脾臟淋巴細(xì)胞分離方法

1、小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分離方法需要提前準(zhǔn)備的材料：提前高壓滅菌：手術(shù)器械，200目尼龍網(wǎng)，除菌過濾：8.5%和0.85%的Nacl溶液各40ml, 1XPBS溶液，hanks液40ml。紅細(xì)胞裂解液，六孔板，培養(yǎng)皿，75%酒精，100ml燒杯，無菌注射器 5-10ml, 15ml、50ml離心管，4mlEP管，離心機(jī)等。1、配制的 percoll工作液： 配制 15 ml原液+1.5 ml 8.5%Nacl溶液混勻備用。100%percoll 液(簡稱工作液):13.5ml percoll 2、配制6個梯度，每個梯度 2ml,實際配制3ml3 / 370%percoll 液(1.090g/ml60%

2、percoll 液(1.077g/ml50%percoll 液(1.067g/ml40%percoll 液(1.050g/ml30%percoll 液(1.043g/ml20%percoll 液(1.031g/ml):2.1 ml 工作液 +0.9 ml):1.8 ml 工作液 +1.2 ml):1.5 ml 工作液 +1.5 ml):1.2 ml 工作液 +1.8 ml):0.9 ml 工作液 +2.1 ml):0.6 ml 工作液 +2.4 ml0.85%Nacl溶液混勻備用0.85%Nacl溶液混勻備用0.85%Nacl溶液混勻備用0.85%Nacl溶液混勻備用0.85%Nacl溶液混勻

3、備用0.85%Nacl溶液混勻備用找一只15ml離心管，從低到高(20% percoll液-70%percoll液)依次裝入，裝好備用。3、小鼠脾臟細(xì)胞分離(1)頸椎脫臼處死小鼠。75%酒精浸泡10min(2)無菌條件下取出小鼠脾臟，去除筋膜等置于Hanks'液中，將脾臟放入 2ml離心管中剪碎。(3)將200目尼龍網(wǎng)置于六孔板上，用注射器頭研磨，過程中不停加Hanks'液沖洗。(4)收集脾細(xì)胞懸液置于離心管中，1500rpm 10min ,棄上清。(5)加10ml ?紅細(xì)胞裂解液混懸沉淀，室溫靜置10min ,再1500rpm 10min(6)洗三遍，1500rpm 5min

4、 ,離心去上清(7)加入2ml 0.85%Nacl溶液混懸沉淀。(8)用注射器緩慢沿著事先準(zhǔn)備好的梯度分離管中，水平離心1800-2000rpm 30-40min(9)收集想要的分層，用 1xPBS洗3遍(10)用完全RPMI-1640培養(yǎng)基混懸沉淀，(調(diào)成濃度為1X108/ml的細(xì)胞懸液)轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，置37 C, 5%CO2下孵育30min后(去除貼壁的細(xì)胞)，收獲未貼壁細(xì)胞注：貼壁為單核細(xì)胞(巨噬細(xì)胞，樹突細(xì)胞)不貼壁的懸浮細(xì)胞(T/B/NK細(xì)胞)附件1:表 人不同血細(xì)胞的漂浮密度細(xì) 胞浮浮密度I細(xì) 胞漂浮密度1 052*1 0771 062-1 0751 065-1 0771.065-

5、1 0771.050-1 070紅細(xì)胞1-09-1.11|淋巴細(xì)胞粒細(xì)胞| B淋巴細(xì)胞嗜酸性1-09-1 095| T汨巴細(xì)胞嗜中性L060-1 085|淋巴母細(xì)胞單核細(xì)胞1.0501 口66|自然殺傷細(xì)胞血小板 1.030-1 060（一）原理Percoll是一種包有乙烯口比咯烷酮的硅膠顆粒。滲透壓很低（20mosm /kg H 2 O）,粘度也很小，可形成高達(dá)1.3g /ml密度，采用預(yù)先形成的密度梯度時可在低離心力（2001000g）于數(shù)分至數(shù)十分鐘內(nèi)達(dá)到滿意的細(xì)胞分離結(jié)果。由于 Percoll擴(kuò)散常數(shù)低，所形成的梯度十 分穩(wěn)定。此外，Percoll不穿透生物膜，對細(xì)胞無毒害，因此廣泛用

6、于分離細(xì)胞、亞細(xì)胞成 分、細(xì)菌及病毒，還可將受損細(xì)胞及其碎片與完好的活細(xì)胞分離。（二）操作方法及注意事項1 .不同濃度（密度）Percoll溶液的制備：先用9份Percoll與1份8.5% NaCl或1.5MPBS混合達(dá)到生理性滲透壓，然后用生理溶液（0.85 % NaCl或0.15M PBS）稀釋到所需濃度。Percoll 濃度（%）706050403020比重 g/ ml 1.090 1.077 1.067 1.056 1.043 1.0312 .不連續(xù)密度梯度 Percoll層的制備：先將試管壁用牛血清濕潤，除去多余血清，這種預(yù) 處理可使逐層疊加的Percoll液平穩(wěn)沿管壁流下，使形成滿

7、意的界面。在制備過程中一般用長針頭注射器從高密度向低密度逐層放置，有時相鄰兩層Percoll比重相差不大時，可將Percoll液放入注射器中，小針頭斜面緊貼管壁，任其自然慢慢流下。3 .裝樣：樣品體積和細(xì)胞濃度根據(jù)不同細(xì)胞而異，一般加樣體積不宜過大，細(xì)胞濃度 也不可過高，否則會影響細(xì)胞的分離和回收。4 .離心：一般采用離心力為 400g ,時間2025min。由于多層Percoll之間密度差別 不大，因此離心機(jī)加速、降速時要慢，要平穩(wěn)。5 .取樣：當(dāng)所要分離的細(xì)胞絕大部分在兩層的界面時，可逐層去除Percoll液后收集界面部位的細(xì)胞；有時大部分細(xì)胞位于 Percoll層中，則需要逐層收集。收獲

8、含有Percoll液的 細(xì)胞經(jīng)2次洗滌后可供培養(yǎng)或檢測用。（三）分離純化細(xì)胞舉例1 .富含NK活性大顆粒淋巴細(xì)胞（LGL）的純化：按順序由下向上逐層加 50%、47.5%、 45%、42.5 %和40%五種不同密度的 Percoll，如用10ml試管（或塑料管）分離，每層Percoll 約1.21.5ml,初步從外周血中分離的 PBMC細(xì)胞1X108懸于1 ml培基中，按要求裝樣、 離心和取樣。一般富含 NK殺傷活性的LGL細(xì)胞位于42.5 %與45 % Percoll界面以及上下 二層的Percoll液中。2 .純化淋巴母細(xì)胞和除去死細(xì)胞：分別疊加50%和30% Percoll液。收取經(jīng)PHA（或其它抗原、有絲分裂原）刺激PBMC,或含有較高比例異型的PBMC（如腎綜合征出血熱患者）,按要求裝樣、離心和取樣。位于管底的淋巴細(xì)胞為小淋巴細(xì)胞；兩層 Percoll之間為淋巴母 細(xì)胞，純度