重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞

1、第三部分第三部分 重組重組DNADNA導(dǎo)入受體細(xì)胞導(dǎo)入受體細(xì)胞一、受體細(xì)胞一、受體細(xì)胞二、選擇受體細(xì)胞的基本原則二、選擇受體細(xì)胞的基本原則三、重組三、重組DNADNA導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法1 1、轉(zhuǎn)化概念、轉(zhuǎn)化概念轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 ：DNA DNA 重組分子在體外構(gòu)建完成后，必須導(dǎo)入重組分子在體外構(gòu)建完成后，必須導(dǎo)入特定的受體細(xì)胞，使之無(wú)性繁殖并高效表達(dá)外源基因特定的受體細(xì)胞，使之無(wú)性繁殖并高效表達(dá)外源基因或直接改變其遺傳性狀，這個(gè)導(dǎo)入過(guò)程及操作統(tǒng)稱為或直接改變其遺傳性狀，這個(gè)導(dǎo)入過(guò)程及操作統(tǒng)稱為重組重組 DNA DNA 分子的轉(zhuǎn)化（分子的轉(zhuǎn)化（TransformationTransfo

2、rmation）。）。重組重組DNA DNA 人工導(dǎo)入受體細(xì)胞有許多方法，包括人工導(dǎo)入受體細(xì)胞有許多方法，包括轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、接合轉(zhuǎn)染、接合以及其它物理手段，如受體細(xì)胞的電穿孔以及其它物理手段，如受體細(xì)胞的電穿孔和顯微注射等，這些導(dǎo)入方法在和顯微注射等，這些導(dǎo)入方法在 DNA DNA 重組技術(shù)中統(tǒng)重組技術(shù)中統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)化操作。稱為轉(zhuǎn)化操作。一、重組一、重組DNADNA轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化感受態(tài)：感受態(tài)：受體細(xì)胞最易接受外源受體細(xì)胞最易接受外源 DNA DNA 片段而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)片段而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的一種特殊生理狀態(tài)。處于感受態(tài)的受體細(xì)菌，其化的一種特殊生理狀態(tài)。處于感受態(tài)的受體細(xì)菌，其吸收轉(zhuǎn)化因子的能力為一般細(xì)菌生理狀

3、態(tài)的千倍以上，吸收轉(zhuǎn)化因子的能力為一般細(xì)菌生理狀態(tài)的千倍以上，而且不同細(xì)菌間的感受態(tài)差異往往受自身的而且不同細(xì)菌間的感受態(tài)差異往往受自身的遺傳特性、遺傳特性、菌齡、生理培養(yǎng)條件菌齡、生理培養(yǎng)條件等諸多因素的影響。等諸多因素的影響。2 2、細(xì)菌轉(zhuǎn)化的步驟：、細(xì)菌轉(zhuǎn)化的步驟：感受態(tài)的形成。感受態(tài)時(shí)細(xì)胞表面出現(xiàn)各種蛋感受態(tài)的形成。感受態(tài)時(shí)細(xì)胞表面出現(xiàn)各種蛋白質(zhì)和酶類，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)化因子的結(jié)合、切割及加工。白質(zhì)和酶類，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)化因子的結(jié)合、切割及加工。感受態(tài)細(xì)胞能分泌一種小分子量的激活蛋白或感感受態(tài)細(xì)胞能分泌一種小分子量的激活蛋白或感受因子，其功能是與細(xì)胞表面受體結(jié)合，誘導(dǎo)某受因子，其功能是與細(xì)胞表面受體結(jié)合

4、，誘導(dǎo)某些與感受態(tài)有關(guān)的特征性蛋白質(zhì)（如細(xì)菌溶素）些與感受態(tài)有關(guān)的特征性蛋白質(zhì)（如細(xì)菌溶素）的合成，使細(xì)菌胞壁部分溶解，局部暴露出細(xì)胞的合成，使細(xì)菌胞壁部分溶解，局部暴露出細(xì)胞膜上的膜上的 DNA DNA 結(jié)合蛋白和核酸酶等。結(jié)合蛋白和核酸酶等。轉(zhuǎn)化因子的結(jié)合。受體菌細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)化因子的結(jié)合。受體菌細(xì)胞膜上的DNADNA結(jié)合蛋結(jié)合蛋白可與轉(zhuǎn)化因子的雙鏈白可與轉(zhuǎn)化因子的雙鏈DNADNA結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合，單鏈結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合，單鏈DNADNA或或RNARNA雙鏈雙鏈RNARNA以及以及DNA/RNADNA/RNA雜合雙鏈都不能結(jié)雜合雙鏈都不能結(jié)合在膜上。合在膜上。轉(zhuǎn)化因子的吸收。雙鏈轉(zhuǎn)化因子的吸收。雙

5、鏈 DNA DNA 分子與結(jié)合蛋白分子與結(jié)合蛋白作用后，激活鄰近的核酸酶，一條鏈被降解，而作用后，激活鄰近的核酸酶，一條鏈被降解，而另一條鏈則被吸收到受體菌中。另一條鏈則被吸收到受體菌中。整合復(fù)合物前體的形成。進(jìn)入受體細(xì)胞的單鏈整合復(fù)合物前體的形成。進(jìn)入受體細(xì)胞的單鏈 DNA DNA 與另一種游離的蛋白因子結(jié)合，形成整合復(fù)與另一種游離的蛋白因子結(jié)合，形成整合復(fù)合物前體結(jié)構(gòu)，它能有效地保護(hù)單鏈合物前體結(jié)構(gòu)，它能有效地保護(hù)單鏈DNADNA免受各免受各種胞內(nèi)核酸酶的降解，并將其引導(dǎo)至受體菌染色種胞內(nèi)核酸酶的降解，并將其引導(dǎo)至受體菌染色體體DNADNA處。處。轉(zhuǎn)化因子單鏈轉(zhuǎn)化因子單鏈DNADNA的整合

6、。供體單鏈的整合。供體單鏈DNADNA片段通片段通過(guò)同源重組，置換受體染色體過(guò)同源重組，置換受體染色體DNADNA的同源區(qū)域，的同源區(qū)域，形成異源雜合雙鏈形成異源雜合雙鏈 DNADNA結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)。二、受體細(xì)胞二、受體細(xì)胞受體細(xì)胞受體細(xì)胞(receptor cell)：又稱為宿主細(xì)胞又稱為宿主細(xì)胞 (host cell)，是指能攝取外源，是指能攝取外源DNA并使其穩(wěn)定維持的細(xì)胞并使其穩(wěn)定維持的細(xì)胞感受態(tài)感受態(tài)(competence)：是指細(xì)菌吸收外源是指細(xì)菌吸收外源DNA的的生理狀態(tài)。生理狀態(tài)。感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞(competence cell)：是指具有接受外是指具有接受外源源DNA能力的細(xì)

7、胞。能力的細(xì)胞。1 1、原核生物細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)、原核生物細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)大部分原核生物細(xì)胞沒(méi)有纖維素組成的堅(jiān)硬細(xì)大部分原核生物細(xì)胞沒(méi)有纖維素組成的堅(jiān)硬細(xì)胞壁，便于外源胞壁，便于外源DNADNA的進(jìn)入。的進(jìn)入。沒(méi)有核膜，染色體沒(méi)有核膜，染色體DNADNA沒(méi)有固定結(jié)合的蛋白質(zhì)，沒(méi)有固定結(jié)合的蛋白質(zhì)，這為外源這為外源DNADNA與裸露的染色體與裸露的染色體DNADNA重組減少了麻煩重組減少了麻煩基因組簡(jiǎn)單，不含線粒體和質(zhì)體基因組，便于基因組簡(jiǎn)單，不含線粒體和質(zhì)體基因組，便于對(duì)引入的外源基因進(jìn)行遺傳分析。對(duì)引入的外源基因進(jìn)行遺傳分析。原核生物多數(shù)為單細(xì)胞生物，容易獲得一致性原核生物多數(shù)為單細(xì)胞生物，容易獲得一致

8、性的實(shí)驗(yàn)材料，并且培養(yǎng)簡(jiǎn)單，繁殖迅速，實(shí)驗(yàn)周的實(shí)驗(yàn)材料，并且培養(yǎng)簡(jiǎn)單，繁殖迅速，實(shí)驗(yàn)周期短，重復(fù)實(shí)驗(yàn)快。期短，重復(fù)實(shí)驗(yàn)快。原核生物細(xì)胞不具備真核生物的蛋白質(zhì)折疊復(fù)性原核生物細(xì)胞不具備真核生物的蛋白質(zhì)折疊復(fù)性系統(tǒng)，即使許多真核生物基因得以表達(dá)，得到的也系統(tǒng)，即使許多真核生物基因得以表達(dá)，得到的也多是無(wú)特異性空間結(jié)構(gòu)的多肽鏈。多是無(wú)特異性空間結(jié)構(gòu)的多肽鏈。原核生物細(xì)胞缺乏真核生物的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)，原核生物細(xì)胞缺乏真核生物的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)，而許多真核生物蛋白質(zhì)的生物活性正是依賴于其側(cè)而許多真核生物蛋白質(zhì)的生物活性正是依賴于其側(cè)鏈的糖基化或磷酸化等修飾作用。鏈的糖基化或磷酸化等修飾作用。原核生物細(xì)胞內(nèi)

9、源性蛋白酶易降解空間構(gòu)象不正原核生物細(xì)胞內(nèi)源性蛋白酶易降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白，造成表達(dá)產(chǎn)物不穩(wěn)定等。確的異源蛋白，造成表達(dá)產(chǎn)物不穩(wěn)定等。2 2、原核生物細(xì)胞表達(dá)真核生物基因存在的缺點(diǎn)：、原核生物細(xì)胞表達(dá)真核生物基因存在的缺點(diǎn)：3、被用作受體菌的原核生物：大腸桿菌、枯草桿、被用作受體菌的原核生物：大腸桿菌、枯草桿菌、藍(lán)細(xì)菌等。菌、藍(lán)細(xì)菌等。大腸桿菌受體細(xì)胞大腸桿菌受體細(xì)胞大腸桿菌屬革蘭氏陰性菌，它是目前為止研究得大腸桿菌屬革蘭氏陰性菌，它是目前為止研究得最為詳盡、應(yīng)用最為廣泛的原核生物種類之一，也最為詳盡、應(yīng)用最為廣泛的原核生物種類之一，也是基因工程研究和應(yīng)用中發(fā)展最為完善和成熟的載是基因

10、工程研究和應(yīng)用中發(fā)展最為完善和成熟的載體受體系統(tǒng)。體受體系統(tǒng)。優(yōu)點(diǎn)：繁殖迅速、培養(yǎng)簡(jiǎn)便，代謝易于控制。優(yōu)點(diǎn)：繁殖迅速、培養(yǎng)簡(jiǎn)便，代謝易于控制。缺點(diǎn)：大腸桿菌細(xì)胞間隙中含有大量的內(nèi)毒素缺點(diǎn)：大腸桿菌細(xì)胞間隙中含有大量的內(nèi)毒素可導(dǎo)致人體熱原反應(yīng)?？蓪?dǎo)致人體熱原反應(yīng)?？莶輻U菌受體細(xì)胞枯草桿菌受體細(xì)胞枯草桿菌又稱枯草芽孢桿菌，是一類革蘭氏陽(yáng)性菌。枯草桿菌又稱枯草芽孢桿菌，是一類革蘭氏陽(yáng)性菌。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：枯草桿菌具有胞外酶分泌調(diào)節(jié)基因，能將具有表達(dá)的產(chǎn)枯草桿菌具有胞外酶分泌調(diào)節(jié)基因，能將具有表達(dá)的產(chǎn)物高效分泌到培養(yǎng)基中，大大簡(jiǎn)化了蛋白表達(dá)產(chǎn)物的提取和物高效分泌到培養(yǎng)基中，大大簡(jiǎn)化了蛋白表達(dá)產(chǎn)物的提取和加

11、工處理等，而且在大多數(shù)情況下，真核生物的異源重組蛋加工處理等，而且在大多數(shù)情況下，真核生物的異源重組蛋白經(jīng)枯草桿菌分泌后便具有天然的構(gòu)象和生物活性。白經(jīng)枯草桿菌分泌后便具有天然的構(gòu)象和生物活性?？莶輻U菌不產(chǎn)生內(nèi)毒素，無(wú)致病性，是一種安全的基因工枯草桿菌不產(chǎn)生內(nèi)毒素，無(wú)致病性，是一種安全的基因工程菌。程菌。枯草桿菌具有芽孢形成的能力，易于保存和培養(yǎng)?？莶輻U菌具有芽孢形成的能力，易于保存和培養(yǎng)?？莶輻U菌也具有大腸桿菌生長(zhǎng)迅速、代謝易于調(diào)控、分子枯草桿菌也具有大腸桿菌生長(zhǎng)迅速、代謝易于調(diào)控、分子遺傳學(xué)背景清楚等優(yōu)點(diǎn)。遺傳學(xué)背景清楚等優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用：已成功的用于表達(dá)人的應(yīng)用：已成功的用于表達(dá)人的干擾素、白

12、細(xì)胞介素乙型干擾素、白細(xì)胞介素乙型肝炎病毒核心抗原和動(dòng)物口蹄疫病毒肝炎病毒核心抗原和動(dòng)物口蹄疫病毒VPIVPI抗原等?？乖?。藍(lán)細(xì)菌（藍(lán)藻）藍(lán)細(xì)菌（藍(lán)藻）藍(lán)藻藍(lán)藻又稱藍(lán)綠藻或藍(lán)細(xì)菌，它含有葉綠素又稱藍(lán)綠藻或藍(lán)細(xì)菌，它含有葉綠素a(a(缺乏葉綠素缺乏葉綠素b)b)和藻膽素，具有光合系統(tǒng)和藻膽素，具有光合系統(tǒng)(PS)(PS) 和光合系統(tǒng)和光合系統(tǒng)(PS)(PS)、能進(jìn)行光合作用，但它又、能進(jìn)行光合作用，但它又具有細(xì)菌的特征，無(wú)細(xì)胞核及雙層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞具有細(xì)菌的特征，無(wú)細(xì)胞核及雙層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器，染色體裸露，是一種典型的原核生物。器，染色體裸露，是一種典型的原核生物。藍(lán)藻作為表達(dá)外源基因的受體菌兼具

13、微生物和植藍(lán)藻作為表達(dá)外源基因的受體菌兼具微生物和植物的優(yōu)點(diǎn)，具體表現(xiàn)在：物的優(yōu)點(diǎn)，具體表現(xiàn)在：基因組為原核型，除了裸露的染色體基因組為原核型，除了裸露的染色體DNADNA外，不外，不含葉綠體含葉綠體DNADNA和線粒體和線粒體DNADNA，遺傳背景簡(jiǎn)單，便于，遺傳背景簡(jiǎn)單，便于基因操作和外源基因操作和外源DNADNA的檢測(cè)。的檢測(cè)。細(xì)胞壁屬細(xì)胞壁屬G G- -，主要由肽聚糖組成，便于外源，主要由肽聚糖組成，便于外源DNADNA的轉(zhuǎn)化。的轉(zhuǎn)化。營(yíng)光合自養(yǎng)生長(zhǎng)，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，只需光、營(yíng)光合自養(yǎng)生長(zhǎng)，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，只需光、CO2CO2、無(wú)機(jī)鹽、水和適宜的溫度就能滿足生長(zhǎng)需、無(wú)機(jī)鹽、水和適宜的溫度就

14、能滿足生長(zhǎng)需要。要。多種藍(lán)藻含內(nèi)源質(zhì)粒，為構(gòu)建藍(lán)藻質(zhì)粒載體提多種藍(lán)藻含內(nèi)源質(zhì)粒，為構(gòu)建藍(lán)藻質(zhì)粒載體提供了極好的條件。供了極好的條件。藍(lán)藻富含蛋白質(zhì)，并且多數(shù)藍(lán)藻無(wú)毒，早已用藍(lán)藻富含蛋白質(zhì)，并且多數(shù)藍(lán)藻無(wú)毒，早已用作食物或保健品，在此基礎(chǔ)上采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，作食物或保健品，在此基礎(chǔ)上采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，把一些重要藥物的基因轉(zhuǎn)入無(wú)毒藍(lán)藻，就可達(dá)到把一些重要藥物的基因轉(zhuǎn)入無(wú)毒藍(lán)藻，就可達(dá)到錦上添花的效果。錦上添花的效果。4 4、真核生物細(xì)胞、真核生物細(xì)胞真菌受體細(xì)胞真菌受體細(xì)胞真菌是低等的真核生物，其基因結(jié)構(gòu)、表真菌是低等的真核生物，其基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)調(diào)控機(jī)制以及蛋白質(zhì)的加工與分泌都具達(dá)調(diào)控機(jī)制以及蛋白質(zhì)的

15、加工與分泌都具有真核生物的特征，因此利用真菌細(xì)胞表有真核生物的特征，因此利用真菌細(xì)胞表達(dá)高等動(dòng)植物基因具有原核生物細(xì)胞無(wú)法達(dá)高等動(dòng)植物基因具有原核生物細(xì)胞無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)。比擬的優(yōu)點(diǎn)。酵母菌酵母菌酵母菌作為外源真核基因表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)酵母菌作為外源真核基因表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)酵母菌是結(jié)構(gòu)最為簡(jiǎn)單的真核生物之一酵母菌是結(jié)構(gòu)最為簡(jiǎn)單的真核生物之一, ,其基因表達(dá)其基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理比較清楚調(diào)控機(jī)理比較清楚, ,遺傳操作相對(duì)較為簡(jiǎn)單。遺傳操作相對(duì)較為簡(jiǎn)單。具有真核生物蛋白翻譯后修飾加工系統(tǒng)。具有真核生物蛋白翻譯后修飾加工系統(tǒng)。不含有特異性的病毒，不產(chǎn)生毒素，有些酵母菌屬不含有特異性的病毒，不產(chǎn)生毒素，有些酵母菌

16、屬( (如釀酒酵母如釀酒酵母) )在儀器工業(yè)中有著幾百年的應(yīng)用歷史，在儀器工業(yè)中有著幾百年的應(yīng)用歷史，屬于安全型基因工程受體系統(tǒng)。屬于安全型基因工程受體系統(tǒng)。培養(yǎng)簡(jiǎn)單，利于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，成本低廉。培養(yǎng)簡(jiǎn)單，利于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，成本低廉。能將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中，便于產(chǎn)物能將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中，便于產(chǎn)物的提取和加工等。的提取和加工等。動(dòng)物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞常用的動(dòng)物受體細(xì)胞有常用的動(dòng)物受體細(xì)胞有HelaHela細(xì)胞、猴腎細(xì)胞和細(xì)胞、猴腎細(xì)胞和中國(guó)倉(cāng)鼠巢細(xì)胞中國(guó)倉(cāng)鼠巢細(xì)胞(CHO)(CHO)等。等。哺乳動(dòng)物細(xì)胞作為受體細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)是：哺乳動(dòng)物細(xì)胞作為受體細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)是：能識(shí)別和除去外

17、源真核基因中的內(nèi)含子，剪接能識(shí)別和除去外源真核基因中的內(nèi)含子，剪接加工成成熟的加工成成熟的RNARNA。真核基因表達(dá)蛋白在翻譯后能被正確加工或修真核基因表達(dá)蛋白在翻譯后能被正確加工或修飾飾, ,產(chǎn)物具有較好的蛋白質(zhì)免疫原性產(chǎn)物具有較好的蛋白質(zhì)免疫原性, ,約為酵母細(xì)約為酵母細(xì)胞胞16-2016-20倍。倍。易被重組易被重組DNADNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染質(zhì)粒轉(zhuǎn)染, ,具有遺傳穩(wěn)定性和可重具有遺傳穩(wěn)定性和可重復(fù)性。復(fù)性。經(jīng)轉(zhuǎn)化的動(dòng)物細(xì)胞可將表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基經(jīng)轉(zhuǎn)化的動(dòng)物細(xì)胞可將表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中，便于提純和加工，成本低。中，便于提純和加工，成本低。缺點(diǎn)是缺點(diǎn)是: :組織培養(yǎng)技術(shù)要求高，如培養(yǎng)和篩選組織

18、培養(yǎng)技術(shù)要求高，如培養(yǎng)和篩選一個(gè)高度擴(kuò)增的轉(zhuǎn)化子一個(gè)高度擴(kuò)增的轉(zhuǎn)化子CHOCHO細(xì)胞，通常需要數(shù)月細(xì)胞，通常需要數(shù)月之久之久, ,難度較大。難度較大。目前用作基因轉(zhuǎn)移的受體動(dòng)物主要有豬，羊、目前用作基因轉(zhuǎn)移的受體動(dòng)物主要有豬，羊、牛、魚(yú)等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物和鼠、猴等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，主要用牛、魚(yú)等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物和鼠、猴等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，主要用途在于大規(guī)模表達(dá)生產(chǎn)天然狀態(tài)的復(fù)雜蛋白質(zhì)或途在于大規(guī)模表達(dá)生產(chǎn)天然狀態(tài)的復(fù)雜蛋白質(zhì)或動(dòng)物疫苗、動(dòng)物品種的遺傳改良及人類疾病的基動(dòng)物疫苗、動(dòng)物品種的遺傳改良及人類疾病的基因治療等。因治療等。常用的動(dòng)物受體細(xì)胞有小鼠常用的動(dòng)物受體細(xì)胞有小鼠L L細(xì)胞、細(xì)胞、HeleHele細(xì)胞細(xì)胞猴腎細(xì)胞

19、和中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞猴腎細(xì)胞和中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)(CHO)等。以動(dòng)物等。以動(dòng)物細(xì)胞，尤其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞作為受體細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)細(xì)胞，尤其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞作為受體細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)植物受體細(xì)胞植物受體細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)：全能性，優(yōu)點(diǎn)：全能性，即一個(gè)分離的活細(xì)胞在合適即一個(gè)分離的活細(xì)胞在合適的培養(yǎng)條件下，較容易再分化成植株，這意味的培養(yǎng)條件下，較容易再分化成植株，這意味著一個(gè)獲得外源基因的體細(xì)胞可以培養(yǎng)出能穩(wěn)著一個(gè)獲得外源基因的體細(xì)胞可以培養(yǎng)出能穩(wěn)定遺傳的植株或品系。定遺傳的植株或品系。 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：植物細(xì)胞有纖維素參與組成的堅(jiān)硬細(xì)植物細(xì)胞有纖維素參與組成的堅(jiān)硬細(xì)胞壁，不利于攝取重組胞壁，不利于攝取重組DNADNA分

20、子。分子。現(xiàn)在用作轉(zhuǎn)基因受體的植物有水稻、棉花、現(xiàn)在用作轉(zhuǎn)基因受體的植物有水稻、棉花、玉米、馬鈴薯、煙草等經(jīng)濟(jì)作物和擬南芥等模玉米、馬鈴薯、煙草等經(jīng)濟(jì)作物和擬南芥等模式植物。式植物。 5 5、選擇受體細(xì)胞的基本原則、選擇受體細(xì)胞的基本原則便于重組便于重組DNADNA分子的導(dǎo)入。分子的導(dǎo)入。便于重組體的篩選。根據(jù)所用的表達(dá)載體所含的便于重組體的篩選。根據(jù)所用的表達(dá)載體所含的選擇性標(biāo)記與受體細(xì)胞基因是否相匹配，從而易選擇性標(biāo)記與受體細(xì)胞基因是否相匹配，從而易于對(duì)重組體進(jìn)行篩選。于對(duì)重組體進(jìn)行篩選。遺傳穩(wěn)定性高，易于進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)或易于進(jìn)行高遺傳穩(wěn)定性高，易于進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)或易于進(jìn)行高密度發(fā)酵而不影響外

21、源基因的表達(dá)效率。對(duì)動(dòng)物密度發(fā)酵而不影響外源基因的表達(dá)效率。對(duì)動(dòng)物細(xì)胞而言，所選用的受體細(xì)胞具有對(duì)培養(yǎng)的適應(yīng)細(xì)胞而言，所選用的受體細(xì)胞具有對(duì)培養(yǎng)的適應(yīng)性強(qiáng)，可以進(jìn)行貼壁或懸浮培養(yǎng)，可以在無(wú)血清性強(qiáng)，可以進(jìn)行貼壁或懸浮培養(yǎng)，可以在無(wú)血清培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。 受體細(xì)胞內(nèi)內(nèi)源蛋白水解酶基因缺失或蛋受體細(xì)胞內(nèi)內(nèi)源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低，利于外源蛋白表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)白酶含量低，利于外源蛋白表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)積累，可促進(jìn)外源基因高效分泌表達(dá)胞內(nèi)積累，可促進(jìn)外源基因高效分泌表達(dá)。安全性高，安全性高，無(wú)致病性，不會(huì)對(duì)外界環(huán)境造無(wú)致病性，不會(huì)對(duì)外界環(huán)境造成生物污染成生物污染。一般選用致病缺陷

22、型的細(xì)胞。一般選用致病缺陷型的細(xì)胞或營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞作為受體細(xì)胞。或營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞作為受體細(xì)胞。能使重組能使重組DNADNA分子穩(wěn)定存在于細(xì)胞中。從受體細(xì)分子穩(wěn)定存在于細(xì)胞中。從受體細(xì)胞的角度出發(fā)，通常的做法是對(duì)其作適當(dāng)?shù)男揎棸慕嵌瘸霭l(fā)，通常的做法是對(duì)其作適當(dāng)?shù)男揎椄脑?，如選用某些限制性核酸內(nèi)切酶缺陷型的受改造，如選用某些限制性核酸內(nèi)切酶缺陷型的受體細(xì)胞就可以避免其對(duì)重組體細(xì)胞就可以避免其對(duì)重組DNADNA分子的降解破壞分子的降解破壞作用。作用。受體細(xì)胞在遺傳密碼子的應(yīng)用上無(wú)明顯偏倚性。受體細(xì)胞在遺傳密碼子的應(yīng)用上無(wú)明顯偏倚性。具有較好的轉(zhuǎn)譯后加工機(jī)制等，便于真核目的基具有較好的轉(zhuǎn)譯后加工機(jī)制

23、等，便于真核目的基因的高效表達(dá)。因的高效表達(dá)。在理論研究和生產(chǎn)實(shí)踐上有較高的應(yīng)用價(jià)值。在理論研究和生產(chǎn)實(shí)踐上有較高的應(yīng)用價(jià)值。6 6、受體細(xì)胞應(yīng)具備的條件、受體細(xì)胞應(yīng)具備的條件野生型的大腸桿菌不是理想的受體細(xì)胞，因?yàn)樽陨砭咭吧偷拇竽c桿菌不是理想的受體細(xì)胞，因?yàn)樽陨砭哂械南拗坪托揎椣到y(tǒng)，另外還可能存在潛在的致病性有的限制和修飾系統(tǒng)，另外還可能存在潛在的致病性因此必須通過(guò)適當(dāng)?shù)恼T變手段對(duì)野生型大腸桿菌進(jìn)行因此必須通過(guò)適當(dāng)?shù)恼T變手段對(duì)野生型大腸桿菌進(jìn)行遺傳性狀改造，以獲得適宜作為受體細(xì)胞的突變菌株遺傳性狀改造，以獲得適宜作為受體細(xì)胞的突變菌株通常應(yīng)從以下幾個(gè)方面加以考慮：通常應(yīng)從以下幾個(gè)方面加以考

24、慮：從安全性考慮，應(yīng)具備以下條件：從安全性考慮，應(yīng)具備以下條件：不適合在人體內(nèi)生存不適合在人體內(nèi)生存不適合在非培養(yǎng)條件下生存不適合在非培養(yǎng)條件下生存在非培養(yǎng)條件下，其在非培養(yǎng)條件下，其DNADNA容易解體容易解體它的它的DNADNA不易轉(zhuǎn)移不易轉(zhuǎn)移它的質(zhì)粒只在這一宿主由復(fù)制它的質(zhì)粒只在這一宿主由復(fù)制便于檢測(cè)便于檢測(cè) 從遺傳性考慮：從遺傳性考慮：重組缺陷型重組缺陷型recArecA，用于基因擴(kuò)增或高效表達(dá)的用于基因擴(kuò)增或高效表達(dá)的受體細(xì)胞（受體細(xì)胞（recArecA- -）限制系統(tǒng)的缺陷，或是修飾系統(tǒng)的缺陷。避免限制系統(tǒng)的缺陷，或是修飾系統(tǒng)的缺陷。避免對(duì)外源對(duì)外源DNADNA的除解。外切酶和內(nèi)切

25、酶活性缺陷的除解。外切酶和內(nèi)切酶活性缺陷（recBrecB- -，recCrecC- -，hsdRhsdR- -） 與重組質(zhì)粒的遺傳性狀要有顯的差異（具有與與重組質(zhì)粒的遺傳性狀要有顯的差異（具有與載體選擇標(biāo)記互補(bǔ)的表型）載體選擇標(biāo)記互補(bǔ)的表型）具有較高的轉(zhuǎn)化效率具有較高的轉(zhuǎn)化效率 限制缺陷型限制缺陷型這是導(dǎo)致外源重組這是導(dǎo)致外源重組DNADNA轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低下的主要轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低下的主要原因之一。原因之一。應(yīng)選用限制系統(tǒng)缺陷型的突變菌株作為受體細(xì)胞應(yīng)選用限制系統(tǒng)缺陷型的突變菌株作為受體細(xì)胞，以提高外源，以提高外源DNADNA分子的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。分子的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。進(jìn)一步使修飾系統(tǒng)也發(fā)生

26、缺陷，則受體菌細(xì)胞既進(jìn)一步使修飾系統(tǒng)也發(fā)生缺陷，則受體菌細(xì)胞既不能修飾，也不能限制外源不能修飾，也不能限制外源DNADNA分子，更便于重組分子，更便于重組DNADNA分子的多種基因操作。分子的多種基因操作。大腸桿菌的限制系統(tǒng)主要由大腸桿菌的限制系統(tǒng)主要由 hsdR hsdR 基因編碼，因基因編碼，因此具有此具有 hsdRhsdR- - 遺傳表型的大腸桿菌各株均喪失了遺傳表型的大腸桿菌各株均喪失了降解外源降解外源DNADNA的能力，同時(shí)大大增加了外源的能力，同時(shí)大大增加了外源 DNADNA的的可轉(zhuǎn)化性。可轉(zhuǎn)化性。重組缺陷型重組缺陷型進(jìn)入野生型細(xì)胞的外源進(jìn)入野生型細(xì)胞的外源DNADNA分子能自發(fā)地

27、與染色體分子能自發(fā)地與染色體DNADNA發(fā)生的體內(nèi)同源重組反應(yīng)由發(fā)生的體內(nèi)同源重組反應(yīng)由recrec基因家族的編碼產(chǎn)物所控基因家族的編碼產(chǎn)物所控制。制。RecARecA蛋白能促進(jìn)蛋白能促進(jìn)DNADNA分子之間的同源聯(lián)會(huì)和分子之間的同源聯(lián)會(huì)和DNADNA單鏈單鏈交換，交換，recArecA基因的突變使大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的遺傳重組頻基因的突變使大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的遺傳重組頻率降低至率降低至10106 6。大腸桿菌的大腸桿菌的 recBrecB、recC recC 和和 recD recD 基因分別編碼不同基因分別編碼不同分子量的多肽鏈，三者構(gòu)成一個(gè)在同源重組中的統(tǒng)一功分子量的多肽鏈，三者構(gòu)成一個(gè)在同源重組

28、中的統(tǒng)一功能單位能單位RecBCDRecBCD蛋白（核酸酶蛋白（核酸酶V V），它具有依賴于），它具有依賴于ATPATP的雙鏈的雙鏈DNADNA外切酶和單鏈外切酶和單鏈 DNADNA內(nèi)切酶雙重活性。內(nèi)切酶雙重活性。recBrecB、recCrecC和和recDrecD基因的突變也可以降低遺傳重組的發(fā)生頻率基因的突變也可以降低遺傳重組的發(fā)生頻率因此受體細(xì)胞必須選擇體內(nèi)同源重組缺陷型的遺傳表型因此受體細(xì)胞必須選擇體內(nèi)同源重組缺陷型的遺傳表型基因型為基因型為recArecA- -、recBrecB- -或或recCrecC- -等，有些大腸桿菌突變體等，有些大腸桿菌突變體菌株則將三個(gè)基因同時(shí)失活。菌

29、株則將三個(gè)基因同時(shí)失活。 轉(zhuǎn)化親和型轉(zhuǎn)化親和型可以利用遺傳誘變技術(shù)改變受體菌細(xì)胞可以利用遺傳誘變技術(shù)改變受體菌細(xì)胞壁的通透性及細(xì)胞膜的特異吸附性，從壁的通透性及細(xì)胞膜的特異吸附性，從而提高其轉(zhuǎn)化效率。還可以選擇能夠誘而提高其轉(zhuǎn)化效率。還可以選擇能夠誘導(dǎo)形成感受態(tài)細(xì)胞的菌株作為受體菌細(xì)導(dǎo)形成感受態(tài)細(xì)胞的菌株作為受體菌細(xì)胞。胞。遺傳互補(bǔ)型遺傳互補(bǔ)型遺傳表型差異大，可便于重組子的檢測(cè)。通常是遺傳表型差異大，可便于重組子的檢測(cè)。通常是使受體細(xì)胞呈現(xiàn)與載體所攜帶的選擇標(biāo)記互補(bǔ)的使受體細(xì)胞呈現(xiàn)與載體所攜帶的選擇標(biāo)記互補(bǔ)的遺傳性狀。方能使轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選成為可能。遺傳性狀。方能使轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選成為可能。如在大

30、腸桿菌系統(tǒng)中，重組質(zhì)粒載體上多含有如在大腸桿菌系統(tǒng)中，重組質(zhì)粒載體上多含有AMPAMP抗性標(biāo)記基因，則所選用的受體細(xì)胞應(yīng)對(duì)這抗性標(biāo)記基因，則所選用的受體細(xì)胞應(yīng)對(duì)這種抗生素敏感。當(dāng)重組種抗生素敏感。當(dāng)重組DNADNA分子轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞后分子轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞后載體上的標(biāo)記基因賦予受體細(xì)胞抗生素的抗性特載體上的標(biāo)記基因賦予受體細(xì)胞抗生素的抗性特征，據(jù)此可以區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子。征，據(jù)此可以區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子。如果受體細(xì)胞具有與外源基因表達(dá)產(chǎn)物活性互補(bǔ)如果受體細(xì)胞具有與外源基因表達(dá)產(chǎn)物活性互補(bǔ)的遺傳特征可以直接篩選到外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)的遺傳特征可以直接篩選到外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞?；?xì)胞。 感染寄生缺陷型感

31、染寄生缺陷型相當(dāng)多的細(xì)菌對(duì)其它生物尤其是人和牲畜具有相當(dāng)多的細(xì)菌對(duì)其它生物尤其是人和牲畜具有 感染和寄生效應(yīng)，重組感染和寄生效應(yīng)，重組 DNA DNA 分子導(dǎo)入這些細(xì)分子導(dǎo)入這些細(xì) 菌受體中后，極有可能隨著受體菌的感染寄生菌受體中后，極有可能隨著受體菌的感染寄生 作用，進(jìn)入生物體內(nèi)，并廣泛圍傳播，作用，進(jìn)入生物體內(nèi)，并廣泛圍傳播，如果外源基因?qū)θ梭w和牲畜有害，則會(huì)導(dǎo)致一如果外源基因?qū)θ梭w和牲畜有害，則會(huì)導(dǎo)致一 場(chǎng)災(zāi)難，因此從安全的角度上考慮，受體細(xì)胞場(chǎng)災(zāi)難，因此從安全的角度上考慮，受體細(xì)胞 不能具有感染寄生性，當(dāng)然，利用基因工程手不能具有感染寄生性，當(dāng)然，利用基因工程手 段制造生物武器不在此例

32、。段制造生物武器不在此例。三、重組三、重組DNADNA導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化(transformation):指感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞捕指感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞捕獲質(zhì)粒獲質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組質(zhì)?；蛞运鼮檩d體構(gòu)建的重組質(zhì)粒DNA分分子的過(guò)程。子的過(guò)程。轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化子(transformant)：經(jīng)轉(zhuǎn)化獲得外源遺傳物質(zhì)經(jīng)轉(zhuǎn)化獲得外源遺傳物質(zhì)的細(xì)胞。的細(xì)胞。轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染(transfection):指感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞捕獲噬指感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞捕獲噬菌體或以它為載體構(gòu)建的重組菌體或以它為載體構(gòu)建的重組DNA分子的過(guò)程分子的過(guò)程轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction):指病毒轉(zhuǎn)

33、移真核細(xì)胞指病毒轉(zhuǎn)移真核細(xì)胞DNA的過(guò)的過(guò)程或噬菌體介導(dǎo)的細(xì)菌細(xì)胞之間基因轉(zhuǎn)移的過(guò)程。程或噬菌體介導(dǎo)的細(xì)菌細(xì)胞之間基因轉(zhuǎn)移的過(guò)程。基因?qū)胧荏w細(xì)胞方法基因?qū)胧荏w細(xì)胞方法根據(jù)轉(zhuǎn)移基因方法特性可分為：根據(jù)轉(zhuǎn)移基因方法特性可分為：轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化(transformation)(transformation)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)(transduction)轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染(transfection)(transfection)微注射技術(shù)微注射技術(shù)(microinjection)(microinjection)電轉(zhuǎn)化法電轉(zhuǎn)化法(electroporation)(electroporation)基因槍

34、技術(shù)基因槍技術(shù)(geneblaster)(geneblaster)脂質(zhì)體介導(dǎo)法脂質(zhì)體介導(dǎo)法(liposome mediated transfer)(liposome mediated transfer)根據(jù)轉(zhuǎn)移基因載體與受體的特性可分為：根據(jù)轉(zhuǎn)移基因載體與受體的特性可分為：質(zhì)粒載體導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法：質(zhì)粒載體導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法：CaCl2、電轉(zhuǎn)化、電轉(zhuǎn)化法等。法等。噬菌體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法：噬菌體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法：體外包裝感染法等。體外包裝感染法等。DNA導(dǎo)入酵母菌的方法：導(dǎo)入酵母菌的方法：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、電穿孔原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、電穿孔轉(zhuǎn)化法等。轉(zhuǎn)化法等。DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞的方法：導(dǎo)入植物細(xì)胞的方法：Ti

35、質(zhì)粒葉盤法、電穿質(zhì)粒葉盤法、電穿孔轉(zhuǎn)化法、基因槍法等?？邹D(zhuǎn)化法、基因槍法等。DNA導(dǎo)入昆蟲(chóng)細(xì)胞的方法：導(dǎo)入昆蟲(chóng)細(xì)胞的方法：桿狀病毒感染法等。桿狀病毒感染法等。DNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法：導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法：磷酸鈣共沉淀法、磷酸鈣共沉淀法、電穿孔轉(zhuǎn)化法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法、基因槍法等電穿孔轉(zhuǎn)化法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法、基因槍法等1、氯化鈣轉(zhuǎn)化法、氯化鈣轉(zhuǎn)化法大腸桿菌是一種革蘭氏陰性菌，自然條件下很難大腸桿菌是一種革蘭氏陰性菌，自然條件下很難進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其主要原因是轉(zhuǎn)化因子的吸收較為困進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其主要原因是轉(zhuǎn)化因子的吸收較為困難。在基因工程研究和應(yīng)用中，轉(zhuǎn)化受體菌細(xì)胞難。在基因工程研究和應(yīng)用中，轉(zhuǎn)化受體菌細(xì)

36、胞的正是根據(jù)人們需要構(gòu)建的外源重組質(zhì)粒的正是根據(jù)人們需要構(gòu)建的外源重組質(zhì)粒DNADNA分子分子而非來(lái)自供體菌的游離而非來(lái)自供體菌的游離DNADNA片段片段( (轉(zhuǎn)化因子轉(zhuǎn)化因子) )。因此在大腸桿菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，很少采取自然轉(zhuǎn)因此在大腸桿菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，很少采取自然轉(zhuǎn)化的方法，通常的做法是首先采用人工的方法制化的方法，通常的做法是首先采用人工的方法制備感受態(tài)細(xì)胞，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)化處理，其中代表性備感受態(tài)細(xì)胞，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)化處理，其中代表性的方法之一是的方法之一是CaCa2+2+誘導(dǎo)的大腸桿菌轉(zhuǎn)化法。誘導(dǎo)的大腸桿菌轉(zhuǎn)化法。19701970年年M.MandelM.Mandel和和A.HigeA.Hige

37、發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn), ,大腸桿菌大腸桿菌經(jīng)過(guò)氯化鈣適當(dāng)處理及短暫熱休克之后經(jīng)過(guò)氯化鈣適當(dāng)處理及短暫熱休克之后, ,便能吸收便能吸收噬菌體噬菌體DNADNA。19721972年美國(guó)斯坦年美國(guó)斯坦福大學(xué)福大學(xué) S.CohenS.Cohen報(bào)道報(bào)道, ,經(jīng)氯化鈣處理大腸經(jīng)氯化鈣處理大腸桿菌細(xì)胞也能攝取質(zhì)粒桿菌細(xì)胞也能攝取質(zhì)粒DNADNA。CaCa2+2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化原理：誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化原理：在在00的的CaclCacl2 2低滲溶液中，細(xì)菌細(xì)胞發(fā)生膨低滲溶液中，細(xì)菌細(xì)胞發(fā)生膨脹，同時(shí)脹，同時(shí)CaclCacl2 2使細(xì)胞膜磷脂層形成液晶結(jié)構(gòu)使細(xì)胞膜磷脂層形成液晶結(jié)構(gòu)促使細(xì)胞外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶解離促使細(xì)胞外膜與內(nèi)

38、膜間隙中的部分核酸酶解離開(kāi)來(lái)，誘導(dǎo)大腸桿菌形成感受態(tài)。開(kāi)來(lái)，誘導(dǎo)大腸桿菌形成感受態(tài)。CaCa2+2+能與加入的能與加入的DNADNA分子結(jié)合，形成抗分子結(jié)合，形成抗DNADNA酶酶(DNase)(DNase)的羥基的羥基- -磷酸鈣復(fù)合物，并黏附在細(xì)菌磷酸鈣復(fù)合物，并黏附在細(xì)菌細(xì)胞膜的外表面上。當(dāng)細(xì)胞膜的外表面上。當(dāng)4242熱刺激短暫處理細(xì)熱刺激短暫處理細(xì)菌細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞膜的液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈擾動(dòng)，菌細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞膜的液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈擾動(dòng)，并隨之出現(xiàn)許多間隙，為并隨之出現(xiàn)許多間隙，為DNADNA分子提供了進(jìn)入分子提供了進(jìn)入細(xì)胞的通道。細(xì)胞的通道。 MgMg2+2+對(duì)對(duì)DNADNA分子有很大的穩(wěn)定性作

39、用，因此利用分子有很大的穩(wěn)定性作用，因此利用MgclMgcl2 2與與CaclCacl2 2共同處理大腸桿菌細(xì)胞，可以提高共同處理大腸桿菌細(xì)胞，可以提高DNADNA的轉(zhuǎn)化效率。如利用二甲基亞砜的轉(zhuǎn)化效率。如利用二甲基亞砜(DMSO)(DMSO)和二和二硫蘇糖醇硫蘇糖醇(DDT)(DDT)等進(jìn)一步處理細(xì)胞，能誘導(dǎo)高頻等進(jìn)一步處理細(xì)胞，能誘導(dǎo)高頻感受態(tài)細(xì)胞的形成，轉(zhuǎn)化效率可提高感受態(tài)細(xì)胞的形成，轉(zhuǎn)化效率可提高10010010001000倍，且對(duì)大小質(zhì)粒分子均可進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)化。倍，且對(duì)大小質(zhì)粒分子均可進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)化。但該法要求條件高，對(duì)外界污染物極為敏感，但該法要求條件高，對(duì)外界污染物極為敏感，通常

40、很少采用。通常很少采用。 該法重復(fù)性好。操作簡(jiǎn)便快捷，適用于成該法重復(fù)性好。操作簡(jiǎn)便快捷，適用于成批制備感受態(tài)細(xì)胞。對(duì)這種感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行批制備感受態(tài)細(xì)胞。對(duì)這種感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化如果感受態(tài)細(xì)胞做得好，每微克超螺旋如果感受態(tài)細(xì)胞做得好，每微克超螺旋質(zhì)粒質(zhì)粒DNA可得可得51071109個(gè)轉(zhuǎn)化子。個(gè)轉(zhuǎn)化子。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備：的制備：100ml菌體培養(yǎng)至菌體培養(yǎng)至OD600 = 0.5，離心收集菌體。離心收集菌體。 用用10 ml 冰冷的冰冷的75 mM CaCl2溶液懸浮菌體，離溶液懸浮菌體，離心收集菌體。心收集菌體。用用1 ml 冰冷的冰冷的75 mM CaCl2溶

41、液懸浮菌體。溶液懸浮菌體。 冰浴放置冰浴放置12 - 24小時(shí)，備用小時(shí)，備用 。取取100 ml感受態(tài)細(xì)胞，加入相當(dāng)于感受態(tài)細(xì)胞，加入相當(dāng)于50 ng載體的載體的重組重組DNADNA連接液，混勻。連接液，混勻。冰浴放置半小時(shí)。冰浴放置半小時(shí)。 在在4242保溫保溫1.5 分鐘（熱脈沖）。分鐘（熱脈沖）。 快速將轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)移至冰浴中放置快速將轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)移至冰浴中放置1 2 分鐘。分鐘。 加入加入1 ml 新鮮培養(yǎng)基，新鮮培養(yǎng)基，于于37培養(yǎng)培養(yǎng) 1 小小時(shí)（擴(kuò)增）。時(shí)（擴(kuò)增）。涂在合適的固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行篩選。涂在合適的固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行篩選。 獲得合格的感受態(tài)細(xì)胞，要注意以下幾點(diǎn)：獲得合

42、格的感受態(tài)細(xì)胞，要注意以下幾點(diǎn)：用作受體菌的細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)要掌握好細(xì)胞密度，用作受體菌的細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)要掌握好細(xì)胞密度，一般在一般在A600A600為為0.40.4左右為好。左右為好。制備受體細(xì)胞的整個(gè)過(guò)程要在制備受體細(xì)胞的整個(gè)過(guò)程要在0 044進(jìn)行，并盡進(jìn)行，并盡量避免污染。如果用抗生素篩選轉(zhuǎn)化子，作為對(duì)照量避免污染。如果用抗生素篩選轉(zhuǎn)化子，作為對(duì)照的受體菌應(yīng)該在此培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)。的受體菌應(yīng)該在此培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)。為了提高轉(zhuǎn)化率，可選用復(fù)合氯化鈣溶液，如為了提高轉(zhuǎn)化率，可選用復(fù)合氯化鈣溶液，如FSBFSB溶液。溶液。CaCl2CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化法制備感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化DNADNA時(shí)，低溫的

43、主要時(shí)，低溫的主要目的是目的是: :（1 1）抑制細(xì)胞的旺盛生理代謝。）抑制細(xì)胞的旺盛生理代謝。（2 2）有助于）有助于DNA-Ca2+DNA-Ca2+吸附于細(xì)胞表面。吸附于細(xì)胞表面。（3 3）防止）防止DNAaseDNAase降解降解DNADNA。熱休克溫度是熱休克溫度是4242。目的是使細(xì)胞攝入吸附于其。目的是使細(xì)胞攝入吸附于其表面的表面的DNADNA。轉(zhuǎn)化處理過(guò)程中，可能感染雜菌，導(dǎo)致假陽(yáng)性轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化處理過(guò)程中，可能感染雜菌，導(dǎo)致假陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的出現(xiàn)，因此須設(shè)以下幾種對(duì)照處理：化子的出現(xiàn)，因此須設(shè)以下幾種對(duì)照處理：DNADNA對(duì)照處理。轉(zhuǎn)化處理液中用對(duì)照處理。轉(zhuǎn)化處理液中用0.2ml0.2ml

44、無(wú)菌水代替無(wú)菌水代替0.2m10.2m1感受態(tài)細(xì)胞，檢驗(yàn)感受態(tài)細(xì)胞，檢驗(yàn)DNADNA溶液是否染菌。溶液是否染菌。感受態(tài)細(xì)胞對(duì)照處理。轉(zhuǎn)化處理液中用感受態(tài)細(xì)胞對(duì)照處理。轉(zhuǎn)化處理液中用0.1mlNTE0.1mlNTE緩沖液緩沖液(500mM NaCl(500mM NaCl，10mM Tris-HCl10mM Tris-HCl，1mMEDTA1mMEDTApH8.0)pH8.0)代替代替0.1m1DNA0.1m1DNA溶液，檢驗(yàn)感受態(tài)細(xì)胞是否染溶液，檢驗(yàn)感受態(tài)細(xì)胞是否染菌。菌。感受態(tài)細(xì)胞有效性對(duì)照處理。在感受態(tài)細(xì)胞有效性對(duì)照處理。在0.2ml0.2ml感受態(tài)細(xì)感受態(tài)細(xì)胞中加入胞中加入0.1ml0.1

45、ml已知容易轉(zhuǎn)化這種感受態(tài)細(xì)胞的質(zhì)已知容易轉(zhuǎn)化這種感受態(tài)細(xì)胞的質(zhì)粒粒DNADNA。 2、PEG介導(dǎo)的細(xì)菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化介導(dǎo)的細(xì)菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌（如枯草桿菌、鏈霉菌等）接納外革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌（如枯草桿菌、鏈霉菌等）接納外源源DNA的主要屏障是細(xì)胞壁，因而這類細(xì)菌通常采的主要屏障是細(xì)胞壁，因而這類細(xì)菌通常采用原生質(zhì)體（細(xì)胞去壁后的形態(tài)）轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)移用原生質(zhì)體（細(xì)胞去壁后的形態(tài)）轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)移質(zhì)?；蛑亟M質(zhì)?；蛑亟MDNA分子分子 。酵母菌、霉菌、植物細(xì)胞也可用酵母菌、霉菌、植物細(xì)胞也可用原生質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)原生質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)化化。PEGPEG是乙二醇的多聚物是乙二醇的多聚物, , 存在不同分子量的

46、多聚體存在不同分子量的多聚體, ,它可改變各類細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)它可改變各類細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu), , 使兩細(xì)胞相互接觸部使兩細(xì)胞相互接觸部位的膜脂雙層中脂類分子發(fā)生疏散和重組位的膜脂雙層中脂類分子發(fā)生疏散和重組, ,此時(shí)相互此時(shí)相互接觸的兩細(xì)胞的胞質(zhì)溝通成為可能接觸的兩細(xì)胞的胞質(zhì)溝通成為可能, ,從而造成細(xì)胞之從而造成細(xì)胞之間發(fā)生融合。間發(fā)生融合。細(xì)菌原生質(zhì)體細(xì)菌原生質(zhì)體的制備：的制備：不同細(xì)菌的原生質(zhì)體制備方法不盡相同，以鏈霉菌不同細(xì)菌的原生質(zhì)體制備方法不盡相同，以鏈霉菌為例：細(xì)菌需生長(zhǎng)在為例：細(xì)菌需生長(zhǎng)在高滲培養(yǎng)基高滲培養(yǎng)基中（如中（如34%的蔗糖的蔗糖溶液），并加入溶液），并加入甘氨酸甘氨酸以增加細(xì)

47、菌細(xì)胞壁對(duì)溶菌酶以增加細(xì)菌細(xì)胞壁對(duì)溶菌酶的敏感性。在制備過(guò)程中，菌體應(yīng)始終懸浮在的敏感性。在制備過(guò)程中，菌體應(yīng)始終懸浮在10.3%的蔗糖等滲溶液的蔗糖等滲溶液中。與原生質(zhì)體接觸的所有中。與原生質(zhì)體接觸的所有器皿應(yīng)保持器皿應(yīng)保持無(wú)水無(wú)去污劑無(wú)水無(wú)去污劑。 細(xì)菌原生質(zhì)體細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化：的轉(zhuǎn)化：取取0.2 - 1ml的原生質(zhì)體懸浮液（的原生質(zhì)體懸浮液（10108 8-10-109 9個(gè)原生質(zhì)個(gè)原生質(zhì)體），加入體），加入10 - 20 m ml DNA重組連接液，同時(shí)加重組連接液，同時(shí)加入含有入含有PEG1000和和Ca2+的等滲溶液，混勻。的等滲溶液，混勻。 細(xì)菌原生質(zhì)體細(xì)菌原生質(zhì)體的再生的再生

48、：原生質(zhì)體再生的主要目的是使細(xì)菌重新長(zhǎng)出細(xì)胞原生質(zhì)體再生的主要目的是使細(xì)菌重新長(zhǎng)出細(xì)胞壁。再生在特殊的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行，內(nèi)含脯氨壁。再生在特殊的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行，內(nèi)含脯氨酸和微量元素。酸和微量元素。3 3、電轉(zhuǎn)化、電轉(zhuǎn)化電轉(zhuǎn)化又稱電穿孔法電轉(zhuǎn)化又稱電穿孔法(electroporation):是指在細(xì)胞上施加短暫、高壓的電流脈沖，在質(zhì)膜是指在細(xì)胞上施加短暫、高壓的電流脈沖，在質(zhì)膜上形成納米大小的微孔，上形成納米大小的微孔，DNADNA直接通過(guò)這些微孔或直接通過(guò)這些微孔或者作為微孔閉合時(shí)所伴隨發(fā)生的膜組分重新分布通者作為微孔閉合時(shí)所伴隨發(fā)生的膜組分重新分布通過(guò)質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，這種方法稱為電穿孔法

49、。過(guò)質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，這種方法稱為電穿孔法。最早用于將最早用于將DNADNA導(dǎo)入真核細(xì)胞導(dǎo)入真核細(xì)胞, ,1988年年,Dower等人成等人成功應(yīng)用于大腸桿菌的轉(zhuǎn)化。功應(yīng)用于大腸桿菌的轉(zhuǎn)化。基本原理是利用高壓電基本原理是利用高壓電脈沖作用，在大腸桿菌細(xì)胞膜上進(jìn)行電穿孔，形成脈沖作用，在大腸桿菌細(xì)胞膜上進(jìn)行電穿孔，形成可逆的瞬間通道可逆的瞬間通道, ,從而促進(jìn)外源從而促進(jìn)外源DNADNA的有效吸收。的有效吸收。 將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)?；?qū)⒋D(zhuǎn)化的質(zhì)?；駾NA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化儀的樣品池中，兩極施加高壓電場(chǎng)。在強(qiáng)大電場(chǎng)化儀的樣品池中，兩極施加高壓電場(chǎng)。在強(qiáng)大電場(chǎng)的作用下，細(xì)菌細(xì)

50、胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)?；虻淖饔孟?，細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)?；駾NA重組分子便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。重組分子便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。電穿孔轉(zhuǎn)化法操作簡(jiǎn)單，而且?guī)缀鯇?duì)所有含細(xì)胞壁電穿孔轉(zhuǎn)化法操作簡(jiǎn)單，而且?guī)缀鯇?duì)所有含細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的受體細(xì)胞均有效，但轉(zhuǎn)化效率差別很大。結(jié)構(gòu)的受體細(xì)胞均有效，但轉(zhuǎn)化效率差別很大。電穿孔轉(zhuǎn)化法的效率受電場(chǎng)強(qiáng)度、電脈沖時(shí)電穿孔轉(zhuǎn)化法的效率受電場(chǎng)強(qiáng)度、電脈沖時(shí)間和外源間和外源DNA濃度等參數(shù)的影響，通過(guò)優(yōu)化濃度等參數(shù)的影響，通過(guò)優(yōu)化這些參數(shù)，每這些參數(shù)，每g DNA可以得到可以得到1091010轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化子?；?。電壓增高或電脈沖時(shí)間延長(zhǎng)時(shí)，轉(zhuǎn)化效率將電壓增高或電脈沖時(shí)間延長(zhǎng)時(shí)，轉(zhuǎn)化效

51、率將會(huì)有所提高，但同時(shí)導(dǎo)致受體細(xì)胞存活率的會(huì)有所提高，但同時(shí)導(dǎo)致受體細(xì)胞存活率的降低，轉(zhuǎn)化效率的提高也因此被抵消。降低，轉(zhuǎn)化效率的提高也因此被抵消。用于電穿孔轉(zhuǎn)化法的細(xì)胞處理要比感受態(tài)細(xì)胞用于電穿孔轉(zhuǎn)化法的細(xì)胞處理要比感受態(tài)細(xì)胞的制備容易得多當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)中期后予的制備容易得多當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)中期后予以冷卻、離心，然后用低鹽緩沖液充分清洗降以冷卻、離心，然后用低鹽緩沖液充分清洗降低細(xì)胞懸浮液的離子強(qiáng)度，并用低細(xì)胞懸浮液的離子強(qiáng)度，并用1010甘油重懸甘油重懸細(xì)胞，使其細(xì)胞濃度為細(xì)胞，使其細(xì)胞濃度為3 3l0l01010個(gè)個(gè)m1m1。分裝，。分裝，在干冰上速凍后置于在干冰上速凍后置于 -70

52、-70 貯存。這樣，每貯存。這樣，每小份細(xì)胞融解后即可用于轉(zhuǎn)化，有效期達(dá)小份細(xì)胞融解后即可用于轉(zhuǎn)化，有效期達(dá)6 6個(gè)個(gè)月以上。月以上。 電穿孔轉(zhuǎn)化須在低溫下電穿孔轉(zhuǎn)化須在低溫下(0-4)(0-4)進(jìn)行，轉(zhuǎn)化效進(jìn)行，轉(zhuǎn)化效率要比在室溫下操作提高約率要比在室溫下操作提高約100100倍。倍。 4 4、接合轉(zhuǎn)化：、接合轉(zhuǎn)化：接合（接合（ConjugationConjugation）：）：指通過(guò)細(xì)菌細(xì)胞之間指通過(guò)細(xì)菌細(xì)胞之間的直接接觸導(dǎo)致的直接接觸導(dǎo)致 DNA DNA 從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另一從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另一個(gè)細(xì)胞的過(guò)程。個(gè)細(xì)胞的過(guò)程。這個(gè)過(guò)程是由結(jié)合型質(zhì)粒完成這個(gè)過(guò)程是由結(jié)合型質(zhì)粒完成的，它通常具有

53、促進(jìn)供體細(xì)胞與受體細(xì)胞有效的，它通常具有促進(jìn)供體細(xì)胞與受體細(xì)胞有效接觸的接合功能以及誘導(dǎo)接觸的接合功能以及誘導(dǎo) DNADNA分子傳遞的轉(zhuǎn)移分子傳遞的轉(zhuǎn)移功能，兩者均由接合型質(zhì)粒上的有關(guān)基因編碼功能，兩者均由接合型質(zhì)粒上的有關(guān)基因編碼是基于非接合型質(zhì)粒的遷移作用而建立的一種是基于非接合型質(zhì)粒的遷移作用而建立的一種DNADNA轉(zhuǎn)化方式適用于那些難以采用轉(zhuǎn)化方式適用于那些難以采用CaCa2+2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化法或電穿孔法轉(zhuǎn)化的受體菌。法或電穿孔法轉(zhuǎn)化的受體菌。 非接合型質(zhì)粒分子較小，缺少編碼質(zhì)粒轉(zhuǎn)移體非接合型質(zhì)粒分子較小，缺少編碼質(zhì)粒轉(zhuǎn)移體系所須的全部基因，不能象接合型質(zhì)粒那樣在宿系所須的全部基因

54、，不能象接合型質(zhì)粒那樣在宿主細(xì)胞間自我轉(zhuǎn)移。但如果宿主細(xì)胞中存在另外主細(xì)胞間自我轉(zhuǎn)移。但如果宿主細(xì)胞中存在另外一種溶合性的接合型質(zhì)粒（即輔助質(zhì)粒）非接合一種溶合性的接合型質(zhì)粒（即輔助質(zhì)粒）非接合型質(zhì)粒通常也會(huì)被轉(zhuǎn)移，這種由共存的接合型質(zhì)型質(zhì)粒通常也會(huì)被轉(zhuǎn)移，這種由共存的接合型質(zhì)粒引發(fā)的非接合型質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移過(guò)程稱為遷移作用粒引發(fā)的非接合型質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移過(guò)程稱為遷移作用 接合型質(zhì)粒分子較大，自我轉(zhuǎn)移的隨意性強(qiáng)，接合型質(zhì)粒分子較大，自我轉(zhuǎn)移的隨意性強(qiáng)，轉(zhuǎn)移過(guò)程中經(jīng)常伴隨著宿主細(xì)胞染色體的高頻轉(zhuǎn)移過(guò)程中經(jīng)常伴隨著宿主細(xì)胞染色體的高頻轉(zhuǎn)移，因此難以作為基因工程載體使用。目前轉(zhuǎn)移，因此難以作為基因工程載體使用。

55、目前常用的質(zhì)粒載體多是在非接合型質(zhì)粒或缺失了常用的質(zhì)粒載體多是在非接合型質(zhì)?；蛉笔Я私雍限D(zhuǎn)移基因的接合型質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建的，接合轉(zhuǎn)移基因的接合型質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建的，故重組質(zhì)粒故重組質(zhì)粒DNADNA分子也不能直接接進(jìn)行接合轉(zhuǎn)分子也不能直接接進(jìn)行接合轉(zhuǎn)化。而只能通過(guò)其遷移作用來(lái)完成?；?。而只能通過(guò)其遷移作用來(lái)完成。首先將具有接合轉(zhuǎn)化功能的輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至首先將具有接合轉(zhuǎn)化功能的輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至含有重組質(zhì)粒的供體細(xì)胞中，然后將這種供含有重組質(zhì)粒的供體細(xì)胞中，然后將這種供體細(xì)胞與受體細(xì)胞進(jìn)行混合，促使兩者發(fā)生體細(xì)胞與受體細(xì)胞進(jìn)行混合，促使兩者發(fā)生接合轉(zhuǎn)化作用，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞。接合轉(zhuǎn)化作用，將重組質(zhì)

56、粒導(dǎo)入受體細(xì)胞。整個(gè)接合轉(zhuǎn)化過(guò)程涉及到整個(gè)接合轉(zhuǎn)化過(guò)程涉及到3 3種有關(guān)的細(xì)菌菌株種有關(guān)的細(xì)菌菌株即待轉(zhuǎn)化的受體菌、含有要轉(zhuǎn)化的重組質(zhì)粒即待轉(zhuǎn)化的受體菌、含有要轉(zhuǎn)化的重組質(zhì)粒DNADNA的供體菌和含有廣泛宿主的輔助質(zhì)粒的輔的供體菌和含有廣泛宿主的輔助質(zhì)粒的輔助菌，因此稱為三親本雜交接合轉(zhuǎn)化法。助菌，因此稱為三親本雜交接合轉(zhuǎn)化法。5 5、重組、重組噬菌體噬菌體DNADNA分子轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸桿菌分子轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸桿菌 轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染：將重組將重組噬菌體噬菌體DNADNA分子直接導(dǎo)入受體分子直接導(dǎo)入受體細(xì)胞中的過(guò)程，稱為轉(zhuǎn)染。細(xì)胞中的過(guò)程，稱為轉(zhuǎn)染。 將重組將重組噬菌體噬菌體DNADNA分子導(dǎo)入大腸桿菌受體細(xì)分子導(dǎo)

57、入大腸桿菌受體細(xì)胞的常規(guī)方法是轉(zhuǎn)導(dǎo)操作。胞的常規(guī)方法是轉(zhuǎn)導(dǎo)操作。轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)(transduction)：指通過(guò)指通過(guò)噬菌體噬菌體( (病毒病毒) )顆粒感染宿主細(xì)胞的途徑把外源顆粒感染宿主細(xì)胞的途徑把外源DNADNA分子轉(zhuǎn)移分子轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞內(nèi)的過(guò)程。到受體細(xì)胞內(nèi)的過(guò)程。 具有感染能力的具有感染能力的噬菌體顆粒除含有噬菌體顆粒除含有噬菌噬菌體體DNADNA分子外，還包括外被蛋白。分子外，還包括外被蛋白。以噬菌體顆粒感染受體細(xì)胞，首先必須對(duì)重以噬菌體顆粒感染受體細(xì)胞，首先必須對(duì)重組組噬菌體噬菌體DNADNA分子進(jìn)行體外包裝分子進(jìn)行體外包裝 。體外包裝，是指在體外模擬體外

58、包裝，是指在體外模擬噬菌體噬菌體DNADNA分子分子在受體細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的一系列特殊的包裝反應(yīng)在受體細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的一系列特殊的包裝反應(yīng)過(guò)程，將重組過(guò)程，將重組噬菌體噬菌體DNADNA分子包裝為成熟的分子包裝為成熟的具有感染能力的具有感染能力的噬菌體顆粒的技術(shù)。噬菌體顆粒的技術(shù)。 基本原理：基本原理：根據(jù)根據(jù)噬菌體噬菌體DNADNA體內(nèi)包裝的途徑體內(nèi)包裝的途徑分別獲得缺失分別獲得缺失D D包裝蛋白的包裝蛋白的噬菌體突變株和噬菌體突變株和缺失缺失E E包裝蛋白的包裝蛋白的噬菌體突變株。這兩種突噬菌體突變株。這兩種突變株均不能單獨(dú)地包裝變株均不能單獨(dú)地包裝噬菌體噬菌體DNADNA，但將它，但將它們分別感染

59、大腸桿菌，從中提取缺失們分別感染大腸桿菌，從中提取缺失D D蛋白的蛋白的包裝物（含包裝物（含E E蛋白蛋白) )和缺失和缺失E E蛋白的包裝物蛋白的包裝物( (含含D D蛋白蛋白) )，兩者混合后就能包裝，兩者混合后就能包裝噬菌體噬菌體DNADNA。 噬菌體噬菌體DNADNA體外包裝的主要過(guò)程體外包裝的主要過(guò)程制備包裝物。制備包裝物。 須培養(yǎng)兩種溶原菌須培養(yǎng)兩種溶原菌 誘導(dǎo)溶菌生長(zhǎng)誘導(dǎo)溶菌生長(zhǎng) 收集和貯存包裝物。收集和貯存包裝物。體外包裝。體外包裝。制備制備噬菌體噬菌體DNADNA混合液?；旌弦骸５谝淮伟b。包裝物剛?cè)诨瘯r(shí)，細(xì)胞發(fā)生破裂，釋放出第一次包裝。包裝物剛?cè)诨瘯r(shí)，細(xì)胞發(fā)生破裂，釋放出包

60、裝物可立即用于包裝。包裝物可立即用于包裝。 第二次包裝。進(jìn)行第二次包裝，可提高包裝效率第二次包裝。進(jìn)行第二次包裝，可提高包裝效率2 25 5倍倍，加入蛋白酶可降低包裝反應(yīng)液的黏度，便于包裝反應(yīng)，加入蛋白酶可降低包裝反應(yīng)液的黏度，便于包裝反應(yīng)的進(jìn)行。的進(jìn)行。去除細(xì)胞屑。第二次包裝后，在反應(yīng)液中加入去除細(xì)胞屑。第二次包裝后，在反應(yīng)液中加入SMSM溶液溶液 （噬菌體稀釋緩沖液：（噬菌體稀釋緩沖液：100 mmol/L NaCl,100 mmol/L NaCl, 10 mmol/L 10 mmol/L MgSOMgSO4 4, , 50 mmol/L Tris-HCL pH7.5)0.2%50 mmo