分子遺傳學復(fù)習題

1、名詞解釋：DNA甲基化（DNA methylation）:是指由DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶介導，催化甲基基團從S-腺苷甲硫氨酸向胞嘧啶的C-5位點轉(zhuǎn)移的過程。ENCODE計劃(The Encyclopedia of DNA Elements Project)：即“DNA元件百科全書計劃”，簡稱ENCODE計劃，是在完成人類基因組全序列測定后的2003年9月由美國國立人類基因組研究所（National Human Genome Research Institute，NHGRI）組織的又一個重大的國際合作計劃，其目的是解碼基因組的藍圖，鑒定人類基因組中已知的和還不知功能的多個物種的保守序列等在內(nèi)的所有功能

2、元件。ENCODE計劃的實施分為3個階段：試點階段（ a pilot phase）、技術(shù)發(fā)展階段（a technology development phase）和生產(chǎn)階段（a producttion phase）。gRNA (guide RNA)：既指導”RNA(gRNA，guide RNA)，能通過正常的堿基配對途徑，或通過GU配對方式與mRNA上的互補序列配對，指導編輯的進行。GT-AG規(guī)律（GT-AG rule）：真核生物所有編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因，其RNA前體在內(nèi)含子和外顯子交界處有兩個較短的保守序列，內(nèi)含子的左端均為GT，右端均為AG，此規(guī)律稱GT-AG規(guī)律。miRNA：即小RNA，長

3、度為22nt左右，5端為磷酸基團、3端為羥基。miRNA廣泛存在于真核生物中，不具有開放閱讀框架，不編碼蛋白質(zhì)，其基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，在RNase酶切后以雙鏈形式存在，是近幾年在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類具有調(diào)控功能的非編碼 RNA，它們主要參與基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。RNA編輯(RNA editing) :是指通過堿基修飾、核苷酸插入或刪除以及核苷酸替換等方式改變RNA的堿基序列的轉(zhuǎn)錄后修飾方式。RNA誘導的沉默復(fù)合體（RNA Induced Silencing Complex，RISC）：與siRNA結(jié)合后可識別并切斷mRNA。RNA指導的DNA甲基化（RNA Directed DNA M

4、ethylation RDDM）：活性RISC進入核內(nèi)，指導基因發(fā)生DNA的甲基化。密碼子擺動假說（wobble hypothesis）：密碼子的第1，2位核苷酸（53）與反密碼子的第2，3核苷酸正常配對；密碼子的的第3位與反密碼子的第1位配對并不嚴謹，當反密碼子的第1位為U時可識別密碼子第3位的A或G，而G則可識別U或C，I（次黃嘌呤）可識別U或C或A。 比較基因組學（comparative genomics）：是一門通過運用數(shù)理理論和相應(yīng)計算機程序，對不同物種的基因組進行比較分析來研究基因組大小和基因數(shù)量、基因排列順序、編碼序列與非編碼序列的長度、數(shù)量及特征以及物種進化關(guān)系等生物學問題的學

5、科。表觀遺傳變異（epigenetic variation）:基因的堿基序列未發(fā)生改變，而是由于DNA甲基化，組蛋白的乙?；蚏NA編輯等修飾導致基因活性發(fā)生了變化，使基因決定的表型發(fā)生變化，且可遺傳少數(shù)世代，但這種變化是可逆的。超基因家族（supergene family）：是DNA序列相似，但功能不一定相關(guān)的若干個單拷貝基因或若干組基因家族的總稱。沉默子（silencer）：一種轉(zhuǎn)錄負調(diào)控元件，當其結(jié)合特異蛋白因子時，對基因轉(zhuǎn)錄起阻遏作用。特點很象增強子，但不增強轉(zhuǎn)錄，而是減弱轉(zhuǎn)錄，故稱負增強子。 代謝組學(metabolomics)：是對某一生物或細胞在一特定生理時期內(nèi)所有低分子量代謝產(chǎn)

6、物同時進行定性和定量分析的一門新學科。端粒(telomere)：是由獨特的DNA序列及相關(guān)蛋白質(zhì)組成的線性真核染色體的末端結(jié)構(gòu)，它具有防止末端基因降解、染色體末端間的粘連和穩(wěn)定染色體末端及其精確復(fù)制等功能。反向遺傳學 （reverse genetics）：是從改變某個感興趣的基因或蛋白質(zhì)入手，然后去尋找相關(guān)的表型變化。反轉(zhuǎn)座子（retroposon）或“反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（retrotransposon）”:先轉(zhuǎn)錄為RNA再反轉(zhuǎn)錄成DNA而進行轉(zhuǎn)座的遺傳元件。核酶（ribozyme）:具有催化活性的RNA, 即化學本質(zhì)是核糖核酸(RNA), 卻具有酶的催化功能。核酶的作用底物可以是不同的分子, 有些

7、作用底物就是同一RNA分子中的某些部位。核心啟動子（core promoter）：是指在體外測定到的由RNA pol進行精確轉(zhuǎn)錄起始所要求的最低限度的一套DNA序列元件。化學基因組學(chemogenomics)：它是作為后基因組時代的新技術(shù),是聯(lián)系基因組和新藥研究的橋梁和紐帶。它指的是使用對確定的靶標蛋白高度專一的小分子化合物來進行基因功能分析和發(fā)現(xiàn)新的藥物先導化合物?；蚪M印跡(genomic imprinting) :也稱作基因印跡(gene impringting)，是一種新發(fā)現(xiàn)的非孟德爾遺傳現(xiàn)象，指來自雙親的某些等位基因在子代中呈現(xiàn)差異性表達的現(xiàn)象。程序性細胞死亡/凋亡（progra

8、mmed cell death/apoptosis)：細胞應(yīng)答一類刺激劑，引起一連串特征性的反應(yīng)，從而啟動導致細胞死亡的途經(jīng)。焦磷酸化編輯（pyrophosphorolytic editing）：RNA聚合酶通過PPi的摻入（聚合反應(yīng)的逆反應(yīng)）去除錯誤加入的核苷酸，然后加入正常的核苷酸，雖然這種編輯不能區(qū)分正常和錯誤的核苷酸，但由于轉(zhuǎn)錄在錯誤加入核苷酸后停留時間過長，而對其有優(yōu)先校正功能。酵母雙雜交(yeast two-hybrid)：利用雜交基因通過激活報道基因的表達探測蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間的相互作用。亮氨酸拉鏈（leucine zipper）：是由伸展的氨基酸組成，每7個氨基酸中的第7個氨基酸

9、是亮氨酸，亮氨酸是疏水性氨基酸，排列在-螺旋的一側(cè)，所有帶電荷的氨基酸殘基排在另一側(cè)。當2個蛋白質(zhì)分子平行排列時，亮氨酸之間相互作用形成二聚體，形成“拉鏈”。密碼子使用的偏好（relative synonymous codon usage，RSCU）：編碼同一氨基酸的各個密碼子的使用頻率在不同生物中并不相同，也不與該氨基酸在整個蛋白質(zhì)中的頻率成正比，這也就是密碼子使用的偏好現(xiàn)象，該現(xiàn)象可影響基因表達的效率。母系印跡(maternal imprinting) :來自母本的等位基因（母源等位基因）不表達，而父源等位基因表達的現(xiàn)象。母性基因（maternal gene)：母體卵子發(fā)生時所表達的基因，

10、母性體細胞基因是在母性體細胞中表達，而母性胚系基因則在生殖細胞中表達（如卵母細胞）。染色質(zhì)重塑(chromatin remodeling) :是表觀遺傳修飾中一種常見的方式，是指導致整個細胞分裂周期中染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和位置改變的過程。染色質(zhì)重塑因子（chromatin remodeling factor）: 依靠水解ATP提供能量來完成染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變。染色質(zhì)重塑因子在組成及功能上不同，但都包含類Snf2超家族的ATP酶亞基 增強子（enhancer）：該DNA序列可增加與其連鎖基因轉(zhuǎn)錄的頻率。增強子多位于基因的5端，但也可位于基因的3端，甚至基因的內(nèi)含子中。無位置及方向性，但可能有組織細胞特異性，

11、一般能使基因轉(zhuǎn)錄頻率增加10200倍，有的甚至可以高達上千倍。甚至遠離靶基因達幾千kb也仍有增強作用。轉(zhuǎn)座子沉默（transposon silencing）:宿主積累了轉(zhuǎn)座子的多個拷貝，從而阻遏轉(zhuǎn)座發(fā)生。組成型剪接（constitutive splicing）：編碼蛋白質(zhì)的不連續(xù)基因通過RNA剪接將內(nèi)含子從mRNA的前體中依次去除，然后規(guī)范地將外顯子剪接成成熟的mRNA，這種剪接方式是一個基因只產(chǎn)生一種成熟的mRNA，一般也只產(chǎn)生一種蛋白質(zhì)產(chǎn)物。組蛋白密碼（histone code）：組蛋白氨基端的各種修飾（甲基化、乙?；?、磷酸化、泛素化等）及組合通過改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)或產(chǎn)生效應(yīng)蛋白質(zhì)的結(jié)合位點

12、而影響基因的表達活性，從而調(diào)控下游的細胞學過程。組蛋白修飾(histone modification) :是指染色質(zhì)上的組蛋白被甲基化、乙酰化或磷酸化的過程。中心法則（central dogma）F.Crick于1958年提出的闡明遺傳信息傳遞方向的法則，指出遺傳信息從DNA傳遞至RNA，再傳遞至多肽。DNA與RNA之間遺傳信息的傳遞是雙向的，而遺傳信息只是單向地從核酸流向蛋白質(zhì)。簡答題：1. 核小體與核小體定位在基因表達及其調(diào)控中有何作用？核小體是染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位，體內(nèi)外試驗均證實，核小體是基因轉(zhuǎn)錄的通用抑制子。細胞內(nèi)基因組包裹在核小體內(nèi)，如果啟動子區(qū)在核小體內(nèi)，則轉(zhuǎn)錄通常會被抑制。試驗

13、也證明由于缺少H4組蛋白，不能在核小體形成的酵母細胞系中，很多基因變成組成型表達，而在正常的細胞中，它們均處于抑制狀態(tài)。核小體在DNA中的精確定位對細胞正常功能的發(fā)揮起重要作用。由于核小體與DNA的動態(tài)相互作用，大多數(shù)核小體的位置是不固定的。但是在有些情況下，某些核小體被限定在基因組的固定位置上，或者說DNA序列僅以一種特定的構(gòu)型裝配成核小體，則DNA上的每個位點將一直處于核小體的特定位置，我們稱這種裝配類型為核小體定位。核小體的定位對基因的表達調(diào)控有重要影響。它的定位變化總是伴隨著基因從抑制到轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的轉(zhuǎn)變。核小體的定位或定位的去穩(wěn)定或解除可能是影響基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要因素。大量的試驗結(jié)果表明

14、，核小體的形成和在染色質(zhì)的精確定位是真核基因表達所必需的。有人提出核小體的形成及其在染色質(zhì)上的精確定位有以下兩方面的作用：（1）提供一個支架結(jié)構(gòu)，使轉(zhuǎn)錄因子之間的信息傳遞更有效；（2）染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的不均一性，即某些區(qū)域不形成核小體，保證了轉(zhuǎn)錄因子易于接近染色質(zhì)模板。2. 原核生物與真核生物的啟動子結(jié)構(gòu)有什么差別？（1）原核生物的啟動子：在操縱元中，從mRNA開始轉(zhuǎn)錄的位點以上都是啟動子序列，20bp-200bp，其特點：1. Pribnow框：TATAAT,位于-10左右，是RNA聚合酶的牢固結(jié)合位點2. Sextama框：TTGACA，位于-35附近，是RNA聚合酶的初始結(jié)合位點3. 上述二者

15、及之間的距離決定反轉(zhuǎn)錄效率，一般距離17bp左右4. CAP位點cAMP-受體蛋白復(fù)合物在啟動子上的結(jié)合位點(2)真核生物啟動子：真核生物有三類RNA聚合酶，與此對應(yīng)，有三類不同的啟動子。事實上RNA聚合酶，所作用的啟動子情況比較復(fù)雜。RNA聚合酶識別的啟動子，除5SrRNA基因外，其它rRNA基因組成一個大的多拷貝基因族，轉(zhuǎn)錄成一個45S的rRNA前體，其啟動子由起始位點的核心啟動子和其上游控制元件兩部分組成。核心啟動子包括-45到+20，負責轉(zhuǎn)錄的起始；上游控制元件從-200到-150，它們之間的序列長度對轉(zhuǎn)錄效率影響很大。RNA聚合酶啟動子可分為兩種類型。一種是啟動子位于轉(zhuǎn)錄起始點下游，

16、又稱下游啟動子、基因內(nèi)啟動子或內(nèi)部控制區(qū)。另一種啟動子是與常見的啟動子相似，又稱上游啟動子。下游啟動子又分為兩個亞型，型和型，型內(nèi)部啟動子有兩個分開的序列boxA和boxC,而它們之間的距離比較固定，為中間元件，這是5SrRNA基因的典型結(jié)構(gòu)。型內(nèi)部啟動子由boxA和boxB組成，兩者之間的距離較大，且不固定，是tRNA基因啟動子的典型結(jié)構(gòu)。上游啟動子包括三部分元件，即TATA框，近側(cè)序列元件，和遠側(cè)序列元件，這是部分snRNA基因啟動子的典型結(jié)構(gòu)。RNA聚合酶啟動子由四部分元件組成，即轉(zhuǎn)錄起始點、TATA盒、上游元件和遠上游元件。轉(zhuǎn)錄起始位點在有些型轉(zhuǎn)錄酶啟動子中比較保守，其一致性序列為Py

17、PyANT/APyPy，轉(zhuǎn)錄起始點常和TATA盒組成核心啟動子起始基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄，但與其相連的上游元件和增強子可以促進其高效轉(zhuǎn)錄。對于含TATA盒的啟動子，其起始點常在其下游25bp-30bp，有的基因啟動子無典型起始子序列，則RNA聚合酶根據(jù)TATA盒下游30bp附近的第一個嘌呤堿基作為轉(zhuǎn)錄起始點。絕大多數(shù)型轉(zhuǎn)錄酶啟動子均含有TATA盒，一致性序列為TATAAAA，第5和第7位A有時可被T取代，看家基因、同源異形基因和哺乳發(fā)育中的免疫控制基因無TATA盒。而奢侈基因具有TATA盒，它可能是幫助RNA聚合酶正確識別其下游的起始子，從正確的位置起始轉(zhuǎn)錄；有些啟動子的TATA盒對轉(zhuǎn)錄十分重要，一旦缺失則

18、完全失去活性。故TATA盒對有些型轉(zhuǎn)錄酶啟動子的功能是十分重要。3. 常見的反式作用因子有哪些？其結(jié)構(gòu)特點是什么？這些調(diào)節(jié)著基因轉(zhuǎn)錄活性的反式作用因子，通稱為轉(zhuǎn)錄因子，已鑒別的轉(zhuǎn)錄因子可分為普遍性和組織特異性兩類。轉(zhuǎn)錄因子有數(shù)千種之多，從其結(jié)構(gòu)特點來看，主要有兩大功能區(qū)：DNA結(jié)合域和活性域。對于DNA結(jié)合域，根據(jù)其氨基酸結(jié)構(gòu)域的特點，又可分為：螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋，鋅指，螺旋-環(huán)-螺旋，亮氨酸拉鏈，同源異型域，激素受體類或核受體類，桶結(jié)構(gòu)等。（1）鋅指蛋白是由含有鋅指結(jié)構(gòu)域的兩類蛋白質(zhì)組成，即傳統(tǒng)的鋅指蛋白和類固醇受體結(jié)合蛋白。鋅指結(jié)構(gòu)域是由蛋白質(zhì)上保守的半胱氨酸及/或組氨酸與鋅原子結(jié)合形成一個

19、手指狀的結(jié)構(gòu)。典型的鋅指蛋白指蛋白往往有多個鋅指結(jié)構(gòu)域，其保守序列為Cys-X2-Cys-X3-phe-X5-leu-X2-His-X2-His，鋅原子與其中兩個半胱氨酸和2個組氨酸結(jié)合形成四面體結(jié)構(gòu)，長23個氨基酸，兩個鋅指之間由7-8個氨基酸相連。從每個鋅指的三級結(jié)構(gòu)來看，其N端形成折疊，C端形成螺旋。反向平行的折疊區(qū)含有2個半胱氨酸，與其后螺旋中的2個組氨酸一起與鋅原子結(jié)合，而由鋅原子穩(wěn)定了整個鋅指結(jié)構(gòu)。同源異型域蛋白屬于HTH蛋白，可形成三個螺旋區(qū)，其中螺旋2、螺旋3形成典型的HTH域，螺旋3識別螺旋與DNA大溝結(jié)合，其N末端臂參與DNA小溝的結(jié)合，同源異型域蛋白形成二聚體后才與DNA

20、結(jié)合 -桶結(jié)構(gòu)域 每個亞基上的-螺旋則與DNA大溝相結(jié)合，兩個相鄰的大溝被識別螺旋結(jié)合后可導致DNA分子發(fā)生45°的彎曲。 螺旋環(huán)螺旋結(jié)構(gòu)域 HLH長4050個氨基酸，由兩個長1516個氨基酸的親水，親脂的螺旋及長度不同的環(huán)（連接區(qū)）將其分開。兩蛋白的兩個-螺旋疏水面相互作用可形成同二聚體或異二聚體，多數(shù)HLH附近有一強堿性的氨基酸區(qū)，但也有不含該區(qū)的HLH，含有堿性區(qū)的HLH稱為bHLH或HLP，是DNA的識別和結(jié)合所必需的，但與DNA結(jié)合能力的差異則是由bHLH基序及二聚體的狀況所控制的。亮氨酸拉鏈（leucine zipper，ZIP）的雙親螺旋其疏水面亮氨酸突出，并與另一個平

21、行的亮氨酸拉鏈蛋白的亮氨酸突出交錯排列，盤繞成卷，兩個右手螺旋互相纏繞，每圈3.5個氨基酸，每7個殘基構(gòu)成一個完整的重復(fù)單位，因此亮氨酸在拉鏈區(qū)每隔6個氨基酸殘基重復(fù)出現(xiàn)一次，兩個蛋白形成同源二聚體或異源二聚體。在每個拉鏈蛋白質(zhì)中與亮氨酸重復(fù)序列鄰近的區(qū)域是高度堿性的，可作為一個DNA的結(jié)合位點。整個二聚體呈Y型結(jié)構(gòu)，拉鏈構(gòu)成莖，兩個堿性區(qū)分叉形成臂，橫跨在DNA分子上并與相鄰的DNA兩個大溝結(jié)合，這稱為bZIP。4. 原核生物與真核生物基因表達調(diào)節(jié)機制的主要差別是什么？（1）原核生物的基因多以操縱子為單位，轉(zhuǎn)錄和翻譯是偶聯(lián)的。在原核生物中，基因表達的調(diào)控以轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控為主，在調(diào)節(jié)基因的作用下

22、，主要以操縱子為單位，轉(zhuǎn)錄出一條多順反子mRNA，并指導蛋白質(zhì)合成；而且轉(zhuǎn)錄和翻譯是偶聯(lián)的，很少發(fā)生mRNA的加工、修飾。但也存在轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，例如反義RNA的調(diào)控，翻譯的調(diào)控，RNA開關(guān)等。 （2）真核生物的基因轉(zhuǎn)錄、RNA前體的加工、剪接在細胞核中進行，而翻譯則在細胞質(zhì)中進行。在真核生物中，基因表達的調(diào)控十分復(fù)雜，可發(fā)生在多個層次、多個水平，包括從染色體和染色質(zhì)的表觀遺傳學控制，DNA的復(fù)制、RNA的轉(zhuǎn)錄、加工與拼接、蛋白質(zhì)翻譯及翻譯后加工、修飾等等。對于真核生物基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，主要是順式作用元件（cis-acting element）與反式作用因子(trans-acting fact

23、or)的相互作用。另外，DNA的重排和RNA的交替剪接也是真核生物基因表達多樣性的重要機制；近年發(fā)現(xiàn)的小分子RNA通過RNA干擾途徑也可調(diào)節(jié)基因的表達，介導DNA的甲基化、mRNA的降解及翻譯起始的抑制等。參與的有關(guān)酶和蛋白質(zhì)的性質(zhì)及機理也不盡相同。轉(zhuǎn)錄是基因表達關(guān)鍵的步驟之一，也是原核生物和真核生物基因表達的第一步。真核生物內(nèi)含子的剪接和hnRNA加工機制十分復(fù)雜，可變剪接為一個基因產(chǎn)生多種蛋白質(zhì)產(chǎn)物創(chuàng)造力可能。真核生物mRNA翻譯后，其蛋白質(zhì)產(chǎn)物可發(fā)生十分復(fù)雜的修飾和加工，例如，磷酸化、甲基化、乙?；?、糖基化、泛素化等。另外基因的表達還受到表觀遺傳現(xiàn)象的影響，例如組蛋白的修飾、染色體的重塑

24、、DNA甲基化、RNA編輯等。5.轉(zhuǎn)座子的遺傳學效應(yīng)與應(yīng)用（1）改變?nèi)旧w結(jié)構(gòu) 當轉(zhuǎn)座子插入后而引起受體位點DNA一段短的同向重復(fù)序列（DR），即靶位加倍（target-site-duplication）。如轉(zhuǎn)座子切離在DR之間重組，結(jié)果是夾在兩個DR之間的DNA序列被切離而缺失(deletion)，中間的DNA序列形成一個環(huán)，將從細胞中丟失，DR在染色體上只留下一個拷貝(圖6-51a)；如重組發(fā)生在IR之間，結(jié)果是夾在兩個IR之間的DNA發(fā)生倒位（inversion）(圖6-51b)，而反向重復(fù)得到保留，這將會導致下一次的倒位。（2）誘發(fā)基因突變 當轉(zhuǎn)座子插入到某個基因座位中往往導致該基因失

25、活，在某些情況，插入位點的基因保持正常轉(zhuǎn)錄，只是轉(zhuǎn)錄子中的插入序列通過轉(zhuǎn)錄后的剪接過程而被除掉，因此插入位點的基因仍表現(xiàn)出顯性性狀，這種現(xiàn)象叫做滲漏突變(leaky mutation)。也就是仍有些殘余水平基因表達的突變。該基因稱為滲漏基因（leaky gene），又稱亞效等位基因（hypomorph），即一種突變種基因與其野生型有相似的效應(yīng)，但效應(yīng)較弱。 插入失活和滲漏突變與轉(zhuǎn)座子在插入位點中的方向有關(guān)。當兩個轉(zhuǎn)座子被同一轉(zhuǎn)座酶識別而整合到染色體的鄰近位置時，則它們之間的DNA將變得易于被轉(zhuǎn)座酶作用而轉(zhuǎn)座。如果它們之間的DNA中含有外顯子，則該外顯子將被切離，并可能插入另一基因之中。這種效應(yīng)

26、稱為“外顯子改組”（exon shuffling）。所謂外顯子改組，即源自一個或幾個基因的若干個外顯子像“洗牌” 那樣地進行重排，可以產(chǎn)生新的基因。這也是生物體產(chǎn)生新基因和基因進化多樣性的途徑之一。（3）調(diào)節(jié)基因表達 反轉(zhuǎn)錄病毒帶有增強子（enhancer）序列，很多轉(zhuǎn)座子也帶有增強子，它們像RNA病毒一樣，能使其插入位點附近的基因活性增強。轉(zhuǎn)座子除了含有增強子外，有的轉(zhuǎn)座子還含有啟動子，也能促進基因的轉(zhuǎn)錄活性。（4）產(chǎn)生新的變異 由于轉(zhuǎn)座插入位點可能出現(xiàn)新的基因，如像Tn帶的抗藥性基因，它的轉(zhuǎn)座不僅造成某個基因的插入突變，同時在此位點上出現(xiàn)一個新的抗藥性基因。由于轉(zhuǎn)座作用，使某些原來在染色體

27、相距甚遠的基因組合在一起，構(gòu)建成一個操縱子或表達單元，也有可能產(chǎn)生一些具有新的生物學功能的基因和編碼新的蛋白質(zhì)分子。（5）轉(zhuǎn)座子標記克隆目的基因 基因克隆是研究基因結(jié)構(gòu)和功能及基因轉(zhuǎn)移的必要前提，目前常用的辦法是構(gòu)建基因組文庫或cDNA文庫，然后從中篩選目的基因。（6）轉(zhuǎn)座因子作為基因工程載體 利用P因子作為載體，將外源基因轉(zhuǎn)移到果蠅胚胎生殖系細胞中，對果蠅進行遺傳操作。將攜帶目的基因的缺陷P因子和完整的P因子同時注入到胚胎的前胚盤，完整的P因子不僅能識別自身的末端序列，也能識別缺陷P因子的末端而進行轉(zhuǎn)座，結(jié)果兩種P因子都被插入到基因組中。只有P因子兩末端之間的DNA序列才能被插入，兩端外側(cè)序

28、列不是轉(zhuǎn)座因子的組成部分，不會被插入到基因組。因此該技術(shù)的優(yōu)點是只插入一個外源基因的拷貝。也就是說，所有轉(zhuǎn)基因果蠅只攜帶一個拷貝的外源基因，因而便于對其結(jié)構(gòu)和功能進行研究。6.簡述染色質(zhì)重塑的基本過程及其生物學功能。（1）染色質(zhì)重塑的概念 染色質(zhì)重塑(chromatin remodeling)是表觀遺傳修飾中一種常見的方式，是指導致整個細胞分裂周期中染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和位置改變的過程。此過程涉及某些依賴能量供給的組蛋白修飾，從而導致許多蛋白-蛋白及蛋白-DNA的互作受到破壞。在染色質(zhì)發(fā)生重塑的過程中，密集的染色質(zhì)絲在核小體連接處發(fā)生松懈造成染色質(zhì)疏松，從而使啟動子區(qū)中的順式作用元件得以暴露，為反式作用

29、因子（轉(zhuǎn)錄因子）與之結(jié)合提供了空間接觸的可能。細胞基因組中的DNA通常并非處于裸露狀態(tài)，而是與組蛋白一起構(gòu)成結(jié)構(gòu)致密的染色質(zhì)，故染色質(zhì)結(jié)構(gòu)狀態(tài)的改變會影響基因的表達。（2）染色體重塑過程由兩種蛋白復(fù)合體所介導，即ATP依賴型核小體重構(gòu)復(fù)合體和組蛋白修飾復(fù)合體。前者通過水解作用改變核小體構(gòu)型，后者對核心組蛋白N端尾部的共價修飾進行催化。（3）染色質(zhì)重塑是DNA修復(fù)和基因表達調(diào)控過程中的一個重要環(huán)節(jié)。染色質(zhì)重塑使染色質(zhì)組織結(jié)構(gòu)發(fā)生一系列重要的變化，如染色質(zhì)去凝聚、核小體變成開放式的疏松結(jié)構(gòu)、使轉(zhuǎn)錄因子等更易接近并結(jié)合核小體DNA，從而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄等。論述題1. 有哪些方法可用于功能基因組學的研究？

30、現(xiàn)在有何進展？隨著多種生物全基因組序列的獲得，基因組研究正在從結(jié)構(gòu)基因組學轉(zhuǎn)向功能基因組學的整體研究。在功能基因組學的研究中通常運用高通量技術(shù)（high-throuput techniques），如DNA微陣列（DNA microarrays），反向遺傳學（reverse genetics）技術(shù)如基因打靶，轉(zhuǎn)基因以及反義mRNA和RNA干擾等技術(shù)來系統(tǒng)地分析基因功能及基因間相互作用，基因組的時空表達以及發(fā)現(xiàn)和尋找新基因等。 （1）DNA微陣列技術(shù)又稱DNA芯片（DNA chips）或基因芯片技術(shù)（gene chips），它通過將對應(yīng)于不同基因 或cDNA的DNA片段或寡聚核苷酸點樣于微芯片上形

31、成高密度的矩陣，與熒光標記的總mRNA進行雜交，然后通過激光共聚焦掃描檢測并運用計算機軟件對雜交信號進行自動化定性定量分析，具有高通量、實時、靈敏、準確等特點。（2）基因打靶是指通過轉(zhuǎn)染的DNA序列與細胞內(nèi)同源的基因組序列（靶序列）之間進行同源重組，以改變靶序列來研究其結(jié)構(gòu)和功能或進行基因治療的技術(shù)?；虼虬屑夹g(shù)包括基因敲除（knock-out）和基因敲入(knock-in)，前者是用無功能的DNA序列與靶序列重組，破壞原基因組的遺傳功能，后者是用有功能的DNA序列與受到破壞的靶序列重組使其恢復(fù)遺傳功能?；虼虬屑夹g(shù)是一種從基因到表型的新研究方法，屬于反求遺傳學范疇。（3）反義mRNA技術(shù)通過

32、向細胞導入一段與特定編碼mRNA互補的非編碼RNA鏈，使其與該段mRNA特異性結(jié)合而定向阻抑靶基因表達的技術(shù)。這一技術(shù)的成熟，為功能基因組學的研究和基因治療提供了新的思路。在反義mRNA技術(shù)的研究過程中，科學家們意外發(fā)現(xiàn)導入正義mRNA（sense RNA）與導入反義mRNA具有等效的阻抑效應(yīng)。而更令人吃驚的是如果導入相應(yīng)雙鏈RNA（dsRNA），其阻抑效應(yīng)比導入任一單鏈RNA強十倍以上，dsRNA若經(jīng)純化則阻抑效應(yīng)更強。這種雙鏈RNA特異性地作用于與其序列配對的基因而抑制其表達的現(xiàn)象叫做RNA干涉。RNA干涉技術(shù)作為一種新的定點敲除knockdown技術(shù)，賦與了功能基因組學、基因治療等全新的

33、思路，堪稱生命科學近年來的革命性的突破。因而發(fā)現(xiàn)RNA干擾機制的兩位美國科學家Fire和Mello榮獲2006年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎?？梢娫擁棾晒闹卮罂茖W意義。2. 目前最常用的突變體創(chuàng)制方法有哪些？如何利用突變體進行功能基因組學研究？突變體是遺傳學研究的重要材料，其表型與基因型是基因功能研究的直接證據(jù)，因此突變體的創(chuàng)制和特異突變體的篩選非常重要。已知突變體可分為自發(fā)突變和人工誘變。自發(fā)突變不足以滿足現(xiàn)代遺傳學研究的需要。誘發(fā)突變則可以利用人工的方法提高基因突變頻率，在短時間內(nèi)創(chuàng)制大量突變體，還可以獲得許多在自發(fā)突變下很難產(chǎn)生的新類型突變體?；蛘T變常用的化學誘變因素多為烷化劑，如EMS和N

34、-甲基-N-亞硝基脲(methylnitrosourea，MNU)等，物理誘變因素為電離輻射和快種子等，生物誘變因素為轉(zhuǎn)座子、逆轉(zhuǎn)座子等。此外科研工作者還可通過轉(zhuǎn)基因、基因打靶等生物技術(shù)創(chuàng)制突變體.（1）EMS突變體EMS處理生物材料可使DNA的鳥嘌呤第六位酮基烷化而形成O6-乙基鳥嘌呤，而O6-乙基鳥嘌呤可以與腺嘌呤配對而不能與胞嘧啶配對。因此，原來DNA中的G-C對通過隨后的修復(fù)變?yōu)锳-T。通常EMS誘發(fā)突變99%為C/T突變，導致C/G變?yōu)門/A堿基替換。EMS也可以通過水解第七位的7-乙基鳥嘌呤誘發(fā)極低頻率的G/C向 C/G 或 G/C 向T/A的堿基替換、或由于3-乙基腺嘌呤錯配導致

35、A/T向G/C轉(zhuǎn)變。然而，也有報道EMS處理也可以導致染色體的異常，如DNA片段缺失等。 EMS誘發(fā)的特點是突變均勻分布于整個基因組中而不呈現(xiàn)明顯的“熱點”。根據(jù)模式植物擬南芥菜基因組的堿基組成情況，EMS引起的轉(zhuǎn)錄提前終止突變約為5%，而錯義突變約為65%。因此，我們不僅僅可以通過EMS造成轉(zhuǎn)錄提前終止的功能缺失突變體來研究基因的功能，也可以通過錯義突變引起的一些表型較弱、中間類型的突變體來研究功能蛋白中某個特定氨基酸殘基的功能。（2） 快中子突變體 電離輻射是原子核發(fā)生衰變時所放出的射線，種類很多，主要有： 射線，其本質(zhì)是氦的原子核，穿透能力弱，在生物組織中穿透只有幾十微米； 射線，一種電

36、子流，其穿透能力較粒子強，在生物組織中達數(shù)個毫米； 射線，有時也稱為光子，是不帶電的粒子，比、粒子小，有很強的穿透能力； n射線，也就是中子流，不帶電，幾乎不能與原子的電子相互作用，只能和原子核相互作用，一般中子源發(fā)出的中子為快中子，能量比較高，質(zhì)量小，速度快，穿透能力極強。（3） T-DNA標簽突變體 T-DNA標簽技術(shù)是以農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化為基礎(chǔ)的一種插入突變研究方法。由于農(nóng)桿菌的寄主范圍較廣,轉(zhuǎn)化技術(shù)成熟,故是創(chuàng)造插入突變體的有效途徑。與轉(zhuǎn)座子標簽技術(shù)相比,該法的最大特點是插入后較穩(wěn)定。在獲得穩(wěn)定的突變表型后,可用報告基因為探針在突變體文庫中克隆相應(yīng)的功能基因。若插入的片段內(nèi)包括大腸桿

37、菌的復(fù)制起點,則可通過質(zhì)粒挽救的方法克隆插入序列兩翼的植物基因片段。T-DNA插入的另一特點是如果插入的是無啟動子的抗生素抗性等報告基因，而T-DNA插入植物啟動子附近，就可導致外源報告基因的表達，從而可在細胞或組織水平上進行篩選。（4 ）轉(zhuǎn)座子標簽突變體 由于轉(zhuǎn)座子活躍的轉(zhuǎn)座活性能導致高頻率的基因突變而被廣泛應(yīng)用與病毒、細菌、酵母、果蠅、擬南芥菜、水稻等物種的突變體創(chuàng)制與基因功能研究。尤其是在高等植物上取得了突破性進展，如玉米激活子 (activator，Ac)、解離子 (dissociation，Ds)、增變子 (mutator，Mu)、Spm/En，金魚草Tam、矮牽牛dTphl以及水稻

38、的Tos17。而且它們在不同的物種中也表現(xiàn)出轉(zhuǎn)座活性，例如玉米Ac/Ds、煙草逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Tto1、Tto2（Tnt1）在擬南芥菜、蕃茄和水稻等新的宿主中都進行了表達、具有較高的轉(zhuǎn)座活性。更為重要的是單子葉植物的轉(zhuǎn)座子可以在雙子葉植物中表達、雙子葉植物的轉(zhuǎn)座子也可以在單子葉植物中表達，說明在植物進化過程中轉(zhuǎn)座子的表達和轉(zhuǎn)座機制具有較高的保守性，同時為轉(zhuǎn)座子在突變體創(chuàng)制與基因功能研究提供了更廣闊的前景。3. RNAi通過哪些機制控制基因的表達？實踐中有何應(yīng)用？（1） 通過各種途徑產(chǎn)生dsRNA進入宿主細胞，由其胞質(zhì)中的核酸內(nèi)切酶Dicer將dsRNA切割成多個具有特定長度和結(jié)構(gòu)的小片段RNA，即

39、siRNA。該siRNA在細胞內(nèi)解旋酶的作用下可解鏈成正義鏈和反義鏈，繼之由反義siRNA再與體內(nèi)一些酶和蛋白質(zhì)結(jié)合形成RNA誘導的沉默復(fù)合體（RISC），并使其激活，活性RISC具有RNA切割的特點。與RISC結(jié)合的雙鏈siRNA通過變構(gòu)釋放出和mRNA序列相同的片段，活化的RISC在保留的反義單鏈RNA引導下與mRNA隨即降解失去翻譯活性。（2） 由dsRNA加工產(chǎn)生的siRNA可能數(shù)量很多，有些可能還不完全配對，它與RISC結(jié)合后即可與mRNA3非翻譯區(qū)結(jié)合，通過結(jié)合poly(A)的PABP與eIF-4F作用，抑制翻譯的起始。（3） RISC同樣可在進入細胞核，在該ds的引導下誘導靶基因

40、的啟動子DNA發(fā)生甲基化，即RNA指導下的DNA甲基化使其不能轉(zhuǎn)錄而沉默；或在siRNA引導下通過RDRP募集組蛋白修飾因子，是H3K9甲基化，從而導致基因附近形成異染色質(zhì)而使基因沉默。 此外siRNA還有擴增過程，使之產(chǎn)生廣泛的有效的基因沉默現(xiàn)象。1.2.3.4. DNA甲基化是如何在轉(zhuǎn)錄水平上抑制基因表達的？（1） 直接干擾特異轉(zhuǎn)錄因子與各自啟動子結(jié)合的識別位置 DNA的大溝是許多蛋白因子與DNA結(jié)合的部位，胞嘧啶的甲基化干擾轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合。許多轉(zhuǎn)錄因子，如AP-2和E2F等能識別含CpG的序列，且對其甲基化程度非常敏感，當CpG上的C被甲基化后，轉(zhuǎn)錄即被抑制。（2） 轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合

41、物干擾基因轉(zhuǎn)錄 甲基化DNA結(jié)合蛋白與啟動子區(qū)內(nèi)的甲基化CpG島結(jié)合，再與其它一些蛋白共同形成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物(transcriptional repression complex, TRC)，阻止轉(zhuǎn)錄因子與啟動子區(qū)靶序列的結(jié)合，從而影響基因的轉(zhuǎn)錄。已經(jīng)鑒定了甲基化胞嘧啶結(jié)合蛋白1和2(MeCP1和MeCP2)及甲基化DNA結(jié)合蛋白（MBD）等轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物。MeCP1是一個蛋白復(fù)合體，但不穩(wěn)定，主要由MBD3、MBD2、HDAC1/2和RbAp46/48 (Rb-associated histone-binding protein 46/48)等所組成。MeCP1的抑制作用比較弱，需要與含12

42、個甲基化CpG的位點結(jié)合，缺乏MeCP1的細胞其基因組內(nèi)甲基化基因的抑制作用減弱。（3） 通過改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)而抑制基因表達 DNA甲基化與組蛋白去乙酰化正相關(guān)，而乙酰化修飾正是調(diào)節(jié)基因表達的另一重要方式。染色質(zhì)構(gòu)型的變化伴隨著組氨酸的乙酰化和去乙?；S多乙?；腿ヒ阴；副旧砭头謩e是轉(zhuǎn)錄增強子蛋白和轉(zhuǎn)錄阻遏物蛋白。DNA失活的區(qū)域處于高度甲基化狀態(tài)，同時又富含低乙?；M氨酸。CpG二聚體中胞嘧啶甲基化是高等真核生物基因組的主要特征。一般來說，在基因啟動子區(qū)的DNA甲基化伴隨著基因沉默。 4.5. 真核生物CG島的甲基化狀態(tài)與基因的表達活性的關(guān)系如何？DNA甲基化是表觀遺傳重要的修飾方式之一。

43、 其修飾位點有多種，分別由不同的酶催化，被修飾的位點可以是腺嘌嶺的N-6位、胞嘧啶的N-4位、鳥嘌呤的N-7位或胞嘧啶的C-5位。其中鳥嘌呤N-7位的甲基化可能是GA突變的原因，胞嘧啶甲基化(5-甲基胞嘧啶)在基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用。原核生物中CCA/TGG和GATC常被甲基化，而真核生物中甲基化僅發(fā)生于胞嘧啶。胞嘧啶C-5位甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA甲基化酶)識別DNA的5-CG-3序列(CpG)?；蚪M上的CpG大多數(shù)是聚集在一起而形成所謂的CpG島（CG island）。在脊椎動物DNA中，CpG島出現(xiàn)的頻率只有含G-C堿基對序列的20%左右。人類基因組中70%的甲基胞嘧啶出現(xiàn)在CpG島

44、。CpG主要位于基因的啟動子區(qū)，部分位于基因的第1個外顯子區(qū)，而且CpG甲基化可直接導致基因沉默。所有組成型表達的看家基因都含有CpG島，約含全基因組的一半，另一半CpG島出現(xiàn)在組織特異性表達基因的啟動子序列。 在哺乳動物細胞中，CpG甲基化位點能被許多蛋白所識別，包括指導染色質(zhì)聚集及基因沉默的甲基化CpG結(jié)合蛋白(methyl-CpG binding domain protein，MBD)。MBD是一組序列特異性的DNA結(jié)合蛋白，其靶序列很簡單，僅由5-甲基化胞嘧啶及緊跟其后的鳥嘌呤(5mCpG)組成。目前已知在哺乳動物中有5種甲基化DNA結(jié)合蛋白，其中四種分別是MeCP2、MBD1、MBD

45、2和MBD4 （MeCP2是最早發(fā)現(xiàn)的甲基化DNA結(jié)合蛋白），它們通過保守的甲基化DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域而結(jié)合5mCpG。Kaiso也是一種甲基化DNA結(jié)合蛋白，是DNA甲基化依賴的轉(zhuǎn)錄抑制因子，不具備MBD結(jié)構(gòu)域，可通過鋅指結(jié)構(gòu)與甲基化的DNA(主要是CGCG)結(jié)合。 DNA甲基化主要有兩種類型，即維持甲基化(maintenance methylation)和重新甲基化(de novo methylation) (圖9-4)。維持甲基化是給只有一條鏈甲基化的GpC/mCpG未修飾的胞嘧啶加上甲基基團，而重新甲基化是給2條鏈均未甲基化的GpC/CpG加上甲基基團。原核細胞的DNA甲基化酶既有維持甲基

46、化活性，又有重新甲基化活性，但真核細胞的DNA甲基化酶的維持甲基化活性遠高于重新甲基化活性。 細菌細胞內(nèi)的胞嘧啶和胸腺嘧啶都可以發(fā)生甲基化，但在脊椎動物中只有5mC一種甲基化形式。脊椎動物的DNA甲基化有4個特點：基因組內(nèi)的甲基化多數(shù)發(fā)生在與鳥嘌呤相連的胞嘧啶上，形成mCpG，基因組中有3的C是甲基化的，而CpG中70的C是甲基化的； G+C豐富區(qū)域的CpG島是非甲基化的；啟動子區(qū)的CpG被甲基化時轉(zhuǎn)錄受到抑制，基因下游即非島區(qū)的CpG甲基化并不抑制基因轉(zhuǎn)錄；啟動子區(qū)CpG甲基化密度與轉(zhuǎn)錄的抑制程度有關(guān)，弱啟動子能被密度較低的甲基化完全抑制，當啟動子被增強子增強時，可以恢復(fù)其轉(zhuǎn)錄功能；如果甲基化的密度進一步增加，則轉(zhuǎn)錄也進一步被完全抑制。6. 端粒及其生物學意義（1） 端粒是短的多重復(fù)的非轉(zhuǎn)錄序列（TTAGGG）及一些結(jié)合蛋白組成特殊結(jié)構(gòu)，除了提供非轉(zhuǎn)錄DNA的緩沖物外，它還能保護染色體末端免于融合和退化，在染色體定位、