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文檔簡介

1、免疫熒光染色觀察腫瘤細(xì)胞骨架實(shí)驗(yàn)九實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求1. 掌握免疫熒光技術(shù)的基本原理;2. 了解免疫熒光技術(shù)在生命科學(xué)中的廣泛應(yīng)用.一、實(shí)驗(yàn)的基本原理 熒光顯微鏡是一種較為常用的的光學(xué)顯微鏡，其基本原理是利用一定波長的激發(fā)光對樣品進(jìn)行激發(fā)，使之產(chǎn)生一定波長的熒光，從而用于對樣品結(jié)構(gòu)或其組分進(jìn)行定性、定位、定量觀察檢測。 抗體能特異性地識別相應(yīng)的抗原，并與之結(jié)合。這種結(jié)合在體外也能發(fā)生，這種特性就是許多免疫檢測方法的基礎(chǔ)。 熒光技術(shù)與免疫技術(shù)的結(jié)合可用于對樣品結(jié)構(gòu)或其組分進(jìn)行定性、定位、定量觀察檢測。三、試劑與器材人腫瘤細(xì)胞涂片甲醇、H2O2、濾紙、PBS、正常羊血清封閉液、一抗、 FITC標(biāo)記的I

2、gG、甘油/PBS封片劑、蓋玻片熒光顯微鏡玻片細(xì)胞置于甲醇中-10固定5min，室溫涼干（或冷丙酮固定5min，室溫涼干）；PBS漂洗2min3次；3% H2O2室溫孵育10min（以去除細(xì)胞內(nèi)源性過氧化物酶活性）；PBS漂洗5min3次；10%正常羊血清封閉液（0.1M PBS配制）室溫封閉20min；棄封閉液（此步驟不必PBS洗滌）；四、實(shí)驗(yàn)步驟 用適當(dāng)比例稀釋的一抗（一般稀釋比為1:100-1:200）37孵育1h（或4孵育過夜）；PBS漂洗5min3次；用適當(dāng)比例稀釋的二抗（FITC標(biāo)記的IgG）（一般稀釋比為1:100-1:200，用加有BSA的TBST配制）室溫孵育30min（避光黑暗條件下進(jìn)行）；PBS漂洗5min3次；甘油/PBS封片劑（PBS: 甘油=1：9，v/v，pH8.0-8.5）封片；熒光顯微鏡或激光共聚焦掃描顯微鏡觀察拍照。五、注意事項(xiàng)1. 注意各級抗體濃度的使用范圍;2. 熒光抗體孵育時(shí)要注意避光;3. 注意各步驟的漂洗要充分.六、作業(yè)與思考題試述免疫熒光技術(shù)的基本原理,并描

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