漿膜腔積液細(xì)胞學(xué)檢查質(zhì)量控制概要

1、漿膜腔積液細(xì)胞學(xué)檢查質(zhì)量控制作者：弓K樹平，李立宏作者單位：河北北方學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院臨床檢驗(yàn)教研室，河北 張家口 075000【關(guān)鍵詞】月中瘤,細(xì)胞學(xué)技術(shù),漿膜腔積液漿膜腔積液常作為某些疾病的伴隨癥狀或首發(fā)癥狀出現(xiàn)，臨床常通過漿膜 腔積液檢查鑒別積液的良惡性、明確病因。目前，漿膜腔積液細(xì)胞學(xué)檢查找到 月中瘤細(xì)胞，仍是鑒別漿膜腔積液良惡性的一種快速、準(zhǔn)確、可靠和經(jīng)濟(jì)的首選 方法。因常規(guī)離心沉淀法檢出月中瘤細(xì)胞的陽性率僅為33%-60流右12,所以多年來，漿膜腔積液細(xì)胞學(xué)檢查方法不斷創(chuàng)新和加強(qiáng)各環(huán)節(jié)質(zhì)量控制以提 高月中瘤細(xì)胞的檢出率，受到越來越多的臨床實(shí)驗(yàn)室的關(guān)注。1分析前的質(zhì)量控制1.1 標(biāo)本采

2、集1.1.1 采集方式 對大量漿膜腔積液者應(yīng)留取最后抽出、帶有較多漿腹腔脫 落細(xì)胞的積液做細(xì)胞學(xué)檢查。薛立福介紹3,在胸腔積液采集中可將先抽入注 射器的積液再快速推向胸腔底部，反復(fù)數(shù)次后抽取送檢，可使腫瘤細(xì)胞檢出率 由50流右提高為80.3%。1.1.2 抗凝 采集脫落細(xì)胞學(xué)檢查標(biāo)本時應(yīng)加入抗凝劑，一般多為肝素 300U/100mL標(biāo)本，或用109mmol/L枸檬酸鈉(標(biāo)本與抗凝劑比例為10 ： 1),是 提高月中瘤細(xì)胞檢出率的一個重要環(huán)節(jié)而不可忽視。1.2 送檢1.2.1 送檢標(biāo)本量 送檢標(biāo)本量直接關(guān)系到可收集到的月中瘤細(xì)胞量，多數(shù)研 究者建議為200mL左右。李志忠等4將116例胸腔積液標(biāo)

3、本分為100300mL 組與510mLffl做對比，結(jié)果月中瘤細(xì)胞檢出率分別為 83.6%與46.6%,差異顯著 (P<0.005);抽出不足100mL者送檢510mL月中瘤細(xì)胞才出率僅為14.3%,除標(biāo) 本量過少外，也與患者的病情相關(guān)。李亞紅等 5將250mL標(biāo)本靜置30min后取 底層積液5mL離心沉淀，月中瘤細(xì)胞檢出率為 83.3%,如不靜置檢出率為52%值 得關(guān)注的是不少文獻(xiàn)報道不管送檢標(biāo)本量多少，只取520mL離心沉淀1 , 3,5 o筆者建議留取新鮮標(biāo)本100200mLr部離心沉淀，保證收集到盡量多的月中 瘤細(xì)胞，這是提高月中瘤細(xì)胞檢出率的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。靜置一定時間后取底層標(biāo)

4、 本離心沉淀，雖月中瘤細(xì)胞檢出率與離心沉淀100300mL標(biāo)本一致，但因時間延長，細(xì)胞形態(tài)改變而影響細(xì)胞識別及診斷，不應(yīng)作為最佳選擇。1.2.2 送檢時問 高自芳等6采用圖像分析儀對離體后室溫放置 15min、 30min、60min、90min、120min后的漿膜腔積液細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn) 15min 組細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，核著色深、染色質(zhì)及核膜清楚；30min與60min組細(xì)胞略增大，結(jié)構(gòu)尚清晰，染色質(zhì)較15min組模糊而核膜尚清；90min與120min組細(xì)胞 面積明顯增大，結(jié)構(gòu)模糊不清，部分細(xì)胞破碎，特別是120min組的細(xì)胞面積是15min組的3倍。因此認(rèn)為15min內(nèi)完成送檢、處理、

5、固定最佳，而 60min內(nèi) 完成送檢、處理、固定仍尚可?？紤]送檢及實(shí)驗(yàn)室內(nèi)標(biāo)本處理、固定用時， 30min內(nèi)送檢、60min內(nèi)完成標(biāo)本處理和固定為必須。1.2.3 送檢次數(shù)增加送檢次數(shù)可提高月中瘤細(xì)胞檢出率，各文獻(xiàn)報道結(jié)論一 致14,三次及三次以上送檢與一次送檢月中瘤細(xì)胞的檢出率差異具有顯著性(P<0.01)。2分析過程的質(zhì)量控制2.1 月中瘤細(xì)胞收集目前常用的漿膜腔積液細(xì)胞學(xué)檢查 5種收集方法，其方法學(xué)的創(chuàng)新和質(zhì)量 控制目的均為提高月中瘤細(xì)胞收集率。2.1.1 常規(guī)離心沉淀法離心沉淀的相對離心力(RCF)和血性積液的處理是 該方法的兩個關(guān)鍵質(zhì)控環(huán)節(jié)。不同研究中離心沉淀所用轉(zhuǎn)速、時間各異

6、，轉(zhuǎn) 速5003 500r/min、離心時間530min不等。但多數(shù)文獻(xiàn)未說明離心機(jī)的有 效離心半徑，所以RCF(g)不明RCF(g)=1.118 X10-5X有效離心半徑 (cm) x (r/min)2。尿沉渣檢查離心 RCF為400g/5min ,溫氏法血細(xì)胞比容測定 RCF為2 260g/30min ,分離乏血小板血漿 RCF為1 570g/10min ,分離血清 RCF 為1 010g/5min左右。惡性漿膜腔積液70犯上為漿液性7,其粘稠度大于尿 液而小于血液，漿膜腔積液中月中瘤細(xì)胞體積又大于紅細(xì)胞。因此，收集積液中 月中瘤細(xì)胞時的RCF為1 000g左右較為合適，時間根據(jù)漿膜腔積液

7、性狀選擇510min。目前國產(chǎn)離心機(jī)大部分有效離心半徑為 1415cm, RCF1 000g時，轉(zhuǎn)速 為2 500r/min左右。離心沉淀既要避免 RCF&小和離心時間過短收集不到月中瘤 細(xì)胞，又要避免過大和時間過長導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)異常變化和破碎。血性積液直 接涂片，月中瘤細(xì)胞檢出率僅為11%7;離心后取白膜層制片811月中瘤細(xì)胞檢出率50%右；許成英11用草酸錢1.2g、90%酉精30mL甘油10mLi口水至 100mL低滲溶液與胸水1 ： 1破壞紅細(xì)胞后，月中瘤細(xì)胞檢出率由 52炮高為86%; 支喜蘭12比較了蒸儲水、6g/L氯化鈉溶液和低滲氯化鉀+甲醇+冰醋酸溶液3 種破壞紅細(xì)胞的效

8、果，結(jié)果為低滲氯化鉀 +甲醇+冰醋酸溶液紅細(xì)胞破壞完全而 有核細(xì)胞形態(tài)保持最好。2.1.2 腦脊液細(xì)胞玻片離心沉淀器法 進(jìn)行漿膜腔積液細(xì)胞學(xué)檢查，標(biāo)本用 量僅為0.10.5mL,低速離心而細(xì)胞收集率高，損失少；制片好，細(xì)胞形態(tài)保 持完整易于觀察，避免了常規(guī)高速離心導(dǎo)致的月中瘤細(xì)胞發(fā)生變形破碎的可能 13。張紀(jì)云等14取靜置后底層的漿膜腔積液用該法檢查 40例惡性積液，月中 瘤細(xì)胞檢出率為97.5%,而常規(guī)離心法為80%兩種方法相比差異有顯著性 (P<0.05)。該法質(zhì)控需注意各步驟操作準(zhǔn)確和離心速度不能過快。2010年2月張樹平等：漿膜腔積液細(xì)胞學(xué)檢查質(zhì)量控制第1期2010年2月河北北方

9、學(xué)院學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)第1期2.1.3密度梯度離心法 朱任之等1516將抽取的胸腔積液離心沉淀后，以適量 PBS昆懸后，加到兩倍量的淋巴細(xì)胞 分離液（比重1.055）的表面，2 000r/min 離心1520min,收取細(xì)胞分離液表 面細(xì)胞層檢查，并依檢測結(jié)果決定檢測次數(shù)，最多 3次。36例惡性胸腔積液的 月中瘤細(xì)胞檢出率達(dá)91.7%,而常規(guī)離心法為44.1%（P<0.005）。葉安霞8、馬吉 勇等16用無鈣、鎂離子Hanks液洗滌處理離心沉淀物后混懸，加入到淋巴細(xì) 胞分離液表面后離心沉淀，一次檢測結(jié)果的陽性率分別為78%口 65%均高于常規(guī)離心法的30%口 45%三位作者月中瘤細(xì)胞檢出率相

10、差較大，可能為其檢測次數(shù) 不一致所導(dǎo)致。2.1.4 月中瘤細(xì)胞采集器法又稱膜式月中瘤細(xì)胞采集術(shù)或一次性月中瘤細(xì)胞采集 器法。該法使用的采集器由入液管、濃縮器、單向閥、三通及出液管組成，其 中濃縮器中部夾有微孔濾膜，微孔直徑為 10月中瘤細(xì)胞直徑一般均大于10小成 而淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞因直徑小于 10仙m被濾過。漿膜腔積液經(jīng)抽濾后， 取下微孔濾膜涂片。因該法不用離心沉淀，又可處理較大量積液收集月中瘤細(xì) 胞，無大量淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞干擾，背景清晰，月中瘤細(xì)胞檢出率明顯提高。該 法適用各類體液和沖洗液的細(xì)胞學(xué)檢查，因其快速簡便而常用于術(shù)中漿膜腔積 液、灌洗液細(xì)胞學(xué)檢查，月中瘤細(xì)胞檢出率明顯高于常規(guī)離心法

11、（P<0.005）,多在70%-90戒問1720 0該法已被國內(nèi)各級臨床實(shí)驗(yàn)室廣泛采用。該法的標(biāo)本送檢量和標(biāo)本抗凝對提高月中瘤細(xì)胞的檢出率至關(guān)重要，并要避免抽濾時和濾過 膜細(xì)胞面涂片時用力過大或不均引起細(xì)胞變形。2.1.5 液基細(xì)胞學(xué)技術(shù) 液基細(xì)胞學(xué)技術(shù)于1996年5月獲美國FDA比準(zhǔn)用 于婦科細(xì)胞學(xué)檢查，我國在1998年引進(jìn)。目前使用的液基細(xì)胞學(xué)技術(shù)有兩種 21,即新柏氏液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查（Thin prep cytology test , TCT劑自 動細(xì)胞學(xué)檢查（autocyte prep cytology tset , 又稱 Liqiud based cytology test

12、, LCT）兩種系統(tǒng)。TCT與LCT的制片原理略有不同，TCT是通過 高速旋轉(zhuǎn)將細(xì)胞打散，然后吸附到具有 35萬個小孔（孔徑58m）的過濾膜 上去除雜質(zhì)后，利用靜電吸附原理將細(xì)胞制成直徑20mm1層涂片。LCT是利用不同類型細(xì)胞的比重差異，將分層液加到保存液中，用離心機(jī)離心，將有診斷 價值的細(xì)胞、病原體與標(biāo)本中的粘液、淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞分離，把篩選出的細(xì) 胞制成直徑13mmi層涂片。國內(nèi)已有不少醫(yī)療機(jī)構(gòu)的臨床實(shí)驗(yàn)室將液基細(xì)胞學(xué) 技術(shù)用于漿膜腔積液細(xì)胞學(xué)檢查。該方法仍需先用常規(guī)離心沉淀法收集細(xì)胞， 將沉淀物清洗一次后加入Cytolyty液中。由于該法所制成的涂片總體采集量增 加，細(xì)胞集中、完整，讀

13、片面積小和背景清晰，月中瘤細(xì)胞檢出率明顯提高，與 常規(guī)離心法比較差異有顯著性（P<0.01）2224。質(zhì)量控制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)為取材的質(zhì)量，包括部位選擇、手法輕重等因素，取樣不足是液基細(xì)胞學(xué)假陰性診斷 的最主要原因；其次是標(biāo)本中因血液、粘液多而不做處理，使制片質(zhì)量不理想， 出現(xiàn)假陰性結(jié)果25 o通過對5種細(xì)胞收集方法的比較，作者認(rèn)為以月中瘤細(xì)胞采集器法優(yōu)點(diǎn)最 多，包括簡便、快速、經(jīng)濟(jì)、處理標(biāo)本量大和可消除背景干擾，使月中瘤細(xì)胞檢 出率明顯提高，適合多種體液的細(xì)胞學(xué)檢查等，建議作為漿膜腔積液細(xì)胞學(xué)檢 查月中瘤細(xì)胞收集的首選方法。其次為腦脊液細(xì)胞玻片離心沉淀器法。常規(guī)離心 法在做好從標(biāo)本采集開始各

14、個檢查環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制的基礎(chǔ)上，仍可為漿膜腔積 液細(xì)胞學(xué)檢查的一種較好方法。該法還可通過對其他細(xì)胞及特殊結(jié)構(gòu)的觀察，幫助判斷積液的性質(zhì)。密度梯度離心法，操作相對繁瑣和同樣需對各檢查環(huán)節(jié) 進(jìn)行嚴(yán)格質(zhì)量控制。液基細(xì)胞學(xué)技術(shù)優(yōu)點(diǎn)突出，但需專門設(shè)備和檢查成本開 高，且用于漿膜腔積液細(xì)胞學(xué)檢查的時間還不長，值得我們今后做更多的探 討。2.2 制片方法及制片數(shù)量離心沉淀物或抽濾濃縮物的制片方法有涂抹法、壓片法、推片法和自動細(xì) 胞離心涂片機(jī)法。涂片、壓片法易致厚薄不均，細(xì)胞重疊而影響觀察，樓煥進(jìn) 25建議推片為好，還有的作者建議推厚涂片和薄涂片各數(shù)張4。高質(zhì)量的制片是后期染色及形態(tài)學(xué)觀察的良好基礎(chǔ)。制片數(shù)量增

15、加制片及檢查數(shù)量，可提高月中瘤細(xì)胞檢出率。一般文獻(xiàn)均為 310 張4, 7, 9, 26,至少 2 張11。2.3 固定 制片后固定與染色方法相關(guān)，一般 HE染色均需專門進(jìn)行固定， 固定的好壞直接影響到染色效果及鏡檢診斷。HE 染色的固定液有幾種配方及固 定時間：無水酒精（或5%酉精）/15min;甲醇冰醋酸（3 : 1）/20min;95%H 精乙醴（1 ： 1）/15min;95%H精乙醴冰醋酸混合液（50 : 50： 1）/15min;AAF/30min;400g/L甲醛/5min?；旌项惞潭ㄒ汗潭ㄐ?果更好。2.4 染色 細(xì)胞染色方法有HE瑞 姬氏染色和巴氏染色等，使用 HE染色 占第

16、1位，其次是瑞 姬氏染色。2.4.1 瑞 姬氏染色（或劉氏染色）該染色方法簡單、試劑易得，除對月中瘤 細(xì)胞的染色效果好使之易識別外，還對漿腹腔脫落的間皮細(xì)胞、各種血細(xì)胞、 淋巴瘤細(xì)胞、細(xì)胞的吞噬現(xiàn)象、免疫島、紅斑狼瘡細(xì)胞、血細(xì)胞黏附月中瘤細(xì)胞 花環(huán)現(xiàn)象、真菌、寄生蟲有較好的染色效果而易識別，對分析鑒別積液性質(zhì)和 判斷預(yù)后很有幫助27 28。如由檢驗(yàn)科負(fù)責(zé)，多用瑞姬氏染色。2.4.2 HE染色病理學(xué)檢查多用此染色法，優(yōu)點(diǎn)為細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰。漿膜 積液細(xì)胞學(xué)檢查由病理科負(fù)責(zé)，習(xí)慣用此染色。兩類染色方法各有其優(yōu)點(diǎn)，質(zhì)量控制的要點(diǎn)均為染液的配制質(zhì)量和制片的 質(zhì)量。筆者推薦一般基層醫(yī)院用瑞姬氏染色方法。2

17、.5 鏡檢 鏡檢觀察是檢查的最后關(guān)鍵環(huán)節(jié)，應(yīng)仔細(xì)認(rèn)真完成。一般要求二 步掃描法4, 26:先用低倍鏡掃描觀察全片：重點(diǎn)對涂片尾部及邊緣部位進(jìn) 行觀察；發(fā)現(xiàn)可疑細(xì)胞后，轉(zhuǎn)換油鏡鑒定細(xì)胞性質(zhì)。每份標(biāo)本至少鏡檢23張涂片，如未找到月中瘤細(xì)胞分類計(jì)數(shù) 500個有核細(xì)胞，分析判斷積液性質(zhì)。據(jù)吳茅等29通過漿膜腔積液細(xì)胞涂片照片調(diào)查 84家二、三級醫(yī)院的臨床 實(shí)驗(yàn)室，第一次對月中瘤細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞、核異質(zhì)細(xì)胞、多倍體細(xì)胞識別的正 確率分別為57.4%、26.2%、26.2和30.4%,經(jīng)培訓(xùn)后，第三次調(diào)查分別提高為67.5%、54.4%、53卿54.4%,說明了漿膜腔積液內(nèi)細(xì)胞識別能力低是國內(nèi)各級 醫(yī)院臨

18、床實(shí)驗(yàn)室普遍存在的問題。3建議3.1 必須加強(qiáng)漿膜腔積液細(xì)胞學(xué)檢查的分析前質(zhì)量控制工作，由醫(yī)療機(jī)構(gòu) 牽頭制定規(guī)范性的操作規(guī)程，加強(qiáng)分析前的標(biāo)本采集、抗凝、送檢時間、次數(shù) 等各重點(diǎn)環(huán)節(jié)協(xié)作和質(zhì)量控制工作。3.2 優(yōu)選漿膜腔積液中月中瘤細(xì)胞的收集、檢查方法為漿膜腔積液細(xì)胞學(xué)檢 查質(zhì)量控制的首要任務(wù)。各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)自身的條件，積極引進(jìn)月中瘤細(xì)胞檢出 率高的方法，并制定相應(yīng)嚴(yán)格的操作規(guī)程，加強(qiáng)質(zhì)量控制。在標(biāo)本處理、制 片、固定、染色、鏡檢各個環(huán)節(jié)上嚴(yán)格遵守操作規(guī)程。3.3建議各級臨床檢驗(yàn)中心大力開展?jié){膜腔積液細(xì)胞學(xué)檢查的室間質(zhì)量評 價活動，并開辦相關(guān)的培訓(xùn)班、研討班，特別要加強(qiáng)對漿膜腔積液內(nèi)細(xì)胞識別

19、能力的培訓(xùn)，盡快提高臨床實(shí)驗(yàn)室漿膜腔積液細(xì)胞學(xué)檢查的質(zhì)量?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1樊英，李龍蕓.良惡性胸腔積液的鑒別診斷J.癌癥進(jìn)展雜志，2005, 3(2)： 134 136.2李桂賓，孫玉紅，高穎.良惡性胸水的實(shí)驗(yàn)室檢查新進(jìn)展J.臨床肺科雜 志，2005, 10(3) ： 361 362.3薛立福.惡性胸腔積液檢測方法及評價J.中華結(jié)核和呼吸雜志，2001, 24(1) : 18 4李志忠，劉錫范，李新香.胸腔積液細(xì)胞學(xué)檢查方法的對比研究J.中華 全科醫(yī)師雜志，2004, 3(1) : 76.5李亞紅，李亦民，袁古治，等.改良胸水常規(guī)細(xì)胞學(xué)檢查的臨床應(yīng)用價值 J.臨床醫(yī)學(xué)，2001, 21(10)

20、: 54 55.6高自芳，曹曉哲，董亮，等.送檢時間對脫落細(xì)胞形態(tài)影響的定量研究 J.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2000, 16(4) : 345.7常正義，潘云.580例漿膜腔積液脫落細(xì)胞學(xué)檢查分析J.右江民族醫(yī)學(xué) 院學(xué)報，2002, 24(5) : 7跖 746,8葉安霞，向旭東，譚國姣，等.密度梯度離心法在癌性胸腔積液細(xì)胞病理 學(xué)檢測中的應(yīng)用J.中華結(jié)核和呼吸雜志，2001, 24(7) : 420.9靳英，尤利霞.惡性月中瘤患者胸腹水細(xì)胞學(xué)診斷探討J.實(shí)用醫(yī)技雜志， 2004, 11(5) : 730.10曹敏，魏紅權(quán)，陳培輝.477例擬診癌癥患者胸腹水細(xì)胞學(xué)診斷探討J. 實(shí)用月中瘤雜志，

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