DNA提取方法和試劑作用匯總

1、1試劑的作用氯仿的作用？氯仿：克服酚的缺點；加速有機相與液相分層。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的跡量酚。(酚易溶于氯仿中)用酚-氯仿抽提細胞基因組DNA時，通常要在酚-氯仿中加少許異戊醇，為什么?異戊醇：減少蛋白質變性操作過程中產生的氣泡。異戊醇可以降低表面張力 ，從 而減少氣泡產生。另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含 DNA的水相、中 間的變性蛋白相及下層有機溶劑相維持穩(wěn)定。用乙醇沉淀DNA時，為什么加入單價的 陽離子？用乙醇沉淀DNA時，通常要在溶液中加入單價的陽離子，如 NaCl或 NaAc, Na+中和DNA分子上的負電荷，減少 DNA分子之間的同性電荷相斥力， 而易于聚集沉淀

2、。2 DNA提取分為三個基本步驟每個步驟的具體方法可根據(jù)樣品種類、影響提取的物質以及后續(xù)步驟的不同而有區(qū)別。.細胞的破碎細菌有堅硬的細胞壁，首先要破碎經胞。方法有三種 ；機械方法：超聲波處理 法、研磨法、勻漿法：化學試劑法：用SDS處理細胞；酶解法：加入溶菌酶或 蝸牛酶，都可使細胞壁破碎。利用研磨或者超聲破碎細胞，并通過加入去污劑以除掉膜脂。加入蛋白酶，醋酸鹽沉淀，或者酚/氯仿抽提，以除掉細胞內 的蛋白，如與DNA 結合的組蛋白。 將DNA在冷乙醇或異丙醇中沉淀，因為 DNA在醇中不可溶而 黏在一起，這一步也能除掉鹽分。另外，目前也有利用吸附過柱的方法提取DNA的商業(yè)化試劑盒。DNA提取的幾種

3、方法(1).濃鹽法A.利用RNA和DNA在電解溶液中溶解度不 同，將二者分離，常用 的方法是用1M 氯納抽提彳馬到的DNA粘液與含有少量蛋白質氯仿一起搖蕩，使乳化,再離心除去 蛋白質，此時蛋白質凝膠停留在水相及氯仿相中間，而 DNA位于上層水相中，用2倍 體積95%乙醇可將DNA鈉鹽沉淀出來.B.也可用0.15 MNaCL液反復洗滌細月fi破碎液除去 RNA再以IMNaCL提取脫氧 核糖蛋白，再按氯仿-異醇法除去蛋白.兩種方法比較，后種方法使核酸降解可能少一些.C以稀鹽酸溶液提取DNA時，加入適量去污劑，如SDS可有助于蛋白質與DNA的 分離。在提取過程中為抑制組織中的 DNase對DNA的降

4、解作用，在氯化鈉溶液 中加入檸檬酸鈉作為金屬離子的烙合劑.通常用.15MNaCL,0.015M檸檬鈉，并稱 SSC§液，提取DNA. (2) .陰離子去污劑法；用SDS或二甲苯酸鈉等去污劑使蛋 白質變性,可以直接從生物材料中提取DNA.由于細胞中DNA與蛋白質之間常借 靜電引力或配位鍵結合，因為陰離子去污劑能夠破壞這種價鍵，所以常用陰離子去 污劑提取DNA(3) .苯酚抽提法：苯酚作為蛋白變性劑，同時抑制了 DNase的降解作用.用苯酚 處理勻漿液時，由于蛋白與DNA聯(lián)結鍵已斷，蛋白分子表面又含有很多 極性基團 與 苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而 DNA溶于水相。離心分層后取出水

5、層， 多次重復操作，再合并含DNA的水相，利用核酸不溶于醇的性質，用乙醇沉淀 DNA。此時DNA是十分粘稠的物質，可用玻璃漫漫繞成一團，取出。此法的 特 點是使提取的DNA保持天然狀態(tài)(4) .水抽提法：利用核酸溶解于水的性質，將組織細胞破碎后，用低鹽溶液除去 RNA,然后將沉淀溶于水中，使 DNA充分溶解于水中，離心后收集上清液.在上清 中加入固體氯化鈉調節(jié)至2.6M.加入2倍體積95%乙醇，立即用攪法攪出.然后 分別用66% , 80%?口 95%乙醇以及丙銅洗滌，最后在空氣中干燥，既得DNA樣品. 此法提取的DNA中蛋白質含量較高，故一般不用.為除蛋白可將此法加以改良，在 提取過程中加入

6、SDS.1.動物來源的DNA的提取1. 1經典提取方法酚抽提法、異丙醇沉淀法以及甲酬:胺裂解法是提取DNA最為經典的方法，目前很多 方法的改進都是在這些方 法的基礎上進行的，這三種方法均利用蛋白酶K和十二烷基硫 酸鈉(SDS)消化破碎細胞。在前兩種方法中裂解?先用酚/氯仿去除蛋白質，再分別用乙醇或異 丙醇沉淀DNA。甲酬:胺法是利用高濃度的甲 酬:胺解聚蛋白質與 DNA的結合，然后利用透 析來處理DNA樣品。這些經典方法獲得的 DNA純度很高，能夠滿足各種試驗的要求，但 操作繁瑣，用時長， 且所用試劑具有一定的毒性。1.2 玻璃棒纏繞法該法用鹽酸肌裂解細胞，然后將細胞裂解物小心鋪在離心管中的乙

7、醇上，用一 個帶鉤的或前端為U形的玻璃棒在這兩層液體的交界面慢慢攪動，沉淀出的膠狀 DNA纏繞在玻璃棒上。玻璃棒上的 DNA經多次乙醇浸泡并于室溫下 蒸干乙醇，由膠狀逐漸回縮，然 后浸人 TE中過夜，使其重新吸水膨脹進而和玻璃棒分離。這種方法對操作技術要 求較高，但 簡單快速。1.3 血細胞DNA的快速提取法采用 非離子變性劑NP40(乙基苯基聚乙二醇)代替SDS裂解細胞，提取細胞核，然后用酚/氯仿抽提DNA。這樣從血液中分離獲得的DNA純度高，能夠滿足各種臨床 檢驗和實驗的 需要。也可采用 NP40和Tween -20同時作用破碎細胞膜，以 避免SDS對以后 步驟的負 面作 用。Ba sun

8、 i等'采用了 4種常用的從血液 中提取DNA的方法:High Pure Viral Nucleic 試劑盒法、QlAamp試劑盒法、Tri- PureTM試劑分離提取法以及經典酚抽提法，對通常作拋棄處理的血凝塊進行人DNA及病毒DNA的抽提，發(fā)現(xiàn)前兩種方法可以迅速高效獲得目的DNA,從而建立了由血凝塊中提 取DNA的方法，擴大了臨床 檢驗樣本的來源。1.4 玻璃顆粒吸附法在該法中首先利用含異硫鼠酸肌的細胞裂解液裂解細胞，然后加人含有能夠與 DNA結合的玻璃顆粒的緩沖 液，經沉淀收集結合染色體DNA的玻璃顆粒，利用洗脫液進行洗脫獲彳導DNA。不僅玻璃顆?？梢耘c DNA進行結合，一定大小

9、的硅膠顆粒也可以與DNA進 行結合，據(jù)此，不少 實驗工作者實踐了很多利用顆粒結合DNA的提取方法。Pichler等2在從抹香鯨(Physeter macrocephalus) 牙齒及骨骼中抽提 DNA時采用了一種以二氧 化硅為吸附介質的方 法，從抹香鯨標本骨骼組織中鉆取的少量粉末中獲得了足夠用于分析的DNA產物，此方法 擴大了對稀有哺乳動物 DNA研究的取材范圍。Caldarelli-stefano 等3在從福爾馬林固定、石蠟包埋的人體組織標本中提取 DNA時利用小磁珠作為結合核，也獲得了理想的純化 DNA。很多試劑公司也依 此設計生產了許多顆粒提取試劑盒，Pinto等4就探討了采用 Gibc

10、。公司的GlassMAX系統(tǒng)，對福爾馬林固定 的組織進行DNA提取 的具體操作 方法，目前這些試劑盒在臨床上廣為應用，省時省 力。1.5 三乙醇胺月桂基硫酸鹽 (TLS)法由于常規(guī)方法中使用的蛋白酶 K的水解條件不好掌握，采用 TLS來提取組織、細胞以 及外周血DNA可以克服這一弊端。 TLS是一種較強的表面活性劑，將其直接作用于細胞 或組織勻漿，可迅速 溶解細胞膜、核膜，而且蛋白質與其結合后即失去對 DNA的結合，進一步的純化可采用常規(guī)方法。1.6 臨床病理標本的DNA提取方法由于PC R技術不僅可用于基因分離、核酸序列分析 ，還可用于突變體和重組體的構建、基因表達調控研究、基因病的診斷及腫

11、瘤發(fā)生機理的探討等。近年來，PCR技術已廣泛應用于病理學研究，尤其對福爾馬林固定石蠟包埋病理標本進行相關的研究更成為關注的焦點。對于從這些病理 標本中提取 DNA的方法研究也很多。一般采用酚/氯仿抽提法，該法雖然效率較高，但費 時費力，而且其操作中要求多次離心，增加了樣品污染的可能性。近 年來很多高效靈敏的 方法在實踐中得以采用，這些方法通常采用加熱或微波法s去除包 埋的石蠟，使用Sephadex G- 5。柱色譜或鹽析法s7等去除蛋白質。高文濤71等在研究 福爾馬 林固定石蠟包 埋組織DNA提取方法對PCR的影響時，發(fā)現(xiàn)在組織切片中加人鰲合 樹脂（Chelating Resin ,亞氨基二乙

12、酸）提取獲得的 DNA可取得較好的PCR擴增結果。Coombs等s則采用熱循環(huán)方法，將標本上的蠟融人樣品溶液，在酶的作用下進行裂解，然后用Chelex-100進行吸附，離心去蠟，這種 方法安全、簡便、有效、經濟。1.7 鹽析法該法用飽和氯化鈉代替有機溶劑去除蛋白質，所獲得的 DNA質量可以滿足PCR模板的要求，但產率相對 較低，純度較差。譚建明等 9對上述鹽析法進行了改進，即將處理過 的樣本加人SDS和蛋白酶K后，在56'C消化1h,然后用飽和氯化鈉沉淀蛋白質，并經離心除去，上清直接 用乙醇沉淀DNA。該法簡化了 DNA的抽提步驟，可用于人體各 種樣 本DNA的提取，所獲DNA的純度可

13、以滿足各種檢測的需要。2植物來源的DNA提取利用基因工程手段對植物進行定向改造，已成為當今植物育種學發(fā)展的一個新領域，植 物基因工程操作離不 開植物基因組總 DNA的制備，不同植物的核酸結合蛋白的情況各不相同,因而要采取不 同的提取方法10。由于植物中次生代謝 產物一多酚類化合物可介導 DNA降 解，而多糖的 污染也是影響植物 DNA純度最常見的問題，這些多糖能抑制限制酶、連接酶及DNA聚合酶等酶類的生物活性。因此要 從富含多酚和多糖的植物組織中分離獲得高質量的基因組DNA也并非易事11l。目前采用 的方法有以下幾種。2.1十六烷基三乙基澳化按 （CTAB）法CTAB是一種陽離子去污劑，它能與

14、核酸形成復合物，這些復合物在低鹽溶液中會因溶解度的降低而沉淀，而在高鹽溶液中可解離，從而使 DNA和多糖分開，再用乙醇沉淀DNA而除去CTAB。在該法中使用的聚維酮 （PVP）與多酚結合形成復合物，從而可有效 避免多酚類化合物介 導的DNA降解121。王卓偉等13在對桑葉DNA提取方法研究過程中發(fā)現(xiàn)PVI還能有效地去除多糖。羅志勇等 14在研究中對這種方法進行了幾點改進：提高CTAB的濃度：對于含多酚類較多的植物，增加 CTAB提取緩沖液中琉基乙醇的 含量，同時加人PVP使其與多酚類物質Z合形成復合物：增加低鹽沉淀緩沖液的量;增加高鹽溶液中鹽的濃 度。用改進的方法從人參、西洋參、三七等藥用植物

15、中分離獲得了高純度的DNA, Porebski等1s在沉淀粗提 DNA時，將提取緩沖液中氯化鈉的濃度提高至2.5 m o卜L-'以使DNA在高鹽緩沖條件下優(yōu)先沉淀，可更有效地除去多糖。Stein等16對傳統(tǒng)的CTAB法進行了優(yōu)化，創(chuàng)建了一種從新鮮草本植物樣本中提取DNA的方法。首 先在特制的有96個孔的托盤上種植植物樣本，并依照不同樣本在托盤中的位置進行編號，然后取適量植物葉子 分裝在充滿提取液的塑料袋中，除去袋中的空氣并封口，再用特制的手工勻化器將各袋中 的樣本混勻，56'C孵育1h后將袋中的液體取出進行離心以及 DNA的 沉淀。Xin等17則采用簡易的96孔托盤作為提取時的

16、容器，將多種植物樣本經研磨處理后分別放在不同的孔中進行提取，在一天內由一人就可完成上千個樣本的 DNA提取，為高通量植物基因分析及篩選提供了極大的便利。2.6 SDS 法為了避免CTAB法試驗步驟多、操作繁瑣的不足之處，近年來又提出了利用 SDSTris-Cl- EDTA等直接裂解細胞使其釋放出 DNA的方法。在該法后續(xù)的 DNA純化過程中通常 采用酚/氯仿處理，但對于植物 DNA純化不是一個很好的選擇，因為酚的使用可降低 DNA 的提取效率和純度。在用該法提取DNA的過程中采用較大的離心力和較長的離心時間，然后用氯仿一異戊醇代替酚來去除變性蛋白質，從而克服了由于酚的摻人及殘留對以后酶切帶來的

17、困難。用琉基乙醇代替SDS,對大豆DNA分離提取能夠更有效地 去除蛋白質， 而且可以有效防止褐 變，獲得天然雙鏈高分子量的DNA產物，并且減少了 SDS對 PCR、隨機擴增多態(tài)性 DNA技術(Random amplified polymorphic DNA, RAPD)等操作的 影響。在對辣椒DNA進行提取時為了提高 DNA的產率將待提取的植物材料首先在液氮中研磨成粉末，并且針 對辣椒葉子中多酚類物質極少的特點將其中的加人PVP的步驟省去，消除了 PVP對以后操作的影響.2.7 氯化千法在對稱猴桃的基因組DNA提取過程中選用了氯化節(jié)法，與其他方法相比該法的得率較高，其原 因可能是氯化節(jié)不僅可與

18、植物細胞壁上的多糖經基反應生成醍，而且與細胞液中多糖物質 的All基反應，起到破壞糖鏈的作用，利于 DNA的釋放和提純。2.8 高鹽低pH法該法中 所用的提純試劑僅為無機鹽和異丙醇。通常采用的無機鹽為醋酸鉀，低pH的醋 酸鉀是有效的蛋白質 沉淀劑。與一般氯仿一異丙醇反復抽提去 除蛋白質的操作相比該法操 作更方便省時，所需 樣品量少，適用于瀕危植物DNA的提取。2.9 果膠酶法Ste ve n等2s采用果膠酶對植物細胞破 碎后的抽提混合物進行 消化處理使與 DNA共沉 淀的膠狀物質分解成 小的片段，從而無法與 DNA 一起沉淀下來，降低了 DNA的純化難度， 提高純化效率。3微生物來源DNA的提

19、取常規(guī)的微生物DNA提取多是根據(jù)某種微生物的 具體特點選擇合適的方法。在實際的科學研究過程中，很多 科學工作者通過實踐總結出許多快速實用的提取方法，現(xiàn)擇其中比較典型的加以總結。3.1 細菌質粒的提取方法質粒是獨立于細菌染色體 DNA之外的環(huán)狀DNA,它能攜帶外源基因進人細 菌 進行擴增，或表達外源基因，是基因工程中常用的載體，在 DNA重組技術、 DNA測序、轉基因等方面具有廣泛的應用。對于細菌質粒的提取比較經典的方法有：堿裂解法、煮沸法、SDS裂解法以及Thton-溶菌酶裂解法 等。這些方法的選擇取決于質粒的大小、細菌菌株的性質等。Keunosky等GE_發(fā)展了一種以Zn'+誘導DN

20、A沉淀的方法，在該法中利用一定濃度的 ZnCl:溶液使 一定體積的細菌菌液質粒 DNA大量沉淀，無需多次離心，大大簡化了抽 提的步 驟。近年來，一些生物技術公司，比如 Promega公司及Qiagen公司等紛紛推出 質粒抽提試劑盒，這些試劑盒多運用樹脂材料或硅膠來特異性的吸附質粒 DNA,提取過程用時少，效率高。3.2 真菌DNA提取方法對 真菌DNA的提取關鍵是破碎細胞，通 常采取酶解破壁法或以 液氮冷凍處理增加細胞壁脆性的物理破壁法。在這兩種方法中酶解破壁法較為簡單，易于 操 作和控制，而物理破壁法在處理過程中容易造成細胞核的大量破損。在提取 獲 得核酸一蛋白質復合物后，對其中蛋白質的沉淀

21、也多采用傳統(tǒng)的氯仿一異戊醇沉淀法或高鹽沉淀法。韓利剛等 C25用CTA13法直接從絲狀真菌的新鮮菌絲 中提取DNA,并將所提取的DNA進行RAPD,得到了較清晰的擴增圖譜。Loeffler等Z6為滿足快速靈敏準確的臨床檢驗 的需要，利用MagNA Pure LC 系統(tǒng)建立了一種實用的快速提取方法，該法自動化程度高，避免了可能的交叉污染。Manian等z7在對真菌進行DNA抽提時采用幾個循環(huán)的快速制冷、煮 沸以破碎真菌細胞壁，并通過 Qiagen公司的QIAquick DNA純化柱，迅速從 極微量的真菌中獲得高純度的 DNA大分子。3.3 結核桿菌DNA的提取方法利用PC R微孔板雜交技術檢測臨

22、床標本中結核桿菌 DNA是診斷結核桿菌感 染的一種快速靈敏和特異的方法。從不同的臨床標本中獲得DNA是檢測準確和成功的關鍵。而不同來源的結核桿菌又分別受到不同來源材料的影響，所 以 提取方法各不相同。同時由于結核桿菌的細胞壁比較厚不易破碎，一般的微波法、異硫氟酸肌法、凍融法等難以破壞結核桿菌的細胞壁。通常采取的方法有：經典酶一酚一氯仿法，堿一 SDS裂解法，堿裂解煮沸法，超聲裂解法， Chelex-100法，玻璃粉一硅吸附法等。楊正林等28通過對以上幾種方法的 比較發(fā)現(xiàn)玻璃粉一硅吸附法操作簡單，假陽性低，適合臨床檢測使用。3.4 土壤微生物總DNA的提取方法土壤中細菌的含量豐富，種類齊全，從中

23、提取細菌DNA可用于檢測不可培 養(yǎng)的細菌，跟蹤某些目標菌或重組基因在自然環(huán)境中的行為，也可用來解釋 土 壤微生物生態(tài)系統(tǒng)中的基因的多樣性及其隨環(huán)境的變化。從土壤中提取和純化DNA是最關鍵的技 術之一。Courtoi:等29對比了在土壤中直接裂解微生物體、 然后提取DNA和先將微生物菌體通過梯度離心與土壤顆粒分開再進行提取的方法，利用PCR技術以及雜交技術檢測不同方法獲得DNA的種類和純度，發(fā) 現(xiàn) 前一種方法具有更高的效率，能夠提取獲得較多微生物物種的DNAo張瑞福等30采用SDS高鹽提取法和透析袋回收法對 9種不同來源的土壤進行微生物DNA的提取，與通常采用的對菌體細胞的超聲破碎法以及對粗提

24、DNA的微 型柱純化法相比，既保證了一定提取與回收效率，又兼顧了 DNA的質量，使 DNA在提取和純化 過程中不會受到損傷。4海洋生物DNA的提取方法海洋是地 球上最大的生物資源庫，同時由于海水的保護使海洋生物變化很少， 物種得到較好的保存，這樣就為研究生命現(xiàn)象的基本問題提供了豐富的資料。在利用這些資源探討諸如生命的起源、生物進化、生物與環(huán)境的關系、改造 海洋生 物以為人類服務(如生產某種藥物)時離不開對生物核 酸的研究。對于海洋 來源的 動物、植物、微生物由于其不同于陸生生物的組織和細胞結構特點往往采用不同的DNA提取方法。張海 琪 等31_在對不同方法保存的大黃魚(Pseudosciaen

25、a crocea)肌肉樣品 基 因組DNA進行提取時發(fā)現(xiàn)，經福爾馬林、乙醇及含有 EDTA的乙醇保存的 樣品 可以同鮮活樣品和冷凍樣品一樣獲得基因組 DNA,但相比之下采用乙醇作 為固 定劑更方便快速，所提取的DNA用于RAPD分析，獲得了滿意的效果。 楊文新 等32利用75%的乙醇固定鮑魚(Haliotis discus)樣本并進行DNA的提 取，證 明用乙醇固定海洋動物組織是一種切實可行的方法，材料處理后可同 步提取，增 加了實驗的同步性、可比性，適用于大量樣本的提取。由于組織中含 有許多DNA酶，絕大多數(shù)DNA酶需要一個二價陽離子作 為輔助因子，因此采 用含適量 EDTA的乙醇固定劑是野

26、外標本采集和運輸?shù)囊环N更簡便有效的方 法。韓兵社等33:針對傳統(tǒng)的有機溶劑提取工藝進行改進，應用多種萃取液體系 從廢棄物就魚肝臟中提取核酸，與原工藝相比，核酸提取產量提高30%-60% ,整體工藝得到簡化，而且避免了有機物的殘留。赤潮是在特定的環(huán)境前提條件下，海水中的某些浮游生物、原生動物或細菌爆發(fā)性增殖或高度聚集而引起水體變色的一種有害生態(tài)現(xiàn)象，對海洋漁業(yè)、水產資源以及人類的健康造成很大的威脅。發(fā)生赤潮的生物類型主要為藻類，銅綠微囊藻(Microcytis aeruginosa)是造成赤潮的藻類之一。陸源等34用乙醇乙醴混合液對純化的銅綠微囊藻作預處理，破壞了其膠質鞘，從而使蛋白酶K和SDS

27、能更好地直接作用于其細胞壁，細胞內的DNA釋放完全，提高了總 DNA的得率。通過提取獲得的DNA有助于開展對有害藻類的 研究，為防范赤 潮提供依據(jù)。在對紫菜(Porphyras p.)進行DNA提取時，郭寶太等35先用海螺酶處理 樣品制備紫菜體細胞，然后用 SDS和蛋白酶K裂解細胞提取總DNA,再用 Wizard DNA clean-up;樹脂進行純化。經海螺酶處理的紫菜細胞 解決了通常采 用的液氮破碎細胞后裂解物勃稠、DNA得率低且有嚴重的多糖污染等難題。但 這種方法對植物組織需求量較多，不適于個體體積小的紫菜。劉必謙等36采用美國Roche公司的DNA Isolation Kit for

28、Cell and Tissue和上海生工公司的 UNIQ- 10小量柱式基因組DNA提取試劑盒對個體體積較小的圓紫菜(Porphyra suborbiculato卜鐵釘菜(Ishige okamurae)等進行DNA 的提取，獲得高純度的 基因組DNA,完全能滿足酶切片段長度多態(tài)性 (Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)技術的需要。陳子 桂 等371以海洋尾絲蟲(Uronema marinum)為材料，針對纖毛蟲難以建 立培養(yǎng)以及個體豐度不高等特點，就微量條件下提取DNA的方法進行了探討，成功地獲得了活體直接提取、活體酚 /氯仿抽提、固定標

29、本直接提取以及固定標 本酚/氯仿抽提等四種簡便有效的微量 DNA提取方法，解決了纖毛蟲微量 DNA 提取的困難。綜合DN A的提取方法，雖然不同生物DNA的提取方法不盡相同，但各種提 取方法也有很多相通之處，可以相互借鑒。隨著生物技術的飛速發(fā)展，對這 一 技術的經驗總結將會越來越多，一些生物領域新的DNA提取方法也將逐漸固DNA.定下來，更為簡捷、高效的方法也必將出現(xiàn)，為基因工程提供更高純度的CTAB法原理（植物DNA提取經典方法）CTAB （ h exadecvl tri methyl a mmonium bromide. 十六燒范 三甲基溪化錢是一種陽離子去污劑,可溶解細胞膜， 并與核酸形

30、成復合物。該復合物在高鹽溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的，核 討有機溶劑抽提.去除蛋白.多地.甑類等雜質后加入乙 斛或異內醉沉淀即可使核酸分離出來）注：CTAB洛淞在低于15。時會形成沆江折出.因此在將其加入冰療 的植物材科之刖必很預熱.H離心耳溫度小要低才15 c.除蛋白質:氯仿/異戊醇抽提以偽對侵上門成知片仙H波，!?！皺C 心川的分a：異膻解劇什曲卜浦除抽提過以中出現(xiàn)的氣泡）.，使用變性劑變性，sis,甘情帆內依等,，高鹽洗滌，蛋白府處理：.14*>0PVP聚乙烯毗咯烷SO是的的絡合物，能叮多酚 形成一種不溶的結合物質，有效去除多酚,減少 DNA中價的污染；同時它也

31、能和多糖結合,有效 去除多糖。CT A B提取級次液的統(tǒng)妝配方 WHO （pH8.0）擢供 個諼沖環(huán)埴，防止核魔被破壞1 EDTA聯(lián)介Mg?忠或MW忠丁,抑:WDNase活懼.NMI提供個防鹽”收.使DNP先分淵MT,存右J液相中: CTAB潮岬制胭聯(lián)并結介收糧.使桎糕伙于分崗， B維基乙的是抗?jié)饣?有效地防d晌H化成池,超免灼交使的容易去除除多糖:高鹽法：用乙醉沉淀時,在持沉淀溶液中加入1/2體積 的5MN&CL高鹽可溶豺多糖.用多相木解腦將多帖降解.一在:提取緩沖液中加一定量的氟木（1/2體積），氯米可以 與多袖的羥基作用，從而去除多糖。除酚類物質:，在抽提液中加入防止的類氣化的

32、試劑，|“筑址 乙醉、抗壞血酸、半胱氮根、.硫蘇精醉等,加入易與酚類結合的試劑：如PVP、PEG（聚乙二 即），它們與酚類有較強的親和力,可防止酚類 與DNA的結合除鹽離子:70%的乙醛洗法TE中成分的作用, TE中的EDTA能螯和Mp或MN離子,抑制DNase，pH值為8.0.可防止DNA發(fā)生版解J j工加,力C區(qū)注意的問題DNA玩淀，用乙齡或異內的都可以，R內刑沉沆的效率要高J無水乙 K .試冷中只委0.64;體根的界內B7沉沁而力裳2k；體 稅的無水乙析伴足棄內桁沉淀衣?lián)P柑小成分超沉淀， ILaDNA沉淀中弄西B?虛以押發(fā)除去.DNAAi Uk I DNA. il乙肝允分揮發(fā).ZA/斛；

33、若長期儲存建議使用TE緩沖液溶也DNA提取常見問題%題一，DNA樣品不純，抑制后續(xù)酹解和PCR反應.1. DNA中*W. >* >»山»2. DNAR»*5T, WW 0磯，«WW« me*3. DMA*MLWW*«* 子4. #RNA婚安， «Mft1UDNAv 姓G*除一白、 0-T *>H9U<DNA, If *3d70% 乙次盤(2-3*) 加入RNastRMR'港 問題二工DNA降解.問題三士 DNA提取量少.1.(Q*)_二,Td i *, ,>111）學習并掌握動物組織總

34、DNA的提取方法及其原理。（2）從肝臟組織中提取到一定量的純凈的DNA樣品?！緦嶒炘怼緿NA是一切生物細胞 的重要組成成分，主要存在于細胞核中 。通過研磨和SDS作用破碎 細胞；苯酚和氯仿可 使蛋白質變性，用其混合液（酚：氯仿： 異戊醇）重復抽提，使蛋白 質變性，然后離心除 去變性蛋白質；RNase降解RNA ,從而得到純凈的DNA分子。 【儀器、材料、試劑】 （一）儀器1 .高速離心機2 .烘箱3 .冰箱4 .水浴鍋5 .微量移液器6 .高壓滅菌鍋 （二）材料1 ,生理鹽水2 .十二烷基硫酸鈉（SDS ）3 .三羥甲基氨基甲烷 （Tris）4 .乙二胺四乙酸（EDTA）5 .飽和酚6 .氯

35、仿7 .異戊醇8 .無水乙醇9 . 75%乙醇10 .蛋白酶K11 . RNase 酶12 .手術剪刀、鐐子、 吸水紙13 .微量取液器14 .研缽、1.5mL離心管、一次性手套、1.5mL離心管架、記號筆（三）試劑配制1. Tris -HCL 1mol/L PH8.0 50ml配制方法：40ml雙蒸水，6.057g固體Tris放入燒杯中溶解，用濃鹽酸調PH值到8.0,轉移到50ml容量瓶中，加入雙蒸 水定容，搖勻后，轉到準備好的輸液瓶中，貼上標簽，高壓滅菌后，降至室溫，4 c保存?zhèn)溆谩?,生理鹽水：0.85%NaCL 100ml配制方法：在20ml雙蒸水中溶解 0.85g固體NaCL ,加水

36、定容至100ml ,搖勻后，轉到準備好的輸液 瓶中，貼上標簽，高 壓滅菌后，B等至室溫,4 c保存?zhèn)溆谩?. EDTA 0.5mol/L PH8.0 50ml配制方法：將9.08g的EDTA Na2 - 2H2O溶解于40ml雙蒸水，用1g的NaOH顆粒（慢慢逐步加入） 調PH值到8.0 ,用50ml容量瓶定容，如果 EDTA難溶，先加NaOH溶解，然后逐步加 EDTA- Na2 2H2O。4. TES緩沖液（釋放DNA） 100ml配制方法：將0.5844g 的5 mol/lNaCl溶解于80ml雙蒸水，在分別加入 1ml的0.5 mol/l EDTA、0.2ml的Tris-HCl （pH=8.