高通量測序：第二代測序技術詳細介紹

1、在過去幾年里，新一代 DNA測序技術平臺在那些大型測序實驗室中迅猛發(fā)展，各種新技術猶如雨后春筍般涌現(xiàn)。之所以將它們稱之為新一代測序技術(next-generation sequencing ),是相對于傳統(tǒng)Sanger測序而言的。Sanger測序法一直以來因可靠、準確，可以產(chǎn)生長的讀長而被廣泛應用，但是它的致命缺陷是相當慢。十三年，一個人類基因組，這顯然不是理想的速度，我們需要更高通量的測序平臺。此時，新一代測序技術應運而生，它們利用大量并行處理的能力讀取多個短 DNA片段，然后拼接成一幅完整的圖畫。Sanger測序大家都比較了解，是先將基因組 DNA片斷化，然后克隆到質粒載體上，再轉化大腸桿

2、菌。 對于每個測序反應，挑出單克隆，并純化質粒DNA。每個循環(huán)測序反應產(chǎn)生以 ddNTP終止的，熒光標記的產(chǎn)物梯度，在測序儀的 96或384毛細管中進行高分辨率的電泳分離。當不同分子量的熒光標記片斷 通過檢測器時，四通道發(fā)射光譜就構成了測序軌跡。在新一代測序技術中，片斷化的基因組DNA兩側連上接頭，隨后運用不同的步驟來產(chǎn)生幾百萬個空間固定的PCR克隆陣列(polony)。每個克隆由單個文庫片段的多個拷貝組成。之后進行引物雜交和酶延伸反 應。由于所有的克隆都是系在同一平面上，這些反應就能夠大規(guī)模平行進行。同樣地，每個延伸所摻入的熒光標記的成像檢測也能同時進行，來獲取測序數(shù)據(jù)。酶拷問和成像的持續(xù)反

3、復構成了相鄰的測序閱讀片段。DNA fragmentationIn vivo cloning and amplificationIn vitro adaptor liqationCycle sequencingGACTAGATACGAGCG TGA -S (tempi ale)Generation cf poloiiy arriyPolymerase dNTPsLabeled ddNTPsO (primed .CTGATCrj CTGATCT .CTGATCTA； .CTGATCTAT 尸. .XTGATCTATG -j .CTGATCTATGC 金、 .CTGATCTATGCT '

4、CTGATC7ATGCTC .CTGATCTATGCTCG /Electrophorsesis(1 rencLk口pilkii v，Cyclic array sequencing(:>1。6 reads/arrayCycle 1Cycle 2 Cycle 3Solexa高通量測序原理a,VAGC區(qū)鐘VJg-tTRTCJV系G -S -回gT1. FL1 /麻P-blocker) + FL2"dGTP4Hodfer)十 FL34CTP-ibkdwj + FL4-dTTP- WocXer)2. FluOfficenr imaging in lotJr3. Clw*nisRy dea

5、n碑 labtite and )ttdnwfr豈 sictatnKKCCXh-采用大規(guī)模并行合成測序法 (SBS, Sequencing-By-Synthesis)和可逆性末端終結技術(Reversible Terminator Chemistry)-可減少因二級結構造成的一段區(qū)域的缺失。- 具有高精確度、高通量、高靈敏度和低成本等突出優(yōu)勢-可以同時完成傳統(tǒng)基因組學研究(測序和注釋)以及功能基因組學(基因表達及調控，基因功能，蛋白/核酸相互作用)研究- 將接頭連接到片段上，經(jīng)PCR擴增后制成 Library。- -隨后在含有接頭(單鏈引物)的芯片(flow cell )上將已加入接頭的 DNA

6、片段變成單鏈后通過與單 鏈引物互補配對綁定在芯片上，另一端和附近的另外一個引物互補也被固定，形成“橋”- 一經(jīng)30倫擴增反應，形成單克隆DNA簇- -邊合成邊測序(Sequencing By Synthesis )的原理，加入改造過的 DNA聚合酶和帶有4種熒光標記 的dNTPo這些dNTP是“可逆終止子"，其3'羥基末端帶有可化學切割的基團，使得每個循環(huán)只能摻 入單個堿基。此時，用 激光掃描反應板表面，讀取每條模板序列第一輪反應所聚合上去的核甘酸種類。之后，將這些基團化學切割，恢復3端粘性，繼續(xù)聚合第二個核甘酸。如此繼續(xù)下去，直到每條模板序列都完全被聚合為雙鏈。這樣，統(tǒng)計每

7、輪收集到的熒光信號結果，就可以得知每個模板DNA片段的序列。目前的配對末端讀長可達到 2X50 bp,更長的讀長也能實現(xiàn)，但錯誤率會增高。讀長會受到多個引起信號衰 減的因素所影響，如熒光標記的不完全切割。Roche 454測序技術"一個片段 = 一個磁珠 = 一條讀長(One fragment =One bead = One read)1）樣品輸入并片段化： GS FLX系統(tǒng)支持各種不同來源的樣品，包括基因組DNA、PCR產(chǎn)物、BAC、cDNA、小分子RNA等等。大的樣品例如基因組 DNA或者BAC等被打斷成300800 bp的 片段；對于小分子的非編碼 RNA或者PCR擴增產(chǎn)物，這

8、一步則不需要。短的 PCR產(chǎn)物則可以直接跳到 步驟3）。2）文庫制備：借助一系列標準的分子生物學技術，將A和B接頭（3'和5'端具有特異性）連接到DNA片段上。接頭也將用于后續(xù)的純化，擴增和測序步驟。具有A、B接頭的單鏈DNA片段組成了樣品文庫。3） 一個DNA片段=一個磁珠：單鏈 DNA文庫被固定在特別設計的 DNA捕獲磁珠上。每一個磁珠攜帶 了一個獨特的單鏈 DNA片段。磁珠結合的文庫被擴增試劑乳化，形成油包水的混合物，這樣就形成了只 包含一個磁珠和一個獨特片段的微反應器。4）乳液PCR擴增：每個獨特的片段在自己的微反應器里進行獨立的擴增，而沒有其他的競爭性或者污染 性序列

9、的影響。整個片段文庫的擴增平行進行。 對于每一個片段而言，擴增后產(chǎn)生了幾百萬個相同的拷貝。隨后，乳液混合物被打破，擴增的片段仍然結合在磁珠上。5）一個磁珠=一條讀長：攜帶DNA的捕獲磁珠隨后放入 PTP板中進行后名的測序。PTP孔的直徑（29um） 只能容納一個磁珠（20um）。然后將PTP板放置在GS FLX中，測序 開始。放置在四個單獨的試劑瓶里 的四種堿基，依1同T、A、C、G的順序依次循環(huán)進入 PTP板，每次只進入一個堿基。 如果發(fā)生堿基配對， 就會釋放一個焦磷酸。這個焦磷酸在ATP硫酸化酶和螢光素酶的作用下，經(jīng)過一個合成反應和一個化學發(fā) 光反應，最終將螢光素氧化成氧化螢光素，同時釋放

10、出光信號。此反應釋放出的光信號實時被儀器配置的 高靈敏度CCD捕獲到。有一個堿基和測序模板進行配對，就會捕獲到一分子的光信號；由此一一對應， 就可以準確、快速地確定待測模板的堿基序列。這也就是大名鼎鼎的焦磷酸測序。6) 數(shù)據(jù)分析：GS FLX 系統(tǒng)在 10 小時的運行當中可獲得100 多萬個讀長，讀取超過4-6 億個堿基信息。GS FLX 系統(tǒng)提供兩種不同的生物信息學工具對測序數(shù)據(jù)進行分析，適用于不同的應用：達400 MB 的從頭拼接和任何大小基因組的重測序。GS FLX 系統(tǒng)的準確率在99% 以上。其主要限制來自同聚物，也就是相同堿基的連續(xù)摻入，如 AAA 或GGG 。由于沒有終止元件來阻止

11、單個循環(huán)的連續(xù)摻入，同聚物的長度就需要從信號強度中推斷出來。這個過程就可能產(chǎn)生誤差。因此，454 測序平臺的主要錯誤類型是插入 -缺失，而不是替換。ABI SOLID 測序技術a. 文庫制備SOLiD 系統(tǒng)能支持兩種測序模板：片段文庫(fragment library) 或配對末端文庫(mate -pairedlibrary) 。使用哪一種文庫取決于你的應用及需要的信息。片段文庫就是將基因組DNA 打斷， 兩頭加上接頭，制成文庫。如果你想要做轉錄組測序、RNA 定量、 miRNA 探索、重測序、3 , 5 -RACE 、甲基化分析、 ChIP 測序等，就可以用它。如果你的應用是全基因組測序、S

12、NP 分析、結構重排/拷貝數(shù)，則需要用配對末端文庫。配對末端文庫是將基因組DNA 打斷后，與中間接頭連接，再環(huán)化，然后用EcoP15 酶切，使中間接頭兩端各有27bp 的堿基，再加上兩端的接頭，形成文庫。b. 乳液 PCR/ 微珠富集在微反應器中加入測序模板、PCR 反應元件、微珠和引物，進行乳液PCR( Emulsion PCR ) 。 PCR 完成之后，變性模板，富集帶有延伸模板的微珠，去除多余的微珠。微珠上的模板經(jīng) 過 3 修飾，可以與玻片共價結合?？吹竭@里，是不是有一種似曾相識的感覺呢？那就對了，此步驟與 454 的 GS FLX 基本相同。不過SOLiD 系統(tǒng)的微珠要小得多，只有1

13、um 。 乳液 PCR 最大的特點是可以形成數(shù)目龐大的獨立反應空間以進行DNA 擴增。 其關鍵技術是 “注水到油”， 基本過程是在PCR反應前，將包含PCR 所有反應成分的水溶液注入到高速旋轉的礦物油表面，水溶液瞬間形成無數(shù)個被礦物油包裹的小水滴。這些小水滴就構成了獨立的 PCR 反應空間。理想狀態(tài)下，每個小水滴只含一個DNA模板和一個P1 磁珠，由于水相中的 P2 引物和磁珠表面的P1 引物所介導的PCR 反應，這個DNA 模板的拷貝數(shù)量呈指數(shù)級增加，PCR 反應結束后，P1 磁珠表面就固定有拷貝數(shù)目巨大的同來源DNA 模板擴增產(chǎn)物。c. 微珠沉積3 修飾的微珠沉積在一塊玻片上。在微珠上樣的

14、過程中，沉積小室將每張玻片分成1 個、 4個或8 個測序區(qū)域。SOLiD 系統(tǒng)最大的優(yōu)點就是每張玻片能容納更高密度的微珠，在同一系統(tǒng)中輕松實現(xiàn)更高的通量。d. 連接測序這一步可就是SOLiD 的獨門秘笈了。它的獨特之處在于沒有采用慣常的聚合酶，而用了連接酶。 SOLiD 連接反應的底物是8 堿基單鏈熒光探針混合物。連接反應中，這些探針按照堿基互補規(guī)則與單鏈 DNA 模板鏈配對。探針的5末端分別標記了 CY5、 Texas Red 、 CY3、 6-FAM 這 4 種顏色的熒光染料。探針3'端15位為隨機堿基，可以是 ATCG四種堿基中 的任何一種堿基，其中第 1、2位構成的堿基對是表征

15、探針染料類型的編碼區(qū)，下圖的雙堿基編碼矩陣規(guī)定了該編碼區(qū)16 種堿基對和4 種探針顏色的對應關系，而 35位的“n”表示隨機堿基，68位的“z”指的是 可以和任何堿基配對的特殊堿基 。G單向SOLiD測序包括五輪測序反應，每輪測序反應含有 多次連接反應。第一輪測序的第一 次連接反應由連接引物“r#導，由于每個磁珠只含有均質單鏈DNA模板，所以這次連接反 應摻入一種8堿基熒光探針，SOLiD測序儀記錄下探針第 1、2位編碼區(qū)顏色信息，隨后的化學處理斷裂探針 3'端第5、6位堿基間的化學鍵，并除去 68位堿基及5'末端熒光基團，暴露探針第5位堿基5'磷酸，為下一次連接反應作

16、準備。因為第一次連接反應使合成鏈多了 5個堿基，所以第二次連接反應得到模板上第6、7位堿基序列的顏色信息，而第三次連接反應得到的是第11、12位堿基序列的顏色信息 iiinTTi 0Md yluimiimiHiiiiiiiimiiimiiHiiAdapcr S«cuenc«Taffies SocuencefrrftCr行卅加郎山11111山WII1山山11山一Adapri Secwwkm亞為Sec曲pelacnr Socucnco幾個循環(huán)之后，引物重置，開始第二輪的測序。由于第二輪連接引物n-1比第一輪錯開一位， 所以第二輪得到以0, 1位起始的若干堿基對的顏色信息。 五輪

17、測序反應反應后，按照第0、1位，第1、2位 的順序把對應于模板序列的顏色信息連起來，就得到由“0, 1, 2, 3” 組成的SOLiD原始顏色序列。Umwul pfifnwUnvtntl »q pnn«f md)91MHUOUnvtrul uq Dnmetn-2)UfHwrsiltt4 prifwr En-3|tralaeqprvTitrliMJe.數(shù)據(jù)分析SOLiD測序完成后，獲得了由顏色編碼組成的 SOLiD原始序列。理論上來說，按照“雙堿基 編碼矩陣”， 只要知道所測 DNA序列中任何一個位置的堿基類型，就可以將SOLiD原始顏色序列“解碼”成堿基序列。但由于雙堿基編

18、碼規(guī)則中雙堿基與顏色信息的簡并特性（一種顏 色對應4種堿基對），前面堿基的顏 色編碼直接影響緊跟其后堿基的解碼，所以一個錯誤顏色編碼就會引起“連鎖解碼錯誤"，改變錯誤顏色編碼之后的所有堿基。和其它所有測序儀一樣，測序錯誤在所難免，關鍵是對測序錯誤的評價和后續(xù)處理。 由于SOLiD系統(tǒng)采用了雙堿基編碼技術，在測序過程中對每個堿基判讀兩遍，從而減少原始數(shù)據(jù)錯誤，提供內在的校對功能。這樣，雙保險確保了 SOLiD系統(tǒng)原始堿基數(shù)據(jù)的準確度大于99.94% ,而在15X覆蓋率時的準確度可以達到 99.999% ,是目前新一代基因分析技術中準確度最高的。為避免“連鎖解碼錯誤”的發(fā)生，SOLiD數(shù)據(jù)分析軟件不直接將 SOLiD原始顏色序列解碼成 堿基序列，而是依靠reference序 列進行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。SOLiD序列分析軟件首先根據(jù)“雙堿基編碼矩陣”把 reference堿基序列轉換