蛋白質(zhì)雙向電泳、western blot原理、方法、應(yīng)用

1、Presentation TitleYour company information 雙向電泳的實(shí)驗(yàn)原理第一向：等電聚焦第二向：SDSPAGE電泳第一向：等電聚焦 第二向：第二向：SDSPAGESDSPAGE電泳電泳 聚丙烯酰胺是由單體丙烯酰胺(Arc)和交聯(lián)劑N,N-甲叉丙烯酰胺(Bis)在加速劑N,N,N四甲基乙二胺（TEMED）和催化劑硫酸銨（AP）或核黃素的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為PAGE。樣品制備基本原則使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)（包括多數(shù)疏水性蛋白），制備方法應(yīng)具有可重現(xiàn)性。防止樣品在聚焦時(shí)發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。防止在樣品制備過程中發(fā)生

2、樣品抽提后的化學(xué)修飾（如酶性或化學(xué)性降解等）。完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。盡量去除起干擾作用的高豐度或無關(guān)蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測性。雙向電泳樣品的溶解 是成功進(jìn)行雙向電泳的最關(guān)鍵因素之一 溶解的目標(biāo)： 樣品中非共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和聚積體完全破壞，從而形成各個(gè)多肽的溶解液； 必須允許可能干擾2-DE分離的鹽、脂類、多糖和核酸等物質(zhì)的去除； 保證樣品在電泳過程中保持溶解狀態(tài)。 增加樣品溶解性的手段增加樣品溶解性的手段 離液劑（變性劑）：通過改變?nèi)芤褐械臍滏I結(jié)構(gòu)使蛋白質(zhì)充分伸展，將其疏水中心完全暴露，降低接近疏水殘基的能量域。典型代表是尿素和硫尿。 去垢劑（表面活性劑）：經(jīng)過離

3、液劑處理而暴露蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)后，還常需至少一種去垢劑來溶解疏水基團(tuán)。常用的去垢劑有離子去污劑SDS、非離子去污劑Triton X-100和NP-40、兩性離子去垢劑CHAPS、OBG等。其中CHAPS應(yīng)用最普遍。 還原劑：在離液劑和去垢劑聯(lián)用條件下，加用還原劑可使已變性的蛋白質(zhì)展開更完全，溶解更徹底。常用含自由巰基的DTT或-巰基乙醇，以及不帶電荷的三丁基膦（TBP）進(jìn)行還原。 起載體作用的兩性電解質(zhì)：即便在變性劑和表面活性劑存在的情況下，某些蛋白質(zhì)也需要在鹽離子的作用下才能保持其處于溶解狀態(tài)，否則這些蛋白質(zhì)在其處于PI點(diǎn)時(shí)會發(fā)生沉淀。 Carrier ampholytes的作用在于捕獲樣品

4、中的少量鹽分，從而保證蛋白質(zhì)的溶解性。應(yīng)用時(shí)，兩性電解質(zhì)的濃度應(yīng)小于0.2（w/v)。濃度過高會使IEF的速度降低。另外，為了保證實(shí)驗(yàn)的精確性，在選擇不同pH范圍的IPG膠條時(shí)，也應(yīng)使兩性電解質(zhì)的pH值與之相符合。聚焦時(shí)間的優(yōu)化 要獲得高質(zhì)量的圖譜以及很好的試驗(yàn)重復(fù)性，所需的最佳時(shí)間即為等電聚焦達(dá)到穩(wěn)定態(tài)所需的時(shí)間。 聚焦最佳時(shí)間由不同蛋白樣品、上樣量、pH范圍和膠條長度通過經(jīng)驗(yàn)來確定。 聚焦時(shí)間太短，會導(dǎo)致水平和垂直條紋的出現(xiàn)。 過度聚焦雖然不會導(dǎo)致蛋白質(zhì)向陰極漂移，但會因?yàn)榛钚运D(zhuǎn)運(yùn)而導(dǎo)致過多水在IPG膠表面滲出（電滲）而造成蛋白圖譜變性，在膠條堿性端產(chǎn)生水平條紋以及蛋白丟失。兩維間的平衡

5、 等電聚焦電泳結(jié)束后可馬上進(jìn)行第二向電泳，也可于80保存數(shù)月。 但在第二向電泳前一定要進(jìn)行膠條的平衡，以便于被分離的蛋白質(zhì)與SDS完整結(jié)合，從而使SDS-PAGE電泳能順利進(jìn)行。 建議方案：用含2%(m/v)SDS、1%(m/v)DTT、6mM尿素和30%甘油的50mM Tris（pH8.8）緩沖液先平衡15min，再用5%(m/v)碘乙酰胺取代DTT后的上述緩沖液平衡15min。如果用TBP代替DTT則只需一步平衡。 聚丙烯酰胺凝膠和轉(zhuǎn)印到膜上的蛋白質(zhì)的檢測理想顯色劑的7S安全（safety）：靈敏（sensitivity）：簡單（simplicity）：特異性（specificity）：快

6、速（speed）：穩(wěn)定（stability）：兼容性（synergy）：適用于質(zhì)譜的染色方法 考馬斯亮蘭（Bio-Safe Coomassie colloidal 250 stain） 銀染（Silver Stain Plus stain） 熒光染色（SYPRO Ruby protein gel stain）凝膠的圖像處理分析典型流程典型流程 凝膠圖像的掃描： 圖像加工： 斑點(diǎn)檢測和定量： 凝膠配比： 數(shù)據(jù)分析： 數(shù)據(jù)呈遞和解釋： 2-DE數(shù)據(jù)庫的建立：雙向電泳實(shí)驗(yàn)流程 樣品制備（Sample preparation） 固相預(yù)制膠條的水化（IPG strip rehydration） 第一向等

7、電聚焦（IEF） 膠條的平衡（IPG strip equilibration） 第二向SDS-PAGE電泳（SDS-PAGE electrophresis） 凝膠的染色及檢測（Detection/Staining） PDQuest軟件分析（Software analysis） 質(zhì)譜鑒定（Protein identification） 最高電壓10,000 V1025C 溫度控制7, 11, 17, 18, 和 24 cm的聚焦盤，可以各放12根膠條可以儲存10個(gè)程序，每個(gè)程序有10步程序可進(jìn)行時(shí)時(shí)編輯可供選配的打印機(jī)等電聚焦的操作 1. 取出IPG預(yù)制膠條（7cm pH 4-7），室溫平衡。

8、2. 在聚焦盤或水化盤中加入樣品（圖1）。 3. 去除預(yù)制IPG膠條上的保護(hù)層（圖2） 。 4. 將IPG膠條置于聚焦盤或水化盤中（圖3） 。 5. 在每根膠條上覆蓋1ml礦物油。 6. 對好正、負(fù)極，蓋上蓋子。 7. 設(shè)置等電聚焦程序。等電聚焦的操作 1. 取出IPG預(yù)制膠條（7cm pH 4-7），室溫平衡。 2. 在聚焦盤或水化盤中加入樣品（圖1）。 3. 去除預(yù)制IPG膠條上的保護(hù)層（圖2） 。 4. 將IPG膠條置于聚焦盤或水化盤中（圖3） 。 5. 在每根膠條上覆蓋1ml礦物油。 6. 對好正、負(fù)極，蓋上蓋子。 7. 設(shè)置等電聚焦程序。等電聚焦的操作 1. 取出IPG預(yù)制膠條（7c

9、m pH 4-7），室溫平衡。 2. 在聚焦盤或水化盤中加入樣品（圖1）。 3. 去除預(yù)制IPG膠條上的保護(hù)層（圖2） 。 4. 將IPG膠條置于聚焦盤或水化盤中（圖3） 。 5. 在每根膠條上覆蓋1ml礦物油。 6. 對好正、負(fù)極，蓋上蓋子。 7. 設(shè)置等電聚焦程序。等電聚焦的操作 1. 取出IPG預(yù)制膠條（7cm pH 4-7），室溫平衡。 2. 在聚焦盤或水化盤中加入樣品（圖1）。 3. 去除預(yù)制IPG膠條上的保護(hù)層（圖2） 。 4. 將IPG膠條置于聚焦盤或水化盤中（圖3） 。 5. 在每根膠條上覆蓋1ml礦物油。 6. 對好正、負(fù)極，蓋上蓋子。 7. 設(shè)置等電聚焦程序。膠條的平衡 冰

10、箱中取出的膠條，于室溫放置10分鐘。 配制膠條平衡緩沖液 I 。 吸去膠條上的礦物油及多余的樣品。 第一次平衡。振蕩15分鐘。 配制膠條平衡緩沖液 II 。 第二次平衡 ，振蕩15分鐘。 吸去玻璃板中液體。將玻璃板倒扣在桌面上。 瓊脂糖封膠液進(jìn)行加熱溶解。配制1電泳緩沖液。膠條的轉(zhuǎn)移 平衡結(jié)束后，先將IPG膠條完全浸末于1電泳緩沖液中，然后將膠條膠面朝上放在凝膠的長玻璃板上（圖4、圖5）。 將放有膠條的SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移到灌膠架上，在凝膠的上方加入低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液（圖-6）。 用鑷子、壓舌板或是平頭的針頭，輕輕地將膠條向下推，使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面完全接觸（圖-7）。 放置5分鐘，使

11、低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液徹底凝固。膠條的轉(zhuǎn)移 平衡結(jié)束后，先將IPG膠條完全浸末于1電泳緩沖液中，然后將膠條膠面朝上放在凝膠的長玻璃板上（圖4、圖5）。 將放有膠條的SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移到灌膠架上，在凝膠的上方加入低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液（圖-6）。 用鑷子、壓舌板或是平頭的針頭，輕輕地將膠條向下推，使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面完全接觸（圖-7）。 放置5分鐘，使低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液徹底凝固。膠條的轉(zhuǎn)移 平衡結(jié)束后，先將IPG膠條完全浸末于1電泳緩沖液中，然后將膠條膠面朝上放在凝膠的長玻璃板上（圖4、圖5）。 將放有膠條的SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移到灌膠架上，在凝膠的上方加入低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液（圖-6）。 用

12、鑷子、壓舌板或是平頭的針頭，輕輕地將膠條向下推，使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面完全接觸（圖-7）。 放置5分鐘，使低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液徹底凝固。膠條的轉(zhuǎn)移 平衡結(jié)束后，先將IPG膠條完全浸末于1電泳緩沖液中，然后將膠條膠面朝上放在凝膠的長玻璃板上（圖4、圖5）。 將放有膠條的SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移到灌膠架上，在凝膠的上方加入低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液（圖-6）。 用鑷子、壓舌板或是平頭的針頭，輕輕地將膠條向下推，使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面完全接觸（圖-7）。 放置5分鐘，使低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液徹底凝固。膠條的轉(zhuǎn)移 平衡結(jié)束后，先將IPG膠條完全浸末于1電泳緩沖液中，然后將膠條膠面朝上放在凝膠的長玻璃板上（圖4、

13、圖5）。 將放有膠條的SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移到灌膠架上，在凝膠的上方加入低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液（圖-6）。 用鑷子、壓舌板或是平頭的針頭，輕輕地將膠條向下推，使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面完全接觸（圖-7）。 放置5分鐘，使低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液徹底凝固。SDS-PAGE電泳 1. 在低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液完全凝固后。將凝膠轉(zhuǎn)移至電泳槽中。 2. 在電泳槽加入電泳緩沖液后，接通電源，起始時(shí)用的低電流（5mA/gel/7cm），待樣品在完全走出IPG膠條，濃縮成一條線后，再加大電流（15-20mA/gel/7cm），待溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到底部邊緣時(shí)即可停止電泳。 3. 電泳結(jié)束后，輕輕撬開兩層玻璃，取出凝膠，并切角

14、以作記號（戴手套，防止污染膠面）。 雙向電泳技術(shù)的應(yīng)用 雙向電泳技術(shù)在病原微生物致病機(jī)理研究中的應(yīng)用 雙向電泳技術(shù)在人類惡性腫瘤研究中的進(jìn)展 人們通過雙向電泳技術(shù)分離正常組織細(xì)胞與腫瘤之間的差異蛋白質(zhì)組分，在尋找腫瘤的特異標(biāo)志物、揭示腫瘤的發(fā)病機(jī)制以及開發(fā)新的腫瘤治療方式和治療藥物提供理論依據(jù)等方面都取得了一些重要的進(jìn)展。腫瘤發(fā)生的早期常常無任何癥狀，而只有在轉(zhuǎn)移時(shí)才容易被發(fā)現(xiàn)，這往往導(dǎo)致延誤了治療的最佳時(shí)期。因此找到腫瘤早期的標(biāo)志物進(jìn)行及時(shí)的診斷和治療顯得尤為重要。雙向電泳技術(shù)在藥物作用機(jī)制研究的進(jìn)展 雙向電泳技術(shù)的出現(xiàn)，為動態(tài)、高通量的研究藥物作用機(jī)制提供了強(qiáng)有力的方法支持。 雙向電泳技術(shù)

15、的另一應(yīng)用就是研究藥物的毒理作用。比較正常細(xì)胞與藥物處理后細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)豐度變化，可以提示藥物的毒性作用機(jī)制。細(xì)胞在施藥之后的代謝反應(yīng)做出實(shí)時(shí)的檢測，不僅能確定療效，也能針對毒性代謝物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)而對藥物進(jìn)行直接的改良，是一項(xiàng)意義深遠(yuǎn)的發(fā)現(xiàn)。Western blot原理方法及應(yīng)用定義 印跡法（blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測反應(yīng)來檢測樣品的一種方法。 Western Blot是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法。 1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNARNA雜交檢測特定的DNA片段的方法，稱為Sou

16、thern印跡法。 而后人們用類似的方法，對RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析，對RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法。什么是蛋白質(zhì)印跡法蛋白質(zhì)印跡法 ？ Westernblot法 是凝膠電泳技術(shù)、固定化技術(shù)及分子親和技術(shù)三者融為一體的綜合性技術(shù)，其核心在于把凝膠已分離的區(qū)帶并印跡于固化紙上，可分為電泳、轉(zhuǎn)印、酶免疫測定3個(gè)階段。Westernblot法 結(jié)合了電泳的高分辨率和酶免疫測定的高敏感性和特異性，是一種能用于分析樣本組分的免疫學(xué)測定的方法。Western Blot基本原理基本原理 Western BlotWestern Blo

17、t：采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物 是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。 經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。 蛋白樣品制備的注意事項(xiàng)：蛋白樣品制備的注意事項(xiàng)：煮沸5-15min，以充分變性蛋白，保證蛋白從空間結(jié)構(gòu)變?yōu)橐患壗Y(jié)構(gòu)（多聚體解散為單聚體，氧化狀態(tài)轉(zhuǎn)化為還原狀態(tài)等）。有的也可以在700C加熱5

18、-10min，尤其適用于多次跨膜蛋白的檢測（這些蛋白在煮沸狀態(tài)下容易聚集，而聚集狀態(tài)則會影響標(biāo)本進(jìn)入凝膠的效率。）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳原理原理： SDS 是一種離子性的界面活性劑,它有強(qiáng)離子性的硫酸根離子也帶有疏水性的長碳鏈.當(dāng) SDS 與蛋白質(zhì)混合時(shí),它會以其碳鏈與蛋白質(zhì)之疏水性胺基酸結(jié)合將蛋白質(zhì)包起來,而以硫酸根離子外露與水分子作用.大多數(shù)蛋白質(zhì)和 SDS 的平均結(jié)合量是 1:1.4 (以重量為單位),而蛋白質(zhì)和SDS結(jié)合后,由于 SDS 帶強(qiáng)負(fù)價(jià),使蛋白質(zhì)原先的帶電價(jià)微不足道,且每單位重量的蛋白質(zhì)帶電價(jià)一致 (charge density),所以決定不同蛋白的泳動速率就只剩下分子大小

19、一項(xiàng)因素凝膠成份凝膠成份M純凈水（ddH2O）M丙烯酰胺和N,N-亞甲雙丙烯酰胺 （Arc-Bis）MSDSMTris-HCLM四甲基乙二胺(TEMED)（催化硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的聚合）M過硫酸銨(APS)（提供引發(fā)丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合的自由基）聚偏二聚偏二氟乙烯膜氟乙烯膜膜的選擇轉(zhuǎn)膜半干法半干法（用恒流）將凝膠和固相基質(zhì)象三明治一樣加在用緩沖液濕潤濾紙之間，電轉(zhuǎn)1030min。濕法濕法將凝膠和固相基質(zhì)夾在濾紙中間，浸泡在轉(zhuǎn)移裝置的緩沖液中，電轉(zhuǎn)1h或過夜。 泡膜：泡膜： 轉(zhuǎn)膜之前將海綿、膠、膜都用預(yù)冷的轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)膜之前將海綿、膠、膜都用預(yù)冷的轉(zhuǎn)移bufferbuffe

20、r浸泡浸泡20min20min （1.1.凝膠凝膠若是沒在預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜若是沒在預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜bufferbuffer中浸泡，就會在轉(zhuǎn)膜過程中出現(xiàn)中浸泡，就會在轉(zhuǎn)膜過程中出現(xiàn)凝膠皺凝膠皺縮縮，導(dǎo)致出現(xiàn)，導(dǎo)致出現(xiàn)轉(zhuǎn)移條帶變形轉(zhuǎn)移條帶變形。2.PVDF2.PVDF膜具有疏水性，需用甲醇浸泡）膜具有疏水性，需用甲醇浸泡） 轉(zhuǎn)膜順序：轉(zhuǎn)膜順序： 陰極碳板陰極碳板( (黑黑)+)+海綿海綿+ +三濾三濾+ +膠膠+ +膜膜+ +三濾三濾+ +海綿海綿+ +陽極碳板（白）陽極碳板（白）轉(zhuǎn)膜條件：轉(zhuǎn)膜條件： 0.4A 250V 1h-90min 0.4A 250V 1h-90min 冰浴冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜 （

21、具體轉(zhuǎn)膜時(shí)間要根據(jù)目的蛋白的大小而定；目的蛋白的分子量越大，需要（具體轉(zhuǎn)膜時(shí)間要根據(jù)目的蛋白的大小而定；目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越長，反之則短。）的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越長，反之則短。） 避免直接用手碰雜交膜，使用鑷子。因?yàn)槭稚系牡鞍缀陀椭瑫绊戅D(zhuǎn)膜效率并會使膜臟掉。 夾好膜和凝膠后，確定在凝膠/膜和濾紙之間沒有氣泡存在，否則會導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜不完全。 剪膜 Western Blotting Western Blotting 操作流程操作流程一抗、二抗孵育 把硝酸纖維素濾膜放在密閉塑料盒中，根據(jù)濾膜面積以0.1ml/cm2的量加入一抗溶液與濾膜溫育（抗體濃度過高會導(dǎo)致背景較深，過低會導(dǎo)致和抗原結(jié)合不充分，出現(xiàn)假陰性 ）。室溫不少于7小時(shí)，4 時(shí)過夜。（一般） 回收一抗溶液，用TBST洗膜3次，每次5min（洗滌不充分會導(dǎo)致膜上非特異性條帶處仍有一抗殘留，會影響二抗結(jié)合的位置不準(zhǔn)確 ）。 加入二抗溶液，搖床上緩慢搖動， 室溫避光1.5-2h 回收二抗，TBST洗膜3次，每次5min，純凈水洗膜5min。 短時(shí)間多次洗膜較長時(shí)間少次洗膜更有效。Tween有助于去除非特異性的結(jié)合，減少背景。 Western Blotting Western Blotting