蛋白質(zhì)分子量的測定方法

1、整理課件1整理課件2 1根據(jù)化學(xué)組成測定最低相對分子質(zhì)量 用化學(xué)分析方法測出蛋白質(zhì)中某一微量元素的含量，并假設(shè)分子中只有一個這種元素的原子，就可以計算出蛋白質(zhì)的最低分子量。肌紅蛋白、血紅蛋白均含鐵0.335%，分別求它們的最低分子量： 肌紅蛋白為55.8（Fe原子量）0.335100=16700，與其他方法測分子量相符。 血紅蛋白含鐵也是0.335%，最低分子量也為16700，但用其他方法測分子量為68000，即每一個血紅蛋白含有4個鐵原子，由此計算更為準確分子量為：167004=66800。整理課件3 2凝膠過濾法 凝膠過濾法分離蛋白質(zhì)的原理是根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的大小。由于不同排阻范圍的葡聚糖

2、凝膠有一特定的蛋白質(zhì)分子量范圍，在此范圍內(nèi)，分子量的對數(shù)和洗脫體積之間成線性關(guān)系。因此，用幾種已知分子量的蛋白質(zhì)為標準，進行凝膠層析，以每種蛋白質(zhì)的洗脫體積對它們的分子量的對數(shù)作圖，繪制出標準洗脫曲線。未知蛋白質(zhì)在同樣的條件下進行凝膠層析，根據(jù)其所用的洗脫體積，從標準洗脫曲線上可求出此未知蛋白質(zhì)對應(yīng)的分子量。整理課件4 3SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法 蛋白質(zhì)在普通聚丙烯酰胺凝膠中的電泳速度取決于蛋白質(zhì)分子的大小、分子形狀和所帶電荷的多少。SDS（十二烷基磺酸鈉）是一種去污劑，可使蛋白質(zhì)變性并解離成亞基。當?shù)鞍踪|(zhì)樣品中加入SDS后，SDS與蛋白質(zhì)分子結(jié)合，使蛋白質(zhì)分子帶上大量的強負電荷，并且使蛋

3、白質(zhì)分子的形狀都變成短棒狀，從而消除了蛋白質(zhì)分子之間原有的帶電荷量和分子形狀的差異。這樣電泳的速度只取決于蛋白質(zhì)分子量的大小，蛋白質(zhì)分子在電泳中的相對遷移率和分子質(zhì)量的對數(shù)成直線關(guān)系。以標準蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的對數(shù)和其相對遷移率作圖，得到標準曲線，根據(jù)所測樣品的相對遷移率，從標準曲線上便可查出其分子質(zhì)量。整理課件5 4沉降法（超速離心法） 沉降系數(shù)（S）是指單位離心場強度溶質(zhì)的沉降速度。S也常用于近似地描述生物大分子的大小。蛋白質(zhì)溶液經(jīng)高速離心分離時，由于比重關(guān)系，蛋白質(zhì)分子趨于下沉，沉降速度與蛋白質(zhì)顆粒大小成正比，應(yīng)用光學(xué)方法觀察離心過程中蛋白質(zhì)顆粒的沉降行為，可判斷出蛋白質(zhì)的沉降速度。根據(jù)沉降

4、速度可求出沉降系數(shù)，將S帶入公式，即可計算出蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量。整理課件6蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系 1蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系 2蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系整理課件7蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 （一）一級結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ)20世紀60年代初，美國科學(xué)家C.Anfinsen進行牛胰核糖核酸酶的變性和復(fù)性實驗，提出了蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)決定空間結(jié)構(gòu)的命題。核糖核酸酶由124個氨基酸殘基組成，有4對二硫鍵。用尿素和-巰基乙醇處理該酶溶液，分別破壞次級鍵和二硫鍵，肽鏈完全伸展，變性的酶失去催化活性；當用透析方法去除變性劑后，酶活性幾乎完全恢復(fù)，理化性質(zhì)也與天然

5、的酶一樣。 概率計算表明，8個半胱氨酸殘基結(jié)合成4對二硫鍵，可隨機組合成105種配對方式，而事實上只形成了天然酶的構(gòu)象，這說明一級結(jié)構(gòu)未破壞，保持了氨基酸的排列順序就可能回復(fù)到原來的三級結(jié)構(gòu)，功能依然存在。整理課件8 （二）種屬差異 大量實驗結(jié)果證明，一級結(jié)構(gòu)相似的多肽或蛋白質(zhì)，其空間結(jié)構(gòu)和功能也相似，不同種屬的同源蛋白質(zhì)有同源序列，反映其共同進化起源，通過比較可以揭示進化關(guān)系。 例如哺乳動物的胰島素，其一級結(jié)構(gòu)僅個別氨基酸差異（A鏈5、6、10位，B鏈30位），它們對生物活性調(diào)節(jié)糖代謝的生理功能不起決定作用。 從各種生物的細胞色素C(cytochrome c ) 的一級結(jié)構(gòu)分析，可以了解物種

6、進化間的關(guān)系。進化中越接近的生物，它們的細胞色素c的一級結(jié)構(gòu)越近似。整理課件9 （三）分子病 分子病是指機體DNA分子上基因缺陷引起mRNA分子異常和蛋白質(zhì)生物合成的異常，進而導(dǎo)致機體某些功能和結(jié)構(gòu)隨之變異的遺傳病。在1904年，發(fā)現(xiàn)鐮刀狀紅細胞貧血病。大約化費了40多年才清楚患病原因，患者的血紅蛋白（HbS）與正常人的（HbA）相比，僅-鏈的第6位上，Val取代了正常的Glu。目前全世界已發(fā)現(xiàn)有異常血紅蛋白400種以上。整理課件10蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)是其生物活性的基礎(chǔ)，空間結(jié)構(gòu)變化，其功能也隨之改變。肌紅蛋白（Mb）和血紅蛋白（Hb）是典型

7、的例子。整理課件11 肌紅蛋白（Mb）和血紅蛋白（Hb）都能與氧進行可逆的結(jié)合，氧結(jié)合在血紅素輔基上。然而Hb是四聚體分子，可以轉(zhuǎn)運氧；Mb是單體，可以儲存氧，并且可以使氧在肌肉內(nèi)很容易地擴散。它們的氧合曲線不同，Mb為一條雙曲線，Hb是一條 S型曲線。在低p(O2)下，肌紅蛋白比血紅蛋白對氧親和性高很多，p(O2)為2.8torr(1torr133.3Pa)時，肌紅蛋白處于半飽和狀態(tài)。在高p(O2)下，如在肺部（大約100torr）時，兩者幾乎都被飽和。其差異形成一個有效的將氧從肺轉(zhuǎn)運到肌肉的氧轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。整理課件12 Hb未與氧結(jié)合時，其亞基處于一種空間結(jié)構(gòu)緊密的構(gòu)象（緊張態(tài)，T型），與氧的親和力小。只要有一個亞基與