肺成纖維細(xì)胞分離

1、【摘要】目的：建立一套可靠的鼠肺細(xì)胞別離、純化和培養(yǎng)技術(shù)，用于體外研究間質(zhì)性肺病的發(fā)病機(jī)制及治療方法。方法：采用胰酶消化出生后2 d SD大鼠肺組織塊及 SD大鼠肺泡灌洗液，經(jīng)差時(shí)貼壁法，別離、純化紅皮鼠肺成纖維細(xì)胞(lung fibroblast, LF)和 SD大鼠肺泡巨噬細(xì)胞(pulmonary alveolar macrophage,AM ),并進(jìn)行原代培養(yǎng)。用波形蛋白(Vimentin)、 CD14 細(xì)胞免疫熒光染色、蛋白質(zhì)印跡和電鏡對(duì)所別離的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。結(jié)果：所得細(xì)胞產(chǎn)量大、純度高。細(xì)胞免疫熒光染色LF 細(xì)胞波形蛋白染色陽性而CD14染色陰性；AM 細(xì)胞那么相反。掃描電鏡觀察可見

2、肺成纖維細(xì)胞有微絨毛，細(xì)胞間連接成網(wǎng)狀，蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示波形蛋白表達(dá)。結(jié)論：該方法是一種可靠的紅皮鼠肺成纖維細(xì)胞及大鼠肺巨噬細(xì)胞的別離純化培養(yǎng)技術(shù)， 可用于間質(zhì)性肺病(interstitial lungdisease, ILD )的發(fā)病機(jī)制及治療方 法的體外研究?！娟P(guān)鍵詞】大鼠； 肺成纖維細(xì)胞；巨噬細(xì)胞；原代細(xì)胞培養(yǎng)基金工程江蘇省高校自然科學(xué)研究方案工程(03KJD320076 )；鎮(zhèn)江市社會(huì)開展科技計(jì)劃工程(SH2004043)Isolation and purification and primary culture of lung cells from ratsYAN Yu-lan,

3、LIU Yang, BU Xue-feng, ZHANG Zhi-jian, ZHENG Jin-xu(Department of Respiratory Medicine, the Affiliated People s Hospital of Jiangsu University, ZhenjiangJiangsu 212002; School of Medicine , Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212021,China)Abstract Objective: To develope a reliable method for isola

4、tion, purification and primary culture of lungfibroblast(LF) and pulmonary alveolar macrophage(AM) from rat for studies on pathogenesis and treatment ofinterstitial lung disease in vitro. Methods : The lung tissue of 2 days old immature rats was digested withtrypsin.LFs and AMs were isolated and pur

5、ified, then cultured. The nature of the cultures was identified by CD14staining,vimentin staining, electron micrography and Western blot.Results：Excellent yields ofhighly purified,culturable AMs and LFs could be obtained from adult rats and 2 day babyish rat lungs,respectively. TheexpressionofCD14 i

6、n AMs was positiveand that ofvimentin negativeby immunofluorescence chemistry. Those,however, in LFs were just opposite. Ramified stracture between purified LFs were observed by ultrastructuralexamination under electron micrography.Vimentin in purified LFs was revealed by Western blot. Conclusion :T

7、his technique might be a reliable method for isolation and purification and primary culture of pulmonaryalveolar macrophages and lung fibroblasts from rat lung and could be used for the study of interstitial lungdiseaseKey words lung fibroblasts; immature rat; pulmonary alveolar macrophage; primary

8、cell culture原代培養(yǎng)又稱初代培養(yǎng),是自供體取得組織細(xì)胞后在體外進(jìn)行的首次培養(yǎng)。原代培養(yǎng)的細(xì)胞來源于剛剛離體的組織和細(xì)胞，其生物學(xué)特性未發(fā)生很大變化,仍具有二倍體遺傳特征 最接近和反映體內(nèi)生長特性，對(duì)研究細(xì)胞的生長、分化、代謝及其生理、病理變化的機(jī)制具有極其重要的價(jià)值，還適宜行藥物干預(yù)、細(xì)胞分化等實(shí)驗(yàn)研究。但原代培養(yǎng)的組織由多種細(xì) 胞成分組成，別離、純化技術(shù)難度大，培養(yǎng)條件相對(duì)要求高。紅皮鼠即出生后23d鼠，肺組織主要由肺上皮細(xì)胞和肺成纖維細(xì)胞(lung fibro blast,LF)組成；肺泡灌洗液主要為肺泡巨噬細(xì)胞(alveolar macrophage,AM),因此紅皮鼠肺成纖

9、維細(xì)胞及成鼠肺泡巨噬細(xì)胞的別離、純化和原代培養(yǎng)對(duì)體外研究間質(zhì)性肺部疾病至關(guān)重要。本研究參照姜明等1 的方法，成功地別離、純化并培養(yǎng)出了鼠肺泡巨噬細(xì)胞和肺成纖維細(xì)胞。1材料與方法1.1材料新生 2d SD紅皮鼠； DMEM 培養(yǎng)液(低糖型， Gibco,美國),胎牛血清(Gibco,美國)， 胰 蛋白酶(Gibco，美國);培養(yǎng)瓶、24孔培養(yǎng)板及圓玻片(購于 Nuclon公司)。1.2方法1.2.1培養(yǎng)液的配制 配制 DMEM，再參加終濃度 100 ml/L 胎牛血清(FCS)和 100 U/ml 青霉素、100 g/ml 鏈霉素；用 PBS 配制成 0.1%胰蛋白酶，再參加終濃度 0.02%E

10、DTA， 過濾除菌。1.2.2 取材 將新生 2 d 的 SD紅皮鼠，用 75%乙醇浸泡消毒 5 min，窒息處死，剪開胸 腔，取出肺組織浸泡于 PBS中備用；SD大鼠(250 g)腹腔內(nèi)注射 3%戊巴比妥 0.20.3 ml /100g 麻醉，氣管切開，置入直徑2 mm的塑料管，用 4 C 生理鹽水 5 ml 進(jìn)行灌洗，每次抽洗 3次，共 6 次灌洗，1 500 r/min 4 C離心 10 min,棄上清，沉淀置 10%FCS DMEM 培養(yǎng)液中。1.2.3 原代培養(yǎng)將取出的肺組織用 PBS沖洗以洗去血液。用組織剪去除其外表的胸膜，修剪其周邊，PBS輕輕混懸，待組織塊自然沉降后吸棄上清，重

11、復(fù) 34次至上清清亮，后剪成 1mm x 1mm x 1mm 大小的組織塊，用 0.1%胰酶(37C預(yù)溫)將組織塊洗 1遍，按照每 只幼鼠 1ml參加 0.1%胰酶，37C 消化 1520 min，大局部組織塊被消化為細(xì)胞懸液，參加與消化液等量的含 10%FCS 的 DMEM 終止消化，用吸管充分吹打均勻，1 500 r/min離心 5 min， 棄除上清，較均勻地接種在 50ml 玻璃培養(yǎng)瓶上，輕輕地參加上述 DMEM 培養(yǎng)液約 0.5ml，在 37C 含 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜后，次日參加 2 ml 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；將上述 SD大鼠的肺 泡灌洗液沉淀接種在 50 ml玻璃培養(yǎng)瓶中，采用差

12、時(shí)貼壁法，即先在 37C 含 5% CO2 培養(yǎng)箱 培養(yǎng) 2.53 h，PBS洗滌未貼壁細(xì)胞，加 37C 2.5 g/L胰蛋白酶消化 10 min,調(diào)整細(xì)胞濃度為 (1.52.0) X 106/ml，然后移入帶圓玻片 24孔培養(yǎng)板上繼續(xù)培養(yǎng)。1.2.4 傳代培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的原代細(xì)胞培養(yǎng)57 d后，細(xì)胞集合成單層。用 PBS洗 2遍后加 2.5 g/L37C胰蛋白酶消化 2 min?？梢娂?xì)胞連接松弛，此時(shí)參加等體積的含血清培養(yǎng)液 終止消化，吸管輕輕吹打使細(xì)胞脫落并混勻。1 000 r/min，離心 6 min。棄上清，參加 2 ml 新的培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻，顯微鏡下計(jì)數(shù)，以(23) X 107

13、/L接種到 25 ml 塑料瓶中，37C，5%CO2 孵箱培養(yǎng)，每 34天換液 1 次，如細(xì)胞純度不夠，可采用差時(shí)貼壁法，LF 貼壁速度快，僅需 20min左右，首先吸附在瓶壁上，經(jīng)過 23 次貼壁選擇后，貼附的是純的 LF，然后將第 3 代在帶圓玻片的 24孔培養(yǎng)板上進(jìn)行培養(yǎng)，復(fù)孔 3個(gè)。1.2.5 免疫熒光鑒定倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況。取生長狀態(tài)良好的第3 代細(xì)胞，棄培養(yǎng)液， 加 4%低聚甲醛固定至少 6h,然后用 TBS 洗滌 3遍， 每次 5min,每孔內(nèi)加 0.4%tritonX-100+3%牛血清白蛋白 400 l 0.51 h37C,在相應(yīng)培養(yǎng)孔內(nèi)按 1 ： 200 分別參加波

14、形 蛋白一抗 300 l 及 CD14一抗在 4C孵育 24 h,用 TBS 洗滌 3遍，然后按 1 ： 300分別加抗 兔-CY3 和 FITC二抗 300 l,室溫下孵育45 min,熒光顯微鏡觀察染色滿意，用 TBS 洗 滌 3 遍。LEICA 熒光顯微鏡觀察染色滿意，TBS洗滌3遍。按 1 ： 10 000加核熒光抗體進(jìn)行核標(biāo)記，然后照相。肺巨噬細(xì)胞于培養(yǎng)孔中培養(yǎng)24 h 后棄培養(yǎng)液，加 4%低聚甲醛固定至少6 h后，TBS 洗滌 3遍，每次 5 min，然后同上法進(jìn)行免疫熒光鑒定，二抗為抗兔 FITC。1.2.6 成纖維細(xì)胞蛋白質(zhì)印跡法鑒定1蛋白提?。喝∩L狀態(tài)良好的第 3代細(xì)胞，在

15、 50ml 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)到 106 個(gè)細(xì)胞， 棄培養(yǎng)液， 參加 PBS液 1 ml 后刮細(xì)胞入 EP 管， 離 心， 參加 CER-A ,Vortex,CER-B等進(jìn)行蛋白提取。AM 細(xì)胞作為對(duì)照。2蛋白樣品別離： 8%SDS-PAGE,每泳道上樣蛋白量為 20g,以 80 V/30 min積層，120 V/100 min別離蛋白樣品。3電轉(zhuǎn)膜：4 C, 90 mA 恒流轉(zhuǎn)膜過夜。結(jié)束后，取出 PVDF 膜置 3%BSA室溫封閉 1 h。4蛋白免疫印跡：將膜以兔抗 -波形蛋白抗體1 : 100, RT 孵育 2 h,用 TBS/T 含 有 0.1% Tween220的TBS漂洗 3 次，參加

16、HRP 標(biāo)記的血清抗兔 IgG 1 : 10 000 稀釋,RT 孵 育 1 h,以 TBS/T漂洗 3 次后，用 ECL 發(fā)光試劑顯示陽性條帶，以 X光膠片記錄結(jié)果。膠片 上的條帶用 GeneSnap/GeneTool 軟件分析。1.2.7 成纖維細(xì)胞掃描電鏡法鑒定取生長狀態(tài)良好的第 3 代細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，加 2.5%的戊二醛固定至少 24 h,后 Hitachi S-3000N 掃描電鏡鑒定。2結(jié)果2.1細(xì)胞形態(tài)原代肺成纖維細(xì)胞培養(yǎng) 57 d 即有新生細(xì)胞長出，為成纖維細(xì)胞型，貼壁生長。初時(shí) 細(xì)胞形態(tài)多樣化，但多為類圓形，帶有粗大突起圖 1a，別離純化 3 d 后變?yōu)殚L梭形、條索狀，融合成

17、片圖 1b,第 7天時(shí)彼此連接成網(wǎng)狀，分界較為模糊圖 1c;肺巨噬細(xì)胞形態(tài)不規(guī)那么，可見偽足圖 2。2.2免疫熒光鑒定肺成纖維細(xì)胞免疫熒光染色，波形蛋白染色陽性而CD14染色陰性；而 SD大鼠肺巨噬細(xì)胞的免疫熒光染色結(jié)果那么相反： CD14染色陽性，波形蛋白染色陰性圖 3-6。2.3成纖維細(xì)胞蛋白質(zhì)印跡法鑒定肺組織塊純化、 培養(yǎng) 3 代生長良好的成纖維細(xì)胞蛋白提取后行蛋白質(zhì)印跡法測定波形蛋 白的表達(dá)，顯示波形蛋白較強(qiáng)表達(dá)，而肺巨噬細(xì)胞波形蛋白無表達(dá)圖7。圖 7 蛋白質(zhì)印跡肺成纖維細(xì)胞波形蛋白表達(dá)陽性，肺泡巨噬細(xì)胞波形蛋白不表達(dá)略Fig 7 Lung Fibroblast cells expre

18、ss strongly vimetinidentified by Western blotting at P3Alveolar macrophage cells express negtively2.4成纖維細(xì)胞掃描電鏡鑒定生長狀態(tài)良好的第3 代成纖維細(xì)胞掃描電鏡下呈長梭形，并分泌膠原纖維等細(xì)胞基質(zhì)圖 8。圖 8 培養(yǎng)后的第 3 代肺成纖維細(xì)胞掃描電鏡 X13 000 略Fig 8 Lung fibroblast cells at p3scanningelectron microscope x 13 0003 討論成纖維細(xì)胞是結(jié)締組織中最常見的細(xì)胞，由胚胎時(shí)期的間充質(zhì)細(xì)胞分化而來，細(xì)胞形態(tài)多樣

19、，常見的有梭形、大多角形和扁平星形等，成纖維細(xì)胞及其細(xì)胞核均呈不規(guī)那么的橢圓形或長方形，可合成和分泌膠原纖維、彈性纖維、網(wǎng)狀纖維及有機(jī)基質(zhì)。成纖維細(xì)胞均單獨(dú)存在，細(xì)胞之間有眾多的膠原纖維相隔3。原代培養(yǎng)可用酶消化法或組織塊法，其中組織塊法操作簡便、條件易于控制。采用組織塊法那么大約在接種后23 天到 1 周左右，在接種的皮膚組織塊周圍長出細(xì)胞4。本實(shí)驗(yàn)用差時(shí)貼壁肺泡灌洗液及肺組織塊法進(jìn)行別離肺泡巨噬細(xì)胞和肺成纖維細(xì)胞。肺間質(zhì)細(xì)胞那么以 LF 為主，但由于從老年個(gè)體取得的成纖維細(xì)胞的壽命要比取自年輕者 短，祝華平等2選擇 1920 d胎鼠別離純化肺成纖維細(xì)胞 ，細(xì)胞產(chǎn)量較大。本實(shí)驗(yàn)采用 2 d

20、SD大鼠肺組織塊法及胰酶消化法， 少量培養(yǎng)液條件下促使成纖維細(xì)胞更易貼壁，培養(yǎng) 57d后可行差時(shí)貼壁法進(jìn)一步純化，該法具有成纖維細(xì)胞產(chǎn)量大、純度高且操作簡便的優(yōu)點(diǎn)。波形蛋白是中間纖維蛋白的一種，存在于間質(zhì)來源細(xì)胞如成纖維細(xì)胞中，相對(duì)分子質(zhì)量約 53kd,波形蛋白一端與核膜相連，另一端與細(xì)胞外表處的橋?；虬霕蛄Ｏ噙B，波形蛋白 絲主要在核周形成網(wǎng)架，對(duì)核起機(jī)械性支持作用，并穩(wěn)定其在細(xì)胞內(nèi)的位置。 本實(shí)驗(yàn)采用熒光 免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測波形蛋白的表達(dá)，肺成纖維細(xì)胞波形蛋白呈陽性反響，即胞質(zhì)內(nèi)圍繞細(xì)胞呈紅色絲狀網(wǎng)絡(luò)形態(tài)，陽性率在95%以上圖 5-6,且細(xì)胞之間有眾多的膠原纖維相隔；蛋白質(zhì)印跡亦顯示成纖維細(xì)胞有波形蛋白高表達(dá)。體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞， 其生命期限與物種等因素有關(guān)。而小鼠成纖維細(xì)胞多數(shù)只能生長 8 代左右。由于在細(xì)胞傳代和進(jìn)行體外培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞的生物學(xué)特性會(huì)逐漸發(fā)生一些不同于體內(nèi)的改變，故通常只將前10代視為正常細(xì)胞，可在此時(shí)將生長旺盛的成纖維細(xì)胞凍存起來，以備將來復(fù)蘇使用。間質(zhì)性肺病發(fā)病率較高，發(fā)病機(jī)制尚不太清楚，臨床療效欠佳，但研究說明肺泡