試驗(yàn)基礎(chǔ)知識(shí)細(xì)胞因子

1、一、TNF-腫瘤壞死因子Tumor Necrosis Factor , TNF可分為TNF “和TNF3兩種，前者來自單核 巨噬細(xì)胞，后者由活化 T細(xì)胞產(chǎn)生，是具有重要生物活性的細(xì)胞因子。存在于細(xì)胞上的TNF受體主要有兩種： TNFR!和TNFRI ,血清中存在白是可溶性的TNFRs TNFRt , s TNFRI,它們的相互作用不僅對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有細(xì)胞毒作用，還與炎癥和發(fā)熱反響、關(guān)節(jié)炎、敗血癥與多發(fā)性硬化等疾病有密切關(guān)系。1TNF-a是一種單核因子， 主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，LPS是較強(qiáng)的刺激劑。IFN-丫、M-CSF GM-CSF寸單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生 TNF-a有刺激作用，而PG

2、E如此有抑制作用。 前單核細(xì)胞系U937、前髓細(xì)胞系HL-60在PMAJ激下可產(chǎn)生較高水平的 TNF-a。 T淋巴細(xì) 胞、T細(xì)胞雜交瘤、T淋巴樣細(xì)胞系以 NK細(xì)胞等在PM碑U激下也可分泌 TNF-a。SAC PMA 抗IgM可刺激正常B細(xì)胞產(chǎn)生TNF-a。此外，中性粒細(xì)胞、LAK星狀細(xì)胞、皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞亦可產(chǎn)生 TNF-a。2TNF-3是一種淋巴因子，抗原和絲裂原均可刺激T淋巴細(xì)胞分泌 TNF-3。 PMA刺激RPMI1788B淋巴母細(xì)胞可分泌高水平TNF-3。1TNF-R的分型：TNF-R可分為兩型：I型 TNF-R, 55kDa, CD120a, 439氨基酸殘基，此 型受體可能在溶細(xì)

3、胞活性上起主要作用；n型TNF-R, 75kDa CD120b, 426氨基酸殘基，此型受體可能與信號(hào)傳遞和 T細(xì)胞增殖有關(guān)。兩型TNF-R均包括胞膜外區(qū)、穿膜區(qū)和胞漿區(qū)三 個(gè)局部，胞膜外區(qū)有 28%勺同源，但在有包漿區(qū)無同源性，可能與介導(dǎo)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 有關(guān)。TNF-R屬于神經(jīng)生長因子受體 NGFR超家族。TNF-a和TNF-3的受體可能是同一的。 TNF-R存在于多種正常與腫瘤細(xì)胞外表，一般每個(gè)細(xì)胞受體數(shù)目有103104,如ME-180腫瘤細(xì)胞系TNF-aR約2000/個(gè)細(xì)胞，Kd為2*10-10M。不同細(xì)胞外表 TNF-aR的數(shù)目和親和 力似乎與細(xì)胞對(duì) TNF- a的敏感性并不平行。

4、TNF- a與相應(yīng)受體結(jié)合后信號(hào)傳遞的機(jī)理尚不清楚，可能與活化蛋白激酶CPKO,催化受體蛋白磷酸化有關(guān)。2可溶性 TNFR TNF結(jié)合蛋白TNF-BP是TNFR勺可溶性形式，有 sTNf RI TNF-BPI 和sTNFRnTNF-BPH兩種。一般認(rèn)為 sTNFR具有局限TNF活性，或穩(wěn)定 TNF的作用，在 細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中有重要的調(diào)節(jié)作用。Seckiner 1988年發(fā)現(xiàn)發(fā)熱患者尿中有 TNF抑制物，分子量為33kDa。Olsson 1989年在慢性腎功不全患者血和尿中也發(fā)現(xiàn)有TNF-BP。TNF-BP可與TNF特異結(jié)合，抑制TNF活性，如抑制其細(xì)胞毒活性和誘導(dǎo)IL-1產(chǎn)生，可促進(jìn)皮下接種 M

5、ethA肉毒的生長，可見于正常妊娠尿中。 炎癥、毒素血癥、腦膜炎雙球菌感染、SLE HIV感染、 腎功不全時(shí)以與腫瘤時(shí)可升高?？扇苄訲NFR可有效地減輕佐劑性關(guān)節(jié)炎的病理改變以與敗血癥休克。TNF- a與TNF-3的生物學(xué)作用極為相似，這可能與分子結(jié)構(gòu)的相似性和受體的同一性有關(guān)。但有某些生物學(xué)作用方面也有不同之處。1殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞：TNF在體、體外均能殺死某些腫瘤細(xì)胞 cytolytic action) ,或抑制增殖作用cytostatic action。腫瘤細(xì)胞株對(duì) TNF-“敏感性有很大的差異， TNF-“對(duì)極少數(shù)腫瘤細(xì)胞甚至有刺激作用。用放線菌素D絲裂霉素 C放線菌酮等處理腫瘤細(xì)胞如

6、小鼠成纖維細(xì)胞株L929可明顯增強(qiáng)TNF-“殺傷腫瘤細(xì)胞活性。體腫瘤對(duì)TNF-”的反響也有很大的差異，與其體外細(xì)胞株對(duì)TNF-”的敏感性并不平行。同一細(xì)胞系可能有敏感株和抵抗株如 L929-S和L929-R。此外，靶細(xì)胞源性 TNF的表達(dá)可能會(huì)使細(xì)胞抵抗外源性 TNF的細(xì)胞毒作用，因此，通過誘導(dǎo)或抑制源性TNF的表達(dá)可改變細(xì)胞對(duì)外源性TNF的敏感性。巨噬細(xì)胞膜結(jié)合型 TNF可能參與對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用。TNF殺傷腫瘤的機(jī)理還不十分清楚，與補(bǔ)體或穿孔素perforin）殺傷細(xì)胞相比，TNF殺傷細(xì)胞沒有穿孔現(xiàn)象，而且殺傷過程相比照擬緩慢。TNF殺傷腫瘤組織細(xì)胞可能與以下機(jī)理有關(guān)。直接殺傷或抑制作用：

7、TNF與相應(yīng)受體結(jié)合后向細(xì)胞移，被靶細(xì)胞溶酶體攝取導(dǎo)致溶酶體 穩(wěn)定性降低，各種酶外泄，引起細(xì)胞溶解。也有認(rèn)為TNFNB活磷脂酶A2,釋放超氧化物而引起DNAM裂，磷脂酶 A2抑制劑可降低 TNF的抗病效應(yīng)。TNF可或改變靶細(xì)胞糖代謝，使 細(xì)胞pH降低，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。通過TNF對(duì)機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)T細(xì)胞與其它殺傷細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷。TNF作用于血管皮細(xì)胞，損傷皮細(xì)胞或?qū)е卵芄δ芪蓙y，使血管損傷和血栓形成，造成 腫瘤組織的局部血流阻斷而發(fā)生出血、缺氧壞死。2提高中性粒細(xì)胞的吞噬能力，增加過氧化物陰離子產(chǎn)生，增強(qiáng) ADCC功能，刺激細(xì)胞脫顆粒和分泌髓過氧化物酶。TNF預(yù)先與皮細(xì)胞培養(yǎng)可

8、使其增加MHQ類抗原、ICAM-1的表達(dá)，IL-1、GM-CS林口 IL-8的分泌，并促進(jìn)中性粒細(xì)胞粘附到皮細(xì)胞上，從而刺激機(jī)體局部 炎癥反響，TNF-“的這種誘導(dǎo)作用要比 TNF-3為強(qiáng)。TNF刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌IL-1 ,并調(diào)節(jié)NHQ!類抗原的表達(dá)。3抗感染：如抑制瘧原蟲生長，抑制病毒復(fù)制如腺病毒H型、皰疹病毒H型，抑制病毒蛋白合成、病毒顆粒的產(chǎn)生和感染T并可殺傷病毒感染細(xì)胞。TNF抗病毒機(jī)理不十分清楚。4TNF是一種源性熱原質(zhì)，引起發(fā)熱，并誘導(dǎo)肝細(xì)胞急性期蛋白的合成。TNF引起發(fā)熱可能是通過直接刺激下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞和刺激巨噬細(xì)胞釋放IL-1而引起，還可通過IL-1、TNF-a刺

9、激其它細(xì)胞產(chǎn)生 IL-6。5促進(jìn)髓樣白血病細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化 ，如促進(jìn)髓樣白血病細(xì)胞 ML-1、單核細(xì)胞白血病 細(xì)胞U937、早幼粒白血病細(xì)胞 HL60的分化，機(jī)理不清楚。TGF-3可抑制TNF-a多種生物學(xué) 活性，但不抑制 TNF-a對(duì)髓樣白血病細(xì)胞分化的誘導(dǎo)作用，甚至還有協(xié)同效應(yīng)。6促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化：TNF促進(jìn)T細(xì)胞NHCI類抗原表達(dá)，增強(qiáng)IL-2依賴的胸腺細(xì)胞、 T細(xì)胞增殖能力，促進(jìn)IL-2、CSF和IFN- 丫等淋巴因子產(chǎn)生， 增強(qiáng)有絲分裂原或外來抗原刺 激B細(xì)胞的增殖和Ig分泌。TNF-a對(duì)某些腫瘤細(xì)胞具有生長因子樣作用，并協(xié)同EGF PDGF和胰島素的促增殖作用，促進(jìn)EGF受體表

10、達(dá)。TNF也可促進(jìn)c-myc和c-fos等與細(xì)胞增殖密切相關(guān)原癌基因的表達(dá)，引起細(xì)胞周期由Go期向G1期轉(zhuǎn)變。最近報(bào)道INF- 3 LT是EB病毒轉(zhuǎn)化淋巴母細(xì)胞的自分泌生長因子，抗LT抗體、sTNf R以與TNF-a能抑制EB病毒轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞的增殖。IL-1、IFN- 丫和GM-CSF寸TNF的生物學(xué)作用有明顯的增強(qiáng)作用，可能與增加細(xì)胞TNF受體的表達(dá)有關(guān)。已報(bào)道一種抗TNF-a單克隆抗體，可模擬 TNF-a的某些生物學(xué)作用，這種現(xiàn) 象在其它因子中還尚未見到。IFN- T973年Younger和Sakin發(fā)現(xiàn)來自淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中存在一種IFN,但抗原性不同于發(fā)現(xiàn)的IFN,遂命名H型IFN,

11、1980年統(tǒng)一命名為丫干擾素。 誘導(dǎo)口引喋胺2, 3-雙加氧酶的合成。1IFN- 丫可，后者參與色氨酸分解代謝，使色氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槿虬彼?，使血液中色氨酸的水?下降，可能與出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀有關(guān)。IFN- 丫誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞可誘導(dǎo)性一氧化氮合酶iNOS產(chǎn)生，促進(jìn) NO的合成，IFN- 丫還可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞星形細(xì)胞的iNOS產(chǎn)生，可能與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的某些疾病的發(fā)生或保護(hù)作用有關(guān)。IFN在完全沒有毒素時(shí)不能刺激IL-1轉(zhuǎn)錄，反而在轉(zhuǎn)錄水平抑制IL-1自身誘導(dǎo)的IL-1產(chǎn)生，但I(xiàn)FN- 丫可增加LPS誘導(dǎo)的IL-1轉(zhuǎn)錄翻譯和分泌。bcl-2B淋巴細(xì)胞瘤-2基因簡稱bcl-2 B-cell lymphoma-

12、2，是細(xì)胞凋亡研究中最受重視的癌基 因之一。自從1972年Kerr提出細(xì)胞凋亡apoptosis的概念至今，人們對(duì)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象 進(jìn)展了廣泛、深入的研究。但是，凋亡的分子和生化機(jī)制迄今尚未徹底明了，而已形成的初 步認(rèn)識(shí)大多源于對(duì) Bcl-2基因家族的研究。，凋亡進(jìn)程可分為三個(gè)時(shí)相：誘導(dǎo)期，效應(yīng)期和 降解期。在誘導(dǎo)期，細(xì)胞承受各種信號(hào)從而引發(fā)各種不同的效應(yīng)；進(jìn)入效應(yīng)期后，經(jīng)過一些決定細(xì)胞命運(yùn)存活/死亡的分子調(diào)控點(diǎn)，細(xì)胞進(jìn)入不可逆的程序化死亡，這些調(diào)控分子 包括一系列原癌基因和抑制癌基因的產(chǎn)生，其中Bcl-2家族起著決定性的作用；降解期如此產(chǎn)生可見的凋亡現(xiàn)象。Bcl-2基因即B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2

13、基因是一種原癌基因，它具有抑制凋亡的作用， 并且近年來的一些研究已開始揭示這一作用的機(jī)制。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的Bcl-2蛋白家族按功能可分為兩類，一類是像Bcl-2 一樣具有抑制凋亡作用，如哺乳動(dòng)物的Bcl-XL、Bcl-W、Mcl-1、A1、線蟲Ced-9、牛痘病毒E1B119kD等，而另一類具有促進(jìn)凋亡作用，如Bax、Bcl-Xs、Bax、Bak、Bik/Nbk、Bid 和 Harakiri 。最初在血液淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Bcl-2能抑制細(xì)胞死亡，隨后陸續(xù)在其它一些細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)Bcl-2的這種作用。但近年來研究發(fā)現(xiàn)，除這些之外尚存在Bcl-2不敏感的凋亡途徑。敏感凋亡Bcl-2可以抑制由多種細(xì)胞毒因

14、素所引起的細(xì)胞死亡。Bcl-2的過度表達(dá)能增強(qiáng)所觀察細(xì)胞對(duì)大多數(shù)細(xì)胞毒素的抵抗性。這一發(fā)現(xiàn)使人們認(rèn)識(shí)到凋亡的各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有一個(gè)共同的 通路或交匯點(diǎn)，而該通路或交匯點(diǎn)受Bcl-2調(diào)節(jié)。實(shí)驗(yàn)明確，Bcl-2可增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)大多數(shù)DNA損傷因子的抵抗性，抑制大多數(shù)化療藥物所引起的靶細(xì)胞凋亡，但其本身并不能抑制這些因素對(duì)細(xì)胞的損傷；同樣地，它也不能促進(jìn) DNA啰復(fù)。p53蛋白是DNA傷的一個(gè)分子傳感器， 已證實(shí)Bcl-2能抑制p53介導(dǎo)的凋亡，但不能抑制p53向核轉(zhuǎn)位或者p53介導(dǎo)的生長停滯，可能Bcl-2的作用是在DNA員傷后，阻止激活凋亡機(jī)制的信號(hào)到達(dá)其靶分子；在細(xì)胞毒性T細(xì)胞中，由顆粒酶 B激活

15、Caspases家族的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸蛋白酶所誘導(dǎo)的凋亡不依賴 于Bcl-2 ,顆粒酶B可能僅作用于凋亡路徑中Bcl-2調(diào)節(jié)位點(diǎn)的下游。以上結(jié)果明確在凋亡途徑中Bcl-2的作用位點(diǎn)是在信號(hào)分子和效應(yīng)蛋白酶之間的位置。Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡可能與其以下幾種作用有關(guān)： 細(xì)胞催抗氧化作用以往研究明確，在去除生長因子所誘發(fā)的凋亡中，活性氧損傷ROS是促發(fā)細(xì)胞死亡的主要誘因：Bcl-2的過度表達(dá)可減少氧自由基的產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化物的形 成。提示Cai等4的實(shí)驗(yàn)明確Bcl-2的抗氧化作用是間接的，即可能在于抑制超氧陰離子 的產(chǎn)生而不是直接去除活性氧。細(xì)胞色素ccytochrome c, Cyt c 作為呼

16、吸鏈中重要的電子傳遞體，它從線粒體膜上的釋放會(huì)阻斷電子向下游傳遞體危與呼吸鏈的功能并導(dǎo)致超氧 陰離子的加速產(chǎn)生；而Bcl-2可以抑制Cyt c的釋放，從而抑制了超氧陰離子的產(chǎn)生。此外，Bcl-2還可以增加胞的谷胱甘肽GSH等抗氧化劑，升高 NAD/NADH勺比值，抑制和凋亡相 聯(lián)系的GSH條低，促進(jìn)GSHS入核，從而影響細(xì)胞的氧化復(fù)原狀態(tài)。但也有證據(jù)明確，在沒有自由基的情況下 Bcl-2也能抑制凋亡。因此，Bcl-2的性質(zhì)遠(yuǎn)非僅僅是一種抗氧化劑。抑制鈣離子跨膜流動(dòng)Lam等曾報(bào)道鈣泵特異性抑制劑ThapsigargenTG誘導(dǎo)的WEH17.2等細(xì)胞的凋亡可被 Bcl-2所抑制，其原因是 Bcl-

17、2抑制了 Ca2的跨膜流動(dòng)，提 示Bcl-2可 通過調(diào)節(jié)胞鈣離子濃度來調(diào)節(jié)凋亡。然而Wei等在神經(jīng)元細(xì)胞 GT1-7中發(fā)現(xiàn)Bcl-2中發(fā)現(xiàn)Bcl-2可抑制由TG所誘導(dǎo)的凋亡，但并不能抑制TG誘導(dǎo)的胞鈣離子濃度升高；同時(shí) Jason等6在中國倉鼠卵巢細(xì)胞 5AHSmy沖去除細(xì)胞貯存Ca2+后發(fā)現(xiàn)過度表達(dá)的 Bcl-2仍可抑制 凋亡，提示Bcl-2對(duì)胞Ca2+濃度的調(diào)節(jié)作用也只能是其抑制凋亡的機(jī)制之一。離子通道蛋白和吸附/錨定蛋白最近Reed7提出Bcl-2蛋白可能具有雙重功能：離子通道蛋白和吸附/錨定蛋白，提出Bcl-2抑制凋亡的局部新機(jī)制。-1離子通道蛋白 體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Bcl-2、Bcl-X

18、1和Bax能在線粒體上形成離子通道，提 示它們可能參與調(diào)節(jié)一些與凋亡有關(guān)的細(xì)胞現(xiàn)象，如線粒體通透性改變巨孔形成和線粒體釋放凋亡蛋白本科激活因子一一Cyt c和凋亡誘導(dǎo)因子AIF。過度表達(dá)的Bcl-2能抑制線粒體通透性改變，并影響巨孔的形成，從而抑制凋亡。但也有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)即使線粒體通透性 未改變，Cyt c等凋亡激蛋白也可以釋放到胞液中從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡，因此這種觀點(diǎn)還有待 進(jìn)一步證實(shí)。在所觀察的細(xì)胞系與多種情況下，凋亡的發(fā)生都伴有Cyt c從線粒體釋放，繼而伴有Caspases激活，而活化的Caspases降解底物后，其蛋白降解產(chǎn)物又引起線粒體通透性改變， 并最終導(dǎo)致凋亡發(fā)生。Yang等與Kluc

19、k等發(fā)現(xiàn)Bcl-2可以通過抑制線粒體釋放Cyt c來抑制凋亡，繼而Rosse等和Zhivotovsky 等用兩種不同的方法證明了即使Cyt c已經(jīng)釋放入胞漿，Bcl-2仍能延遲細(xì)胞死亡，這是由于 Bcl-2抑制了活化的 Caspases對(duì)線粒體釋放的上 游和下游都有Bcl-2調(diào)節(jié)凋亡的作用點(diǎn)。AIF作為一種線粒體來源的效應(yīng)蛋白酶，在別離在胞核中能誘導(dǎo)凋亡，同時(shí)還能激發(fā)線粒體 通透性改變，誘導(dǎo)線粒體釋放Cyt c和Caspase-9,并在體外切割和激活其底物半胱氨酸蛋白酶CPP32體外研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2過度表達(dá)可能阻止 AIF從別離的線粒體上釋放，但 它并能影響AIF的產(chǎn)生，同時(shí)也不能影響AI

20、F促凋亡的功能。-2吸附/錨定蛋白 在正常，f#況下 Bcl-2通過其C端疏水殘基的伸展而錨定在細(xì)胞膜上， 作為吸附/錨定蛋白，可把胞液蛋白固定在膜邊，或是引導(dǎo)胞液蛋白與別的膜蛋白相互作用。Bcl-2 可與 Bcl-2 家族的 Bcl-X1、Bcl-Xs、Bax、Bcl-2、Bad 和 Mc1-1 形成同源的蛋白二聚 體，而特定的蛋白二聚體如此可作為在細(xì)胞死亡信號(hào)通路上的分子開關(guān)。例如，Bcl-2可與促凋亡Bax形成二聚體，如果 Bax相對(duì)量高于Bcl-2 ,如此Bax同二聚體的數(shù)量增多，從而 促進(jìn)細(xì)胞死亡；而如果Bcl-2相對(duì)量高于Bax,如此促進(jìn)形成 Bcl-2/Bax異二聚體，并使Bcl

21、-2 同二聚體的量增多，從而抑制細(xì)胞死亡；而促凋亡分子和Bad和Bcl-Ss如此競爭結(jié)合細(xì)胞死亡抑制分子如 Bcl-X1或Bcl-2 ,由此替換了 Bax并促進(jìn)Bax同二聚體形成，誘導(dǎo)凋亡。另外，Bcl-2還可與Bcl-2家族外的11種蛋白質(zhì)結(jié)合，包括蛋白激酶 Raf-1、蛋白磷酸酶 Calcineurin 、GTP酶、R-Ras 和 H-Ras、p53-BP2、骯蛋白 Pr-1、Ced-4、BAG-1、Nip-1、Nip-2 和Nip-3 ,并由此實(shí)現(xiàn)其抗凋亡作用。不敏感Bcl-2抑制凋亡的作用并不是萬能的，例如在細(xì)胞毒T細(xì)胞殺傷作用中，特定的淋巴因子撤離以與某些TNF受體家族介導(dǎo)的凋亡途徑

22、中Bcl-2不能抑制凋亡，其原因右能是這些凋亡誘導(dǎo)劑作用于Bcl-2下游或是獨(dú)立于Bcl-2的其它凋亡路徑。最近 Scaffidi 等發(fā)現(xiàn)，Jurkat 等細(xì)胞n型細(xì)胞中 Bcl-2可抑制TNF受體家族中的CD95Apo-1/Fas信號(hào)通路介導(dǎo)的 凋亡，而在SKW6.4等細(xì)胞I型細(xì)胞中 Bcl-2如此不能抑制這種信號(hào)通路介導(dǎo)的凋亡。 其結(jié)果明確，凋亡途徑對(duì)Bcl-2敏感與否可能與細(xì)胞類型有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這種差異取決于線粒體是否參與這種凋亡途徑，在I型 細(xì)胞中線粒體如此未參與該凋亡途徑。因此,Bcl-2可能只抑制依賴于線粒體的凋亡途徑。更進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，來源于牛痘病毒的細(xì)胞因子應(yīng)答修飾體A

23、crmA是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑serpin類分子，能抑制一些 Caspases的功能。而來源于桿狀病毒的P35蛋白也能抑制一些Caspases的功能，而且它比 CrmA具有更廣泛的Caspases抑制特性。在組織培 養(yǎng)體系中或轉(zhuǎn)基因鼠的T淋巴細(xì)胞中CrmA表達(dá)能抑制 CD95 Fas/Apo-1和p55TNF受體I誘發(fā)的凋亡，但對(duì)另一些諸如生長因子撤除，DNAg傷等細(xì)胞毒因素引起的凋亡如此無能為力，而這些由細(xì)胞毒因素引起的凋亡現(xiàn)象如此可被Bcl-2與其同系物所抑制，但是Bcl-2又不能抑制由CD95Fas/Apo-1和TNF受體介導(dǎo)的凋亡。由細(xì)胞毒因素與TNF受體家族介導(dǎo)的凋亡都可有效地被p

24、35所抑制，提示這些通路都依賴于Caspases的激活。上述結(jié)果明確，在細(xì)胞中不同的凋亡激活途徑同時(shí)存在，不能被Bcl-2所抑制；而另一個(gè)如此是Bcl-2感，但對(duì)CrmA如此不敏感?？偨Y(jié)目前Bcl-2是凋亡分子機(jī)制研究的主要靶分子。Bcl-2的作用機(jī)制和凋亡的分子機(jī)制最終被說明， 治水平。B-cell CLL/lymphoma 2在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，調(diào)節(jié)線粒體外膜通透性， 后轉(zhuǎn)移到線粒體外膜上。根據(jù)其功能可分為兩組： Bax,Bak,Noxa等促進(jìn)細(xì)胞凋亡。關(guān)于Bcl-2家族調(diào)控線粒體外膜通透性的機(jī)制，其一是需要對(duì)CrmA敏感的Caspases參與但又可抑制的凋亡途徑，其中 Caspases對(duì)p

25、35敏隨著對(duì)Bcl-2以與凋亡本身研究的日漸深入, 從而提高對(duì)與凋亡有關(guān)的疾病的認(rèn)識(shí)和診大多數(shù)定位在線粒體外膜上，或受到信號(hào)刺激Bcl-2, Bcl-xl, Bcl-w 等抑制細(xì)胞凋亡；假說之一是,子Bax和Bak發(fā)生寡聚化，從細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移到線粒體外膜上， 道相互作用，使通道開放到足以使線粒體的凋亡因子如細(xì)胞色素 引起細(xì)胞死亡。細(xì)胞承受凋亡信號(hào)后促凋亡因并與膜上的電壓依賴陰離子通c等釋放到細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中,GAPDHGAPD或 G3PDH!甘油醛-3-磷酸脫氫酶glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 的英文縮寫。該酶是糖酵解反響中的一個(gè)酶，由4個(gè)3040k

26、Da的亞基組成，分子量146kDa。該酶是糖酵解反響中的一個(gè)酶，由 4個(gè)3040kDa的亞基組成，分子量146kDa。該酶基因?yàn)楣芗襤ouse keeping基因，幾乎在所有組織中都高水平表達(dá)，在同種細(xì)胞或者組織中 的蛋白質(zhì)表達(dá)量一般是恒定的，且不受含有的局部識(shí)別位點(diǎn)、佛波脂等的誘導(dǎo)物質(zhì)的影響而 保持恒定，故被廣泛用作抽提t(yī)otal RNA poly(A)+ RNA Western blot等實(shí)驗(yàn)操作的標(biāo)準(zhǔn)化的參。常用的參有，ACTB 3 -actin 、3-肌動(dòng)蛋白、GAPD威18S等。目的是在于防止RNA!量誤差、加樣誤差以與各PCRE響體系中擴(kuò)增效率不均一、各孔間的溫差等所造成的誤差、這

27、些都是管家基因，在各個(gè)組織中的表達(dá)量相對(duì)穩(wěn)定，其中18S同整個(gè)基因譜有關(guān)負(fù)責(zé)裝配，它在總RNA中占的比例最高。GAPDH甘油醛-3-磷酸脫氫酶是參與糖酵解的一種關(guān)鍵酶，由4個(gè)30-40kDa的亞基組成，分子量146kDa,檢測條帶大約在 36kDa。GAPDlM因幾乎在所有組織中都高水平表達(dá)，廣泛 用作Western blot蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化的參。因?yàn)镚APDH乍為管家基因在同種細(xì)胞或者組織中的蛋白質(zhì)表達(dá)量一般是恒定的，因此在使用GAPDI#抗體時(shí)，將每個(gè)樣品測得的目的蛋白含量與本樣品的GAPD冷量相除，得到每個(gè)樣品目的蛋白的相對(duì)含量，然后才進(jìn)展樣品與樣品之間的比擬。GAPDH勺分子量約為37kd

28、.MHC主要組織相容性復(fù)合體 (majorhistopatibilityplex , MHC)MH(C1由一群嚴(yán)密連鎖的基因群不同種類哺乳動(dòng)物 MHCf其MHC!常稱為 HLA基因或HLA(humanleucocyteantigen ,組成，定位于動(dòng)物或人某對(duì)染色體的特定區(qū)域，呈高度多態(tài)性。其編碼的分子表達(dá)于不同細(xì) 胞外表，參與抗原遞呈，制約細(xì)胞間相互識(shí)別與誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。編碼產(chǎn)物的名稱各異。小鼠的MHCW為H-2復(fù)合體。人類的復(fù)合體。其編碼的分子表達(dá)于白細(xì)胞上，稱為人類白細(xì)胞抗原HLA)。人類的MH*為要和基因區(qū)分，所以常稱為HLA分子或HLA抗原。根本類型 MHC 又稱主要組織相容性復(fù)合基因

29、，是存在于大局部脊椎動(dòng)物基因組中的一個(gè)基因家族，與免疫系統(tǒng)密切相關(guān)。共分成三類：第一型：MHQ31ass IMHCI位于一般細(xì)胞外表上，可以提供一般細(xì)胞的一些狀況，比如該細(xì)胞遭受病毒感染，如此相病毒外膜碎片之氨基酸鏈peptide透過MHCI示在細(xì)胞外側(cè)，可以供殺手 T細(xì)胞等辨識(shí)，以進(jìn)展撲殺。第二型：MHSlass nMHC n只位于抗原提呈細(xì)胞APC)±,如巨噬細(xì)胞等。這類提供 如此是細(xì)胞外部的情況，像是組織中有細(xì)菌侵入，如此巨噬細(xì)胞進(jìn)展吞食后，把細(xì)菌碎片利 用MH酰示給輔助T細(xì)胞，啟動(dòng)免疫反響。第三型：MHC class m (MHC m )主要編碼補(bǔ)體成分，腫瘤壞死因子 TN閂

30、，熱休克蛋白 70HSP70刖 21 羥化酶基因CYP21知 CYP21B研究簡介主要組織相容性復(fù)合體MHC系編碼主要組織相性抗原的基因群，是早期從組織器官移植 實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的，也是當(dāng)今免疫遺傳學(xué)的主要容。已發(fā)現(xiàn)，在人群或同種動(dòng)物不同個(gè)體間進(jìn)展皮膚移植時(shí)出現(xiàn)的排斥反響，具有記憶性、特異性和可轉(zhuǎn)移性等免疫反響的根本特征，故從廿世紀(jì)40年代起就確認(rèn)移植排斥反響是一種典型的免疫現(xiàn)象。引起排斥反響的抗原稱移植 抗原transplantation antigen 或組織相容性抗原 histopatibility antigen 。此等 抗原存在于細(xì)胞外表，無器官特異性，不同個(gè)體間其抗原特異性互不一樣，但同

31、卵雙生與純系動(dòng)物不同個(gè)體之間，其抗原特異性完全一致。組織相容性抗原包括多種復(fù)雜的抗原系統(tǒng)。凡能引起快而強(qiáng)的排斥反響者稱為主要組織相容性抗原系統(tǒng)，引起慢而弱的排斥反響者稱為次要組織相容性抗原系統(tǒng)。假如供者、受者雙方的多個(gè)次要組織相容性抗原不匹配，同樣會(huì)迅速發(fā)生明顯的排斥反響?，F(xiàn)已證明，MH6僅控制著同種移植排斥反響，更重要的是與機(jī)體免疫應(yīng)答、免疫調(diào)節(jié)與某些病理狀態(tài)的產(chǎn)生均 密切相關(guān)。因此，MHC勺完整概念是指脊椎動(dòng)物某一染色體上編碼主要組織相容性抗原、控 制細(xì)胞間相互識(shí)別、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的一組嚴(yán)密連鎖基因群。關(guān)于MHM發(fā)現(xiàn)、基因組成和功能的了解，多基于小鼠實(shí)驗(yàn)。因此，從廿世紀(jì)30年代起已確定小鼠的

32、 MHg于第17號(hào)染色體上，稱為 H2復(fù)合體。H2復(fù)合體由K區(qū)、I區(qū)、S區(qū)和D 區(qū)組成，其中 I區(qū)又分為IA和IE兩個(gè)亞區(qū)，其基因編碼產(chǎn)物稱為I區(qū)相關(guān)抗原Iregionassociatedantigen;IaantigenI 。1958年Dausset等發(fā)現(xiàn)，屢次承受輸血的患者、多產(chǎn)婦和用同種白細(xì)胞免疫的志愿者血清 中，存在不同特異性的白細(xì)胞抗體，用這些抗體鑒定出許多不同特異性的白細(xì)胞抗原，稱為人類白細(xì)胞抗原h(huán)uman leucocyte antigen , HLAJ。通過家系和人群遺傳分析發(fā)現(xiàn)，人類 MHCB于第6號(hào)染色體上，稱為 HLA復(fù)合體。各種脊椎動(dòng)物都有自己的MHC除了人的HLA和小

33、鼠的H2外，恒河猴、黑猩猩、狗、兔、豚鼠、大鼠和雞的MH8另稱為RhLA ChLADLA RLA GpLA AgBIH-1 I和B。本章主要介紹人類 HLA復(fù)合體與其編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、 分布和功能，與HLA抗原檢測在醫(yī)學(xué)上的意義等容。MHC吉構(gòu)特點(diǎn)多基因性多基因性：基因復(fù)合體由多個(gè)嚴(yán)密相鄰的基因座位組成，其編碼產(chǎn)物具有一樣或相似的功能。例如：小鼠H-2: 17號(hào)染色體：6號(hào)染色體短臂6P21.31，全長3600-4000kb , 224個(gè)基 因座位128個(gè)功能基因，96個(gè)假基因。多態(tài)性多態(tài)性：群體中在同一個(gè) HLA基因座位上存在兩個(gè)或兩個(gè)以上等位基因。HLA的遺傳特點(diǎn)：高度多態(tài)性；單體型遺傳；連

34、鎖不平衡。 1復(fù)等位基因 位于一對(duì)同源染色體上對(duì)應(yīng)位置的一對(duì)基因稱為等位基因allele ；由于群體中的突變，同一座的基因系列稱為復(fù)等位基因。HLA復(fù)合體的每一座存在為數(shù)眾多的復(fù)等位基因，由于各個(gè)座位基因是隨機(jī)組合的，故人群中的基因型可達(dá)千萬之多。 復(fù)等位基因和共顯性導(dǎo)致了HLA的多態(tài)性。2共顯性表達(dá) 一對(duì)等位基因同為顯性稱為共顯性。在雜合子狀態(tài)下，等位基因均表達(dá)出相應(yīng)產(chǎn)物。 共顯性大大增加了人群中HLA表型的多樣性。MH窿態(tài)性的意義：1.擴(kuò)大種群對(duì)抗原肽的提呈圍，有利于維持種群的生存與延續(xù)。HLA產(chǎn)物的多態(tài)性主要表現(xiàn)在抗原結(jié)合槽的氨基酸殘基在組成和序列上不同 2.不利于器官移植中供體的選擇。

35、MHC勺生理意義MHCt原最初是作為移植抗原而被發(fā)現(xiàn)的，是引起移植排斥的主要抗原系統(tǒng)。這種抗原不合，即可引起受體的免疫應(yīng)答，排斥移植的供體組織。70年代后證明MHO子還具有重要的免疫生理功能。 MHO子在免疫應(yīng)答過程中參與抗原識(shí)別。70年代R.M.津克納澤爾等在小鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)殺傷T細(xì)胞在殺傷感染病毒的靶細(xì)胞時(shí)，只能殺傷同系感染靶細(xì)胞，而對(duì)不同系的感染靶細(xì) 胞如此無殺傷作用，稱這種現(xiàn)象為遺傳限制性。隨后證明殺傷T細(xì)胞與靶細(xì)胞的 MHC5需一致才有殺傷作用，因此又稱此現(xiàn)象為 MHC艮制性。這揭示了 MHCE T細(xì)胞識(shí)別異種抗原中的 作用。進(jìn)一步的研究證明 T4的T細(xì)胞在識(shí)別異種抗原時(shí)受 MHffl

36、類分子限制，而 T8的T細(xì) 胞識(shí)別異種抗原時(shí)受 MHQ類分子限制。這種限制性的機(jī)制是：T細(xì)胞通過其抗原識(shí)別受體， 可同時(shí)識(shí)別異種抗原決定簇和自己MHO子形成的新的復(fù)合抗原決定簇。人們還發(fā)現(xiàn)外周血 B細(xì)胞和單核細(xì)胞等非 T細(xì)胞在體外能誘導(dǎo)某些自身反響性T細(xì)胞發(fā)生增殖反響，稱這種現(xiàn)象為自身混合淋巴細(xì)胞反響（AMLR）,并證明這是由非 T細(xì)胞上MH類抗原引起的。這種自身反響性T細(xì)胞在體可能具有增強(qiáng)或抑制免疫功能的作用，借以維持機(jī)體的免疫穩(wěn)定性，因此 MHO子也參予免疫調(diào)節(jié)作用。 研究證明，MHC分子對(duì)T細(xì)胞在胸腺的分化成熟過程也起重要作用。體外研究發(fā)現(xiàn)：去除胸腺中MHQ類抗原陽性的基質(zhì)細(xì)胞，如此T4

37、T細(xì)胞的發(fā)育受阻，在胸腺培養(yǎng)細(xì)胞中參加抗MHCn類抗原的單克隆抗體， 也能阻止T4T細(xì)胞的發(fā)育。目前認(rèn)為MH分子在T細(xì)胞自身耐受的 形成和T細(xì)胞庫的產(chǎn)生中都起著重要作用。HLA研究HLA復(fù)合體位于第6號(hào)染色體短臂上大約 4000kb圍，由一群密切連鎖的基因組成。HLA復(fù)合 體是迄今的人體最復(fù)雜的基因體系。從著絲點(diǎn)一側(cè)起依次為n類基因、出類基因和I類基因區(qū)域所在。I類基因區(qū)包括 HLA?A B C位點(diǎn)的等位基因，編碼 HLA?而原、B抗原和C抗原等經(jīng)典的 I類抗原分子。近年來相繼發(fā)現(xiàn)大量與I類基因結(jié)構(gòu)相似的基因，已被正式命名的有 HLA-E、F、G H J、K、L。其中HLA-E、F、G基因可編

38、碼非多態(tài)性的I類樣抗原或非經(jīng) 典I類抗原，但它們確實(shí)切功能尚未清楚。HLA-H J、K L如此屬于假基因。n類基因區(qū)十分復(fù)雜，主要包括 HLA-DP DQ DR三個(gè)亞區(qū)和新近確定的 DN DO DM等3個(gè)亞區(qū)。該區(qū) 的基因是以它們所編碼的肽鏈”、3直接命名，如 DRA DRB1 DRB2等。該區(qū)至少存在 7個(gè)編碼”鏈和16個(gè)編碼3鏈的基因，其中有的基因有表達(dá)功能，有的功能不明，有的屬 于假基因?，F(xiàn)在證明，在n類基因區(qū)存在與源性抗原處理和遞呈相關(guān)的基因，即 LM刖TAP。LMP又稱 蛋白酶體相關(guān)基因proteasome?related gene，由LMP開口 LMP7兩個(gè)基因組成，其編碼產(chǎn) 物 LMP(low molecular mass polypeptide or large multifunctional protease與源性抗原的處理有關(guān)。TAP為多肽轉(zhuǎn)運(yùn)體基因，包括 TAP1和TAP2兩個(gè)基因，其編碼產(chǎn)物TAP(transporter of antigenic peptides與抗原肽的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。 HLA復(fù)合體I類和n類區(qū)基因名稱見表 5.1。出類基因區(qū)已定位的至少有36個(gè)基因，其中與免疫系統(tǒng)有關(guān)的基因有C4B C4