福林試劑(Folin)復原，生成鉗藍和鴇藍，用分光光度法測 定，計算其酶活力。3試劑和溶液3.1福林試劑的準備于2000mL磨口回流裝置中加 入鴇酸鈉(Na2WO4.2H2O) 100g,鉗酸鈉(Na2MoO4.2H2。)25g,水700mL、85%磷酸50mL、濃鹽酸100mL,小火沸騰回流1

2、0h，取下回流冷卻器，在通風櫥中參加硫酸鋰(LiSO4 ) 50g,水50mL和 數(shù)滴濃漠水(99%),再微沸15min,以除去多余的漠(冷卻后仍有綠色需要再參加漠水， 再煮沸除去過量的漠)，冷卻，加水定容至1000mL,混勻，過濾。制得得試劑應呈金黃色， 貯存于棕色瓶內(nèi)。使用溶液：一份福林試劑與二份水混合，搖勻。3.2碳酸鈉溶液c (Na2CO3)=0.4mol/L稱取無水碳酸鈉(Na2CO3)42.4g，加水溶解并定容至1000mL。3.3三氯乙酸c (CCl3.COOH) =0.4mol/L稱取三氯乙酸65.4g,加水溶解并定容至1000mL。3.4氫氧化鈉溶液c (NaOH ) =0.

3、5mol/L按GB601配制。3.5鹽酸溶液c (HCl) =1mol/L及0.1 mol/L按GB601配制。3.6緩沖溶液a.磷酸緩沖液(pH=7.5pH=7.5 ),),適用于中性蛋白酶。稱取磷酸氫二鈉(NaNa2HPOHPO4.12H.12H2O)O) 6.02g6.02g和磷酸二氫鈉(NaHNaH2POPO4. . 2H2H2O)O) 0.5g,0.5g,加水 溶解并定容至1000mL1000mL。b.孚L酸緩沖液(pH=3.0),適用于酸性蛋白酶甲液 稱取乳酸(80%90%) 10.6g，加水溶解并定容至1000mL。乙液 稱取乳酸鈉(70%) 16g,加水溶解并定容至1000mL

4、。使用溶液 取甲液8mL,乙液1mL,混勻，稀釋一倍，即成0.05mol/l孚L酸緩沖溶液。c.硼酸緩沖溶液(pH=10.5),適用于堿性蛋白酶。甲液 稱取硼酸鈉(硼砂)19.08g,加水溶解并定容至1000mL。乙液 稱取氫氧化鈉4.0g，加水溶解并定容至1000mL。使用溶液取甲液500mL，乙液400mL，混勻，用水稀釋至1000mL。3.7 10g/l酪素溶液稱取酪素10.000g，精確至0.001g，用少量0.5mol/l氫氧化鈉溶液(假設酸性蛋白酶那么用 濃乳酸23滴濕潤后，參加適量得各種適宜pH值的緩沖溶液約80mL,在沸水浴中邊加 熱邊攪拌，直至完全溶解，冷卻后，轉(zhuǎn)入1000m

5、L容量瓶，用適宜的pH值的緩沖溶液稀釋 至刻度。此溶液在冰箱內(nèi)貯存，有效期為三天。3.8 100 g/mL L-酪氨酸標準溶液a.稱取預先于105C枯燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g,準確至0.0002g,用1 mol/L鹽酸60mL溶解后定容至100mL，即為1mg/mL酪氨酸標準溶液。b.吸取1mg/mL酪氨酸標準溶液10.00mL,用0.1mol/l鹽酸定容至100mL,即得100 g/mL L-酪氨酸標準溶液。4儀器和設備4.1恒溫水浴40C 0.2 Co4.2分光光度計應符合GB9721的規(guī)定。5分析步驟5.1標準曲線的繪制a. L-酪氨酸標準溶液：按表A3配制。表A32 P.呂虧

6、酪氨酸標準溶液的濃度g/mL取100 g/mL酪氨酸標準溶液的體積mL取水的體積mL000101101922028330374404655055b.分別取上述溶液各1.00mL須做平行試驗，各加0.4mol/l碳酸鈉溶液5.0mL ,福林試劑 使用液1.00mL，置于40C 0.2 C水浴中顯色20min,用分光光度計于波長680nm , 10mm比色皿，以不含酪氨酸的0管為空白，分別測定其吸光度，以吸光度A為縱坐標，酪氨酸的濃度C為橫坐標，繪制標準曲線曲線應通過零點。根據(jù)作圖或用回歸方程，計算出當吸光度為1時的酪氨酸的量g,既為吸光度常數(shù)K值。其K值應在95100范圍內(nèi)。5.2測定1待測酶液

7、的制備a.稱取酶粉12g,精確至0.0002g或取液體酶1.00mL,用少量該酶的緩沖液溶解，并 用玻璃棒攪拌搗研，將上清液小心傾入容量瓶中，沉渣局部再參加少量緩沖液，如此搗研34次，最后全部移入容量瓶中，用緩沖溶液定容至刻度，搖勻。通過四層紗布過濾，濾液 根據(jù)酶活力再用一次緩沖液稀釋至適當濃度，供測試用稀釋至被測試液吸光值在0.250.40范圍內(nèi)。b.酶粉測定時，稀釋倍數(shù)參考表4液體酶液可參照表4稀釋。表4酶活單位總倍數(shù)第一次稀釋第二次稀釋2萬20002g 200mL 100倍5mL 100mL 20倍3萬25002g 500mL 250倍5mL 50mL 10倍4萬40002g 200mL

8、 100倍5mL 200mL 40倍5萬50002g 500mL 250倍5mL 100mL 20倍8、10萬100002g 500mL 250倍5mL 200mL 40倍(2)測定a先將酪素溶液放入40C 0.2C恒溫水浴中，預熱5min。b按以下程序操作于660nm波長，用10mm比色皿測其吸光度c. 1.398和166蛋白酶，除反響與顯色溫度為30 0.2 C外，其他操作同5.2,標準曲線也作同樣處理。5.3計算X=A X K X 4/10 X n=2/5 X A X K X n式中，X一樣品的酶活力，u /g (u/mL );A一樣品平行試驗的平均吸光度；K一吸光常數(shù)(K=97.09實

9、驗室測定值)4反響試劑的總體積，mL ;10反響時間10min，以1min計；n一稀釋倍數(shù)5.4結(jié)果的允許差平行試驗相對誤差不得超過3%。需要準備的：基皮，面粉，水， 紗布，福林試劑，250ml三角瓶，每組10- 15支試管，分 光光度計，三氯乙酸， 磷酸緩沖液或水， 碳酸鈉溶液，酪素，已傳代好的試管斜面。最好能鏡檢一下真菌菌絲的形態(tài)。試管 A 空白加酶液 1.00ml40+0.2 C ,預熱 2min加三氯乙酸 2.00ml 搖勻40+0.2 C ,保溫 10min加酪素 1.00ml，搖勻取出靜置 10min，過濾取 1.00ml 濾液加碳酸鈉溶液 5.00ml加福林試劑使用液 1.00 ml40+0.2 C，顯色 20min試管 B酶試樣，需作三個平行