酵母菌的分離鑒定、固定化及酒精發(fā)酵3

1、酵母菌的分離鑒定、固定化及酒精發(fā)酵吳英玲 10197020 10生物創(chuàng)新班摘要：酵母菌喜歡酸性環(huán)境，可利用乳酸豆芽葡萄糖培養(yǎng)基富集培養(yǎng)酵母菌，然后在YPG培養(yǎng)基上用劃線法分離純化出酵母菌。將分離的酵母菌轉(zhuǎn)接于YPG斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待長好后置于冰箱內(nèi)4 下保存。用TTC顯色劑及杜氏小管觀察法篩選出發(fā)酵能力高的酵母菌。并通過菌落形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)、生化分析及分子生物學(xué)手段進(jìn)行微生物鑒定。采用PVA-海藻酸鈉固定化技術(shù)固定酵母細(xì)胞進(jìn)行酒精發(fā)酵。關(guān)鍵詞：酵母菌 分離鑒定 固定化 酒精發(fā)酵 Abstract: Yeast like acid environment, the use of lactic a

2、cid glucose medium enrichment culture yeast, bean sprouts and purification by marking method on the YPG culture medium of yeast will transfer separation of the yeast in the YPG cant medium cultivation, staying long placed in the refrigerator after use the TTC chromogenic agent, save and duchenne tub

3、ular observation screen high fermentation ability by colony morphology of yeast cell morphological and biochemical analysis and molecular biology means to identify the microorganisms using PVA - sodium alginate immobilized technology fixed yeast cells for ethanol fermentation。前言酵母菌（yeast）是一類單細(xì)胞真菌。一般

4、呈圓形、卵圓形、圓柱形，其菌落呈乳白色或紅色，表面濕潤、粘稠，易被挑起。酵母菌多數(shù)為腐生，專性或兼性好氧，廣泛生長在偏酸性的潮濕的含糖環(huán)境中，例如水果、蔬菜、蜜餞的內(nèi)部和表面以及在果園土壤中最為常見。酵母菌在有氧環(huán)境下將葡萄糖轉(zhuǎn)化為水和二氧化碳，主要用于饅頭、面包等食品發(fā)酵；在工業(yè)上，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）將葡萄糖、果糖、甘露糖等單糖吸入細(xì)胞內(nèi)，在無氧的條件下，經(jīng)過體內(nèi)酶的作用，把單糖分解為二氧化碳和酒精。此作用即酒精發(fā)酵。C6H12O6(葡萄糖)2 C2H5OH(酒精)+2 CO2在釀酒酵母酒精發(fā)酵的生產(chǎn)和應(yīng)用中，由于細(xì)胞破碎和酶純化等操作往往導(dǎo)致酶活性

5、和穩(wěn)定性都受影響，從而降低產(chǎn)酒精效率。而利用細(xì)胞固定化可以很好的解決這一問題。微生物細(xì)胞固定化方法主要有三種：載體結(jié)合法，交聯(lián)法和包埋法，其中固定包埋法是目前比較理想的方法。包埋法就是將微生物細(xì)胞均勻地包埋在多孔的水不溶性的緊密結(jié)構(gòu)中，細(xì)胞中的酶處于活化狀態(tài)，因而活性高，活力耐久。目前，利用聚乙烯醇（PVA）海藻酸鹽是包埋法中比較高效的一種，這種方法以PVA-海藻酸鈉作為混合溶膠，將酵母細(xì)胞固定起來進(jìn)行酒精發(fā)酵，不僅可以使細(xì)胞濃度增加，而且可以多次使用，減少了酵母培養(yǎng)增殖所消耗的糖分；操作簡單、過程迅速、顆粒不粘連、顆粒強(qiáng)度大大提高，且增加了顆粒的生物活性和穩(wěn)定性，因此可實(shí)現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)，提高酒

6、精生產(chǎn)效率。1. 材料與方法1.1 材料1.1.1材料與試劑 成熟葡萄皮、酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂、豆芽、去離子水、PVA 、海藻酸鈉、CaCl2、紅糖、異丙醇、乙醇、液氮、Taq酶、dNTPs、引物、酵母膏，葡萄糖，(NH4)2SO4，K2HPO43H2O，MgSO47H2O、H2SO4 ，1% K2Cr2O7 ，10% NaOH等1.1.2 培養(yǎng)基乳酸豆芽葡萄糖培養(yǎng)液：豆芽（60 g）、葡萄糖（6 g）, pH 值4.5 。 YPG培養(yǎng)基（500 ml）：酵母膏（5 g）、蛋白胨（10 g）、葡萄 糖（10 g）、瓊脂（10 g）、pH值6.56.8。 TTC上層培養(yǎng)基：TTC 0.0

7、5 g、葡萄糖0.5 g、瓊脂1.5 g、水l00 ml。 酒精發(fā)酵培養(yǎng)液：紅糖100 g， (NH4)2SO4 2.0 g，KH2PO4 1.0 g，pH自然，去離子水定容至1000 ml。 1.1.3 實(shí)驗(yàn)器材酒精計(jì)、試管、杜氏小管、移液槍、滴管、顯微鏡、三角瓶、烘箱、燒杯、PCR儀，電泳儀、接種環(huán)、電磁爐、報(bào)紙、橡皮筋等、玻璃棒、三角瓶、培養(yǎng)皿、試管、吸管、移液槍、漏斗、紗布、瓷缸、刮鏟、載玻片、酒精燈、高壓蒸汽滅菌鍋、載玻片、蓋玻片1.2 實(shí)驗(yàn)方法 1.2.1 酵母菌的分離與培養(yǎng) 取葡萄皮于90 ml無菌水，放置于搖床150 rpm，搖晃5 min，取出后稍靜置。用無菌槍頭吸取上清液1

8、 ml接入9 ml的乳酸豆芽葡萄糖培養(yǎng)液中，置2830烘箱中培養(yǎng)48小時(shí)。富集后用碘液染色后鏡檢。然后用接種環(huán)在事先滅菌的YPG固體劃線并置于2830 再培養(yǎng)48 h，得到酵母初篩單菌落，觀察菌落，用碘液簡單染色鏡檢。 1.2.2 發(fā)酵菌株的篩選向劃線分離的YPG培養(yǎng)基上倒入TTC上層培養(yǎng)基，30 下保溫(陰暗處)23 h。比較各菌株間的顏色深淺，顏色深的菌株呼吸酶活力強(qiáng)，有較強(qiáng)的產(chǎn)酒精能力。選取平板中對(duì)應(yīng)的顏色較深的10株菌，作為二級(jí)篩的出發(fā)菌株。選取上述顯色較深的酵母菌落，挑取一接種環(huán)接入乳酸豆芽葡萄糖培養(yǎng)液中，同時(shí)試管內(nèi)倒置一杜氏小管，培養(yǎng)24 h后，觀察杜氏管中產(chǎn)氣情況。打開棉塞，嗅聞

9、是否有酒精氣味。記錄產(chǎn)氣及酒精氣味情況，并與顯色情況進(jìn)行比較。 1.2.3 發(fā)酵菌株的鑒定 進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定：A菌落形態(tài)觀察，按普通微生物實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書觀察所分離的真菌菌落特征。B. 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，按普通微生物實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書簡單制片法觀察，先低倍鏡，后高倍鏡觀察。 分子生物學(xué)鑒定：主要對(duì)核糖體小亞基16SrRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，挑取形態(tài)學(xué)觀察符合酵母特征的菌落作為擴(kuò)增模版進(jìn)行PCR，PCR體系(25ul)為：表一 PCR反應(yīng)體系ddH2O10×PCR buffer（without MgCl2）MgCl2 (25 mM)dNTP(10 mM)5primer(10 mM)3primer(10

10、 mM)Template（50 -500 ng/l）Taq DNA polymerase(5U/l)34.6 l5 l4 l1 l2 l2 l1 l0.4 lTotal50 l94預(yù)變性 5 min94變性 30 sec52退火 30 sec 40個(gè)循環(huán)72延伸 60 sec72延伸 5 min4保溫（到達(dá)此溫度時(shí)停止PCR擴(kuò)增，將PCR管取出）將符合要求的樣品，按公司測序訂單要求填寫。測序結(jié)果登陸NCBI網(wǎng)站，進(jìn)行在線比對(duì)分析。 1.2.4釀酒酵母細(xì)胞PVA-海藻酸鈉固定化技術(shù) 菌種活化：挑取酵母菌斜面菌種一環(huán)，接1環(huán)斜面菌苔于裝有20mL培養(yǎng)基的150mL三角瓶中活化，置于恒溫?fù)u床內(nèi)，15

11、0r/min培養(yǎng)24 h，25 培養(yǎng)30 h。再將其用0.85%生理鹽水制成菌懸液，酵母數(shù)控制在108個(gè)/ml。固定化：聚乙烯醇PVA-海藻酸鈉混合膠于無菌燒杯中加熱融化，冷卻至45 左右。酵母菌液（預(yù)熱至35 左右）與聚乙烯醇PVA-海藻酸鈉按1: 4比例（v/v）混合均勻后，制備固定化細(xì)胞。用注射頭直徑為2 ml注射器以恒定速度滴到250 ml三角中，瓶中預(yù)先盛有50 ml的含2 % CaCl2溶液使形成凝膠珠。然后取60粒凝膠珠加入150 ml無菌葡萄糖培養(yǎng)液中，置25 下發(fā)酵4d，測定其酒精含量。2.結(jié)果與分析 2.1 發(fā)酵菌株初篩結(jié)果將葡萄皮中的酵母菌進(jìn)行富集培養(yǎng)后酵母菌生長迅速，在

12、液體培養(yǎng)基中比霉菌生長得快。不同組材料來源不同，結(jié)果顯示葡萄皮中的酵母菌數(shù)量較多。故而在酒精發(fā)酵中，酵母菌選擇的來源非常重要。在YPG培養(yǎng)基上用劃線法分離純化出酵母菌，48h后觀察菌落。圖一菌落呈乳白色，表面濕潤、粘稠，易被挑起。圖二為高倍鏡下觀察到的酵母菌，箭頭處明顯觀察到酵母菌的出芽生殖方式，幾乎呈鏈狀。圖三為平板劃線后分離單菌落。圖 發(fā)酵菌株初篩結(jié)果2.2 TTC法篩選酵母及酵母產(chǎn)氣情況TTC(2，3，5一氯化苯基四氮哇)是一種顯色劑，它對(duì)酵母的代謝產(chǎn)物發(fā)生呈色反應(yīng)，通過它可以判斷酵母中呼吸酶活力的大小，在YPG培養(yǎng)基上覆蓋TTC上層培養(yǎng)基培養(yǎng)后出現(xiàn)深紅色菌落，說明該菌株產(chǎn)酒精能力較強(qiáng)。

13、酵母進(jìn)行酒精發(fā)酵過程會(huì)產(chǎn)生CO2，根據(jù)杜氏小管中產(chǎn)氣多少可以間接判斷酵母發(fā)酵能力的強(qiáng)弱。再進(jìn)一步挑取紅色較深的菌落進(jìn)行產(chǎn)氣檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)杜氏小關(guān)中氣體較多，進(jìn)一步說明所篩選的菌株具有較強(qiáng)的發(fā)酵能力，可以進(jìn)行后續(xù)操作。圖四TTC法篩選正面圖，圖五為TTC法篩選反面，圖六產(chǎn)氣檢驗(yàn)結(jié)果。由第四管看出，CO2仍在不斷產(chǎn)生氣體，故而在后續(xù)操作中用此管中的酵母菌進(jìn)行操作。圖 TTC法篩選酵母及酵母產(chǎn)氣情況表二 酵母菌落顯色深淺與杜氏小管中產(chǎn)氣多少之間的關(guān)系管號(hào)顏色產(chǎn)氣量1號(hào)粉紅+2號(hào)紅+3號(hào)粉紅+4號(hào)深紅+2.3 分子生物學(xué)鑒定挑取發(fā)酵能力較強(qiáng)的菌落進(jìn)行菌落PCR，電泳結(jié)果如圖七，條帶約為450bp，可以進(jìn)行測

14、序。測序結(jié)果登陸NCBI網(wǎng)站，進(jìn)行在線比對(duì)分析。該序列與編碼Irpex lacteus isolate T2b（Han,G., Feng,X. and Tian,X）的18S rRNA基因的部分序列有57%的相似度。圖八和圖九為序列比對(duì)結(jié)果。(此處僅展示分子生物學(xué)鑒定方法)圖 菌落PCR結(jié)果圖 序列比對(duì)結(jié)果2.4釀酒酵母細(xì)胞PVA-海藻酸鈉固定化打開固定化細(xì)胞發(fā)酵的三角瓶，與未加凝膠珠的瓶子對(duì)比，嗅聞?dòng)芯葡銡?，上層溶液有渾濁，凝膠珠形狀是完好無損。與其他組實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較，從而選出酒精濃度最高一組，進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)獲得高濃度酒精。3.討論與反思（1）本實(shí)驗(yàn)采用平板分離酵母菌時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間不應(yīng)該過長，

15、因?yàn)殚L時(shí)間培養(yǎng)增加了染霉菌的可能性（圖三），并且若需得到純度較高的酵母菌則需進(jìn)一步進(jìn)行平板劃線分離酵母菌菌株。因此控制霉菌生長很重要，可采取多步平板劃線的方式克服此難關(guān)。（2）富集培養(yǎng)后需對(duì)溶液中酵母進(jìn)行死活統(tǒng)計(jì)，從而初步判斷此次富集的酵母菌的生存能力是否滿足工業(yè)酵母生存能力。死活統(tǒng)計(jì)的方法有0.l%美藍(lán)染色液染色法，活酵母菌可使美藍(lán)還原，從而使菌體不著色。（3）表一中總結(jié)出TTC染色后，菌落顏色深淺和產(chǎn)氣量的關(guān)系，顏色越深，產(chǎn)氣量越多，故在后期酒精發(fā)酵時(shí)應(yīng)挑取菌落顏色深的，提高酒精產(chǎn)量。（4）微生物鑒定時(shí)需要采取不同的方法進(jìn)行生物學(xué)鑒定，形態(tài)學(xué)鑒定時(shí)有可能出現(xiàn)雜菌，導(dǎo)致觀察失誤。分子學(xué)鑒定也可能產(chǎn)生假陽性，故在鑒定時(shí)不同方法之間要相互驗(yàn)證，使結(jié)果更具有說服力。（5）固定化培養(yǎng)酵母進(jìn)行酒精發(fā)酵時(shí)，凝膠珠中細(xì)胞濃度增加，而且可以多次使用，減少了酵母培養(yǎng)增殖所消耗的糖分；操作簡單、過程迅速、顆粒不粘連、顆粒強(qiáng)度大大提高，且增加了顆粒的生物活性和穩(wěn)定性，因此可實(shí)現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)，提高酒精生產(chǎn)效率。但在凝膠珠中，代謝物的積累可能影響酵母的生長繁殖和產(chǎn)酒精量，本人推測這可能與凝膠珠的大小有關(guān)系，故針對(duì)此處設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：1. PVA-海藻