實(shí)驗(yàn)9水中總大腸菌群的測定

1、實(shí)驗(yàn)九水中總大腸菌群的測定多管發(fā)酵法一實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?掌握多管發(fā)酵法測定水中大腸菌群的技術(shù)。2預(yù)習(xí)第六章細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)法的關(guān)內(nèi)容。二原理總大腸菌群可用多管發(fā)酵法或?yàn)V膜法檢驗(yàn)。 多管發(fā)酵法的原理是根據(jù)大腸菌群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，以及具備革蘭氏染色陰性，無芽孢，呈桿狀等有關(guān)特性，通過三個步驟進(jìn)行檢驗(yàn)求得水樣中的總大腸菌群數(shù)。 試驗(yàn)結(jié)果以最可能數(shù)（ most probable number），簡稱 MPN 表示。三儀器(1)高壓蒸氣滅菌器。(2)恒溫培養(yǎng)箱、冰箱。(3)生物顯微鏡、載玻片。(4)酒精燈、鎳鉻絲接種棒。(5)培養(yǎng)皿（直徑 100mm）、試管（ 5×150mm），吸管（ 1、5

2、、10mL ）、燒杯（ 200、500、2000mL）、錐形瓶（ 500、1000mL）、采樣瓶。四培養(yǎng)基及染色劑的制備1乳糖蛋白胨培養(yǎng)液：將 10g 蛋白胨、 3g 牛肉膏、 5g 乳糖和 5g 氯化鈉加熱溶解于 1000mL 蒸餾水中，調(diào)節(jié)溶液 pH 為 7.27.4，再加入 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1mL，充分混勻，分裝于試管中，于 121高壓滅菌器中滅菌 15min，貯存于冷暗處備用。2三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液： 按上述乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的制備方法配制。除蒸餾水外，各組份用量增加至三倍。3品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基：貯備培養(yǎng)基的制備：于 2000mL 燒杯中，先將 20 30g 瓊脂加到 90

3、0mL 蒸餾水中，加熱溶解，然后加入 3.5g 磷酸氫二鉀及 10g 蛋白胨，混勻，使其溶解，再用蒸餾水補(bǔ)充到 1000mL，調(diào)節(jié)溶液 pH 為 7.27.4。趁熱用脫脂棉或絨布過濾，再加入 10g 乳糖，混勻，定量分裝于 250mL 或 500mL 錐形瓶內(nèi)，置于高壓滅菌器中，在 121滅菌 15min，貯存于冷暗處備用。平皿培養(yǎng)基的制備： 將上法制備的貯備培養(yǎng)基加熱融化。根據(jù)錐形瓶內(nèi)培養(yǎng)基的容量，用滅菌吸管按比例吸取一定量的5%堿性品紅乙醇溶液，置于滅菌試管中；再按比例稱取無水亞硫酸鈉，置于另一滅菌試管內(nèi)， 加滅菌水少許使其溶解，再置于沸水浴中煮沸10min（滅菌）。用滅菌吸管吸取已滅菌的

4、亞硫酸鈉溶液，滴加于堿性品紅乙醇溶液內(nèi)至深紅色再褪至淡紅色為止（不宜加多）。將此混合液全部加入已融化的貯備培養(yǎng)基內(nèi)，并充分混勻（防止產(chǎn)生氣泡）。立即將此培養(yǎng)基適量（約15mL ）傾入已滅菌的平皿內(nèi)，待冷卻凝固后，置于冰箱內(nèi)備用，但保存時間不宜超過兩周。 如培養(yǎng)基已由淡紅色變成深紅色， 則不能再用。4伊紅美培養(yǎng)基：貯備培養(yǎng)基的制備：于 2000mL 燒杯中，先將 20 30g 瓊脂加到 900mL 蒸餾水中，加熱溶解。再家人 2.0g 鄰酸二氫鉀及 10g 蛋白胨，混合使之溶解，用蒸餾水補(bǔ)充至 1000mL，調(diào)節(jié)溶液 pH 值為 7.2 7.4。趁熱用脫脂棉或絨布過濾，再加入 10g 乳糖，混勻

5、后定量分裝于 250mL 或 500mL 錐形瓶內(nèi)，于 121 高壓滅菌 15min，貯于冷暗處備用。第1頁共4頁平皿培養(yǎng)基的制備： 將上述制備的貯備培養(yǎng)基融化。根據(jù)錐形瓶內(nèi)培養(yǎng)基的容量，用滅菌吸管按比例分別吸取一定量已滅菌的 2%伊紅水溶液（ 0.4g 伊紅溶于 20mL水中）和一定量已滅菌的 0.5%美藍(lán)水溶液（ 0.065g 美藍(lán)溶于 13mL水中），加入已融化的貯備培養(yǎng)基內(nèi)，并充分混勻（防止產(chǎn)生氣泡） ，立即將此培養(yǎng)基適量傾入已滅菌的空平皿內(nèi)，待冷卻凝固后，置于冰箱內(nèi)備用。5革蘭氏染色劑：結(jié)晶紫染色液：將 20mL 結(jié)晶紫乙醇飽和溶液（稱取 48g 結(jié)晶紫溶于100mL95%乙醇中）和

6、 80mL 1%草酸銨溶液混合、過濾。該溶液放置過久會產(chǎn)生沉淀，不能再用。助染劑：將 1g 碘與 2g 碘化鉀混合后，加入少許蒸餾水，充分振蕩，待完全溶解后，用蒸餾水補(bǔ)充至 300mL。此溶液兩周內(nèi)有效。當(dāng)溶液由棕黃色變?yōu)榈S色時應(yīng)棄去。為易于貯備，可將上述碘與碘化鉀溶于 30mL蒸餾水中，臨用前再加水稀釋。脫色劑： 95%乙醇。復(fù)染劑：將 0.25g 沙黃加到 10mL95%乙醇中，待完全溶解后，加 90mL蒸餾水。五測定步驟1生活飲用水：初發(fā)酵試驗(yàn)：在兩個裝有已滅菌的 50mL三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的大試管或燒瓶中（內(nèi)有倒管） ，以無菌操作各加入已充分混勻的水樣 100mL。在 10 支

7、裝有已滅菌的 5mL三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管中（內(nèi)有倒管） ，以無菌操作加入充分混勻的水樣 10mL混勻后置于 37恒溫箱內(nèi)培養(yǎng) 24h。平板分離： 上述各發(fā)酵管經(jīng)培養(yǎng)24h 后，將產(chǎn)酸、產(chǎn)氣及只產(chǎn)酸的發(fā)酵管分別接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基或品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基上，置于37恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h，挑選符合下列特征的菌落：a伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上：深紫黑色，具有金屬光澤的菌落；紫黑色，不帶或略帶金屬光澤的菌落；淡紫紅色，中心色較深的菌落。b品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基上：紫紅色，具有金屬光澤的菌落；深紅色，不帶或略帶金屬光澤的菌落；淡紅色，中心色較深的菌落。取上述特征的群落進(jìn)行革蘭氏染色：a用以培養(yǎng) 1824h 的培養(yǎng)

8、物涂片，涂層要薄；b將涂片在火焰上加溫固定， 待冷卻后滴加結(jié)晶紫溶液， 1min 后用水洗去；c滴加助色劑， 1min 后用水洗去；d滴加脫色劑， 搖動玻片， 直止無紫色脫落為止 （約 2030s），用水洗去；e滴加復(fù)染劑， 1min 后用水洗去， 晾干、鏡檢，呈紫色者為革蘭氏陽性菌，呈紅色者為陰性菌。復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)： 上述涂片鏡檢的菌落如為革蘭氏陰性無芽孢的桿菌，則挑選該菌落的另一部分接種于裝有普通濃度乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管中（內(nèi)有倒管），每管可接種分離自同一初發(fā)酵管（瓶）的最典型菌落1 3 個，然后置于 37恒溫箱中培養(yǎng)24h，有產(chǎn)酸、產(chǎn)氣者（不論倒管內(nèi)氣體多少皆作為產(chǎn)氣論），即證實(shí)有大腸菌群

9、存在。根據(jù)證實(shí)有大腸菌群存在的陽性管（瓶）數(shù)查附表1“大腸菌群檢數(shù)表”，報告每升水樣中的大腸菌群數(shù)。2水源水于各裝有 5mL三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的5 個試管中（內(nèi)有倒管），分第2頁共4頁別加入 10mL水樣；于各裝有 10mL乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的 5 個試管中（內(nèi)有倒管），分別加入 1mL水樣；再于各裝有 10mL乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的 5 個試管中（內(nèi)有倒管），分別加入 1mL110 稀釋的水樣。共計 15 管，三個稀釋度。將各管充分混勻，置于 37恒溫箱內(nèi)培養(yǎng) 24h。平板分離和復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)的檢驗(yàn)步驟同“生活飲用水檢驗(yàn)方法” 。根據(jù)證實(shí)總大腸菌群存在的陽性管數(shù)，查附表 2“最可能數(shù)（ MPN）

10、表”，即求得每 100mL水樣中存在的總大腸菌群數(shù)。我國目前系以1L 為報告單位，故MPN值再乘以 10，即位 1L 水樣中的總大腸菌群數(shù)。例如，某水樣接種 10mL的 5 管均為陽性；接種 1mL的 5 管中有 2 管為陽性；接種 110 的水樣 1mL的 5 管均為陰性。從最可能數(shù)（MPN）表中查檢驗(yàn)結(jié)果520，得知 100mL水樣中的總大腸菌群數(shù)為49 個，故 1L 水樣中的總大腸菌群數(shù)為 49× 10=490 個。對污染嚴(yán)重的地表水和廢水，初發(fā)酵試驗(yàn)的接種水樣應(yīng)做 110、 1 100、 11000 或更高倍數(shù)的稀釋，檢驗(yàn)步驟同“水源水”檢驗(yàn)方法。如果接種的水樣量不是 10m

11、L、1mL和 0.1mL，而是較低或較高的三個濃度的水樣量，也可查表求得 MPN指數(shù)，再經(jīng)下面公式換算成每 100mL的 MPN值：10(mL)MPN 值MPN 指數(shù)接種量最大的一管(mL)附表 1大腸菌群檢數(shù)表接種水樣總量300mL（ 100mL2份， 10mL10份）100mL水量的陽性瓶數(shù)10mL水量的陽性管數(shù)0121L 水樣中大腸菌群數(shù)1L 水樣中大腸菌群數(shù)1L 水樣中大腸菌群數(shù)0<3411138182713273111838414245251830706223692727431208315116193660230104069>230第3頁共4頁附表 2最可能數(shù)（ MPN）

12、表（接種 5 份 10mL水樣、 5 份 1mL水樣、 5 份 0.1mL 水樣時，不同陽性及陰性情況下100mL水樣中細(xì)菌數(shù)的最可能數(shù)和95%可信限值）出現(xiàn)陽性份數(shù)每 100mL95%可信限出現(xiàn)陽性份數(shù)每 100mL水95%可信限水樣中細(xì)值樣中細(xì)菌值10mL1 mL管0.1菌數(shù)的最下限上10mL 1 mL0.1數(shù)的最可下上限管mL管可能數(shù)限管管mL 管能數(shù)限000<220171170012<0.5721071170102<0.5721192210204<0.51122092211002<0.57230123281014<0.51130081191104<0.515301112251116<0.515310112251206<0.515311144342005<0.513320144343211754652049171303301754652170231704001333152294282204011754653079251904101754653111031250411217635321403731041226978533180445004202276754013035300421269785411