低溫脅迫對玉米幼苗生理指標的影響資料

1、低溫脅迫對玉米幼苗生理指標的影響摘要：本實驗把玉米幼苗培養(yǎng)完成后，分別在4和常溫（其它條件相同）處理24h，并測定在兩種不同溫度下玉米各種生理指標（葉綠素含量、植物組織水勢、抗逆性、根系活力、過氧化物酶活性），分析實驗結(jié)果，找出低溫對玉米幼苗生長有哪些影響。對培育抗低溫品種提供基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：低溫脅迫，玉米幼苗，生理生化指標 植物的抗寒性分為抗冷性和抗凍性。許多喜溫植物雖然不能抵抗零度以下低溫的冰凍傷害, 但對零度以上低溫具有一定的忍耐性, 即具有抗冷性。低溫在一定程度上破壞細胞膜, 從而影響膜系統(tǒng)維持的生理功能。研究指出, 大部分植物在溫度介于015之間時一系列生理功能被破壞。根據(jù)對低溫的抗性

2、將植物分為兩類: 低溫敏感型, 如玉米(極限溫度5)，香蕉(極限溫度15)；低溫非敏感型, 這類植物在015之間時受冷害的跡象不明顯。另一方面, 植物對冷脅迫具有忍受力, 表現(xiàn)出許多從而提高低溫忍受力,如可溶性蛋白、糖及游離氨基酸含量升高, 產(chǎn)生較多的脅迫激素ABA等。不同植物, 甚至同一植物低溫適應(yīng)性反應(yīng)由于原產(chǎn)地不同, 其忍耐低溫的能力不同。低溫冷害是限制植物分布及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要因素, 也是植物引種必須首先考慮的問題。研究表明, 植物的低溫傷害機理首先涉及到對膜系統(tǒng)的破壞, 膜脂相變,從而影響膜系統(tǒng)維持的生理功能。黑龍江屬高寒地區(qū),玉米為低溫敏感型植物，極限溫度為5，是我國北方主要栽培作物

3、之一，是改善人民生活，出口外貿(mào)的重要物質(zhì)之一，對發(fā)展農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)具有十分重要的意義。因此此次研究低溫脅迫對玉米的傷害有重大的實際意義。1 材料與方法 1.1材料九單571.2材料培養(yǎng)各選吉單57與吉單48玉米種子各700粒左右，先用蒸餾水將種子洗干凈，然后將種子方放入已在底部放入濕紗布的大燒杯中，上方蓋上濕紗布，放在37保溫培養(yǎng)箱中進行催芽。將催芽成功的玉米種子擺在沙培基中，用少量沙土覆蓋并用澆水，保持一定的濕度，并在溫箱中培養(yǎng)兩周。取出一部分玉米幼苗放在4的冰箱中培養(yǎng)24小時做低溫處理，作為實驗前的準備。1.3 生理指標測定1.3.1 葉綠素含量測定:分光光度計丙酮法1.3.1.1原理根據(jù)葉

4、綠體色素提取液對可見光譜的吸收，利用分光光度計在某一特定波長測定其吸光度即可用公式計算出提取液中各色素的含量。根據(jù)朗伯比爾定律，某有色溶液的吸光度A與其中溶質(zhì)濃度C和液層厚度L成正比，即ACL式中：比例常數(shù)。當溶液濃度以百分濃度為單位，液層厚度為1cm時，為該物質(zhì)的吸光系數(shù)。各種有色物質(zhì)溶液在不同波長下的吸光系數(shù)可通過測定已知濃度的純物質(zhì)在不同波長下的吸光度而求得。如果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)，則此混合液在某一波長下的總吸光度等于各組分在相應(yīng)波長下吸光度的總和。這就是吸光度的加和性。今欲測定葉綠體色素混合提取液中葉綠素a、b和類胡蘿卜素的含量，只需測定該提取液在三個特定波長下的吸光度A，并根據(jù)葉綠

5、素a、b及類胡蘿卜素在該波長下的吸光系數(shù)即可求出其濃度。在測定葉綠素a、b時為了排除類胡蘿卜素的干擾，所用單色光的波長選擇葉綠素在紅光區(qū)的最大吸收峰。 已知葉綠素a、葉綠素b的80%丙酮溶液在紅外區(qū)的最大吸收峰分別位于663、645nm處。已知在波長663nm下葉綠素a、葉綠素b在該溶液中的吸光系數(shù)的分別為82.04和9.27；在波長645nm處的吸光系數(shù)分別為16.75和45.60。根據(jù)加和性原則列出以下關(guān)系式： A663=82.04Ca+9.27Cb （1） A645=16.76Ca+45.60Cb （2） 式（1） （2）A663nm和A645nm為葉綠素溶液在663nm和645nm處的

6、吸光度，Ca Cb分別為葉綠素a、葉綠素b的濃度，以mg/L為單位。 解方程（1） （2）組得 Ca=12.72 A6632.59 A645 (3) Cb=22.88 A6454.67 A663 (4) 將Ca+Cb相加即得葉綠素總量CT CT Ca十Cb20.29A6458.05 A663 (5)從公式（3）、（4）、（5）可以看出，就可計算出提取液中的葉綠素a、b濃度另外，由于葉綠素a 葉綠素b在652nm的吸收峰相交，兩者有相同的吸光系數(shù)（均為30.5），也可以在此波長下測定一次吸光度（A652）而求出葉綠素a、葉綠素 b 總量所測定材料的單位面積或單位重量的葉綠素含量可按下式進行計算：

7、 CT (6) 有葉綠素存在的條件下，用分光光度法可同時測出溶液中類胡蘿卜素的含量。Licht-enthaler等對Arnon進行了修正，提出了 80%丙酮提取液中3種色素含量的計算公式：Ca12.21A6632.59 A646 (7) Cb=20.13 A6465.03A663 (8) Cx.c (9) 式中：Ca Cb分別為葉綠素a、葉綠素b的濃度； Cx.c為類胡蘿卜素的總濃度；A663 A646 A470 分別為葉綠素提取液在波長663nm 646nm 470nm下的吸光度。由于葉綠素在不同溶劑中的吸收光譜有差異，因此，在使用其他溶劑提取色素時，計算公式也有所不同。綠素a 、葉綠素b在

8、95%乙醇中最大吸收峰的波長分別為665nm和649nm,類胡蘿卜素為470nm,可據(jù)此列出以下關(guān)系式；Ca13.95A6656.8A649 (10) Cb=24.96 A6497.32A665 (11) Cx.c (12)1.3.1.2材料、儀器設(shè)備及試劑1.3.1.2.1材料 新鮮（或烘干）的植物葉片。1.3.1.2.2儀器設(shè)備 分光光度計；電子頂載天平（感量0.01g）；研缽；棕色容量瓶；小漏斗；定量濾紙；吸水紙；擦境紙；滴管。1.3.1.2.3試劑：96乙醇（或80丙酮）。石英砂。碳酸鈣粉。1.3.1.3實驗步驟1. 取新鮮植物葉片（或其它綠色組織）或干材料，擦凈組織表面污物，剪碎（去

9、掉中脈），混勻。2. 稱取剪碎的新鮮樣品0.2g，共3份，分別放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及23ml95乙醇，研成均漿，再加乙醇10ml，繼續(xù)研磨至組織變白。靜置35min。3. 取濾紙1張，置漏斗中，用乙醇濕潤，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，過濾到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇沖洗研缽、研棒及殘渣數(shù)次，最后連同殘渣一起倒入漏斗中。4. 用滴管吸取乙醇，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中。直至濾紙和殘渣中無綠色為止。最后用乙醇定容至25ml，搖勻。把葉綠體色素提取液倒入光徑1cm的比色杯內(nèi)。以95乙醇為空白，在波長665nm、649nm下測定吸光度。1.3.2 根系活力測定：TTC法1.

10、3.2.1原理氯化三苯基四氮唑（TTC）是標準氧化電位為80mV的氧化還原色素，溶于水中成為無色溶液，但還原后即生成紅色而不溶于水的三苯甲腙，生成的三苯甲腙比較穩(wěn)定，不會被空氣中的氧自動氧化，所以TTC被廣泛地用作酶試驗的氫受體，植物根系中脫氫酶所引起的TTC還原，可因加入琥珀酸，延胡索酸，蘋果酸得到增強，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC還原量能表示脫氫酶活性并作為根系活力的指標。1.3.2.2、材料、設(shè)備儀器及試劑材料：水培或砂培小麥、玉米等植物根系。儀器設(shè)備：分光光度計；分析天平（感量0.1mg）；電子頂載天平（感量0.1g）；溫箱；研缽；三角瓶50ml；漏斗；量筒100ml；吸量管1

11、0ml；刻度試管10ml；試管架；容量瓶10ml；藥勺；試劑：乙酸乙酯（分析純）、次硫酸鈉（Na2S2O4），分析純，粉末。1TTC溶液: 準確稱取TTC1.0g，溶于少量水中,定容到100ml。用時稀釋至各需要的濃度。磷酸緩沖液（115mol/L，pH7.0）。1mol/L硫酸:用量筒取比重1.84的濃硫酸55ml，邊攪拌邊加入盛有500ml蒸餾水的燒杯中，冷卻后稀釋至1000ml。0.4mol/L琥珀酸:稱取琥珀酸4.72g，溶于水中，定容至100ml即成。1.3.2.3實驗步驟1.3.2.3.1定性測定 （ 1 ）配制反應(yīng)液 把 1 TTC 溶液、 0.4 mol L 的琥珀酸和磷酸緩沖

12、液按 1:5:4 比例混合。 （ 2 ）把根仔細洗凈，把地上部分從莖基部切除。將根放入三角瓶中，倒入反應(yīng)液，以浸沒根為度，置 37 左右暗處放 1 3 h ，以觀察著色情況，新根尖端幾毫米以及細側(cè)根都明顯地變成紅色，表明該處有脫氫酶存在。 1.3.2.3.2. 定量測定 （ 1 ） TTC 標準曲線的制作 取 0.4 TTC 溶液 0.2 mL 放入大試管中，加 9.8 mL 乙酸乙酯，再加少許 Na 2 S 2 O 4 粉末搖勻，則立即產(chǎn)生紅色的 TTF 。此溶液濃度為每毫升含有 TTF 80 g 。分別取此溶液 0.25 mL 、 0.50 mL 、 1.00 mL 、 1.50 mL 、

13、 2.00 mL 置 10 mL 刻度試管中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含 TTF 20 g 、 40 g 、 80 g 、 120 g 、 160 g 的系列標準溶液，以乙酸乙酯作參比，在 485 nm 波長下測定吸光度，繪制標準曲線（已有）。 （ 2 ）稱取根尖樣品 0.5 g ，放入小燒杯中，加入 0.4 TTC 溶液和磷酸緩沖液（ pH7.0 ）各 5 mL ，使根充分浸沒在溶液內(nèi)，在 37 下暗保溫 1 2 h ，此后立即加入 1 mol/L 硫酸 2 mL ，以停止反應(yīng)。（與此同時做一空白實驗，先加硫酸，再加根樣品， 37 下暗保溫后不加硫酸，其溶液濃度、操作步驟同上）。 （ 3

14、 ）把根取出，用濾紙吸干水分，放入研缽中，加乙酸乙酯 3 4 mL ，充分研磨，以提出 TTF 。把紅色提取液移入刻度試管，并用少量乙酸乙酯把殘渣洗滌 2 3 次，皆移入刻度試管，最后加乙酸乙酯使總量為 10 mL ，用分光光度計在波長 485 nm 下比色，以空白試驗作參比測出吸光度，查標準曲線，即可求出 TTC 還原量。 1.3.3過氧化物酶活性測定：愈創(chuàng)木酚法1.3.3.1原理：過氧化物酶廣泛分布于植物的各個組織器官中。在有過氧化氫存在下，過氧化物酶能使愈創(chuàng)木酚氧化，生成茶褐色物質(zhì)，此產(chǎn)物在470 nm 處有最大光吸收值，故可通過測470 nm下的吸光度變化測定過氧化物酶的活性。1.3.

15、3.2實驗材料：植物葉片1.3.3.3設(shè)備與試劑：電子分析天平，分光光度計，低速冷凍多管離心機，研缽，容量瓶，量筒，試管，吸管。（1）100mmol/L 磷酸緩沖液（pH=6.0）：0.2M的Na2HPO412.3mL和NaH2PO487.7mL混合后稀釋2倍（2）反應(yīng)混合液：100mmol/L磷酸緩沖液(pH6.0)50ml于燒杯中，加入愈創(chuàng)木酚28l，于磁力攪拌器上加熱攪拌，直至愈創(chuàng)木酚溶解，待溶液冷卻后，加入30%過氧化氫19l，混合均勻，保存1.3.3.4 操作步驟1.稱取植物材料1g，放入研缽中，適量液氮研磨成粉末，加適量的磷酸緩沖液于研缽中研磨成勻漿，以4000r/min離心15分

16、鐘，上清液轉(zhuǎn)入100ml容量瓶中，殘渣再用5mL磷酸緩沖液提取一次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，貯于冷處備用。2.取光徑1cm比色杯2只，于1只中加入反應(yīng)混合液3mL和磷酸緩沖液1mL（或加熱煮沸5 min 的酶液），作為校零對照，另1只中加入反應(yīng)混合液3ml，上述酶液1ml（如酶活性過高可稀釋之），立即開啟秒表記錄時間，于分光光度計上在波長470nm下測量吸光度值，每隔0.5min（30S）讀數(shù)一次，連續(xù)讀數(shù)3次。1.3.3.5 結(jié)果計算：以每分鐘內(nèi)A470變化0.01 為1 個過氧化物酶活性單位（U）式中：A470反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化； W植物鮮重（g）；t反應(yīng)時間（min）；VT提

17、取酶液總體積（mL）；VS測定時取用酶液體積（mL）。1.3.4組織抗逆性測定：電導率儀法1.3.4.1 測定原理和方法 植物組織受到逆境傷害時，由于膜的功能受損或結(jié)構(gòu)破壞，而使其透性增大，細胞內(nèi)的鹽類或有機物有不同程度的滲出，從而引起組織浸泡液電導率發(fā)生變化。通過測定電導率的變化，就可以反映出質(zhì)膜的破壞程度和所測材料抗逆性的大小。傷害越重，外滲越多，電導率值也就越大。1.3.4.2 結(jié)果計算 相對電導率L=（S1-S0）/（S2-S0)×100 傷害率（）=（Lt-Lck）/(1-Lck)×100 S0-蒸餾水電導率 S1-煮沸前電導率 S2-煮沸后電導率 Lt-低溫處理

18、葉片的相對電導率 Lck-對照（室溫）下葉片的相對電導率2 結(jié)果與分析2.1.1葉綠素含量測定:分光光度計丙酮法的結(jié)果與分析葉綠素的提取及含量測定665nm649nm葉綠素A含量葉綠素A含量葉綠素B含量葉綠素B含量室溫10.452 0.154 5.246 5.262 0.5352 0.5196 室溫20.453 0.153 5.267 0.5029 室溫30.454 0.154 5.274 0.5206 低溫10.352 0.142 3.933 3.941 0.9677 1.0137 低溫20.353 0.145 3.927 1.0352 低溫30.356 0.146 3.962 1.0382

19、 2.1.2根系活力測定：TTC法的結(jié)果與分析根重（g）吸光度平均還原量室溫130.0248.6室溫230.026室溫330.028低溫130.0185.2低溫230.017低溫330.0132.1.3過氧化物酶活性測定：愈創(chuàng)木酚法的結(jié)果與分析過氧化物酶含量測定0 30 60 90 過氧化物酶含量低溫10.000 0.0210.040 0.058 1983 低溫20.000 0.0190.038 0.060 低溫30.000 0.0180.040 0.059 室溫10.000 0.037 0.052 0.076 1767 室溫20.000 0.032 0.047 0.061 室溫30.000

20、0.037 0.052 0.075 2.1.4組織抗逆性測定：電導率儀法的結(jié)果與分析電導法測植物組織抗逆性蒸餾水電導率煮沸前電導率煮沸后電導率Lt平均值傷害率低溫12.5716.5 55.5 0.2636 0.2560 14.84%低溫226.4 97.0 0.2524 低溫322.1 80.0 0.2522 室溫116.1 123.3 0.1121 0.1264 室溫217.8 102.0 0.1532 室溫314.0 102.8 0.1140 2.1.5 植物水勢的測定2.1.5.1 數(shù)據(jù)處理植物水勢測定0.050.10.20.30.40.5常溫浸泡葉片前吸光率1.3349 1.3357

21、1.3352 1.3361 1.3370 1.3371 浸泡葉片后吸光率1.3364 1.3373 1.3358 1.3358 1.3355 1.3356 折光率變化上升上升上升下降下降下降等滲濃度0.25低溫浸泡葉片前吸光率1.3365 1.3376 1.3358 1.3353 1.3348 1.3356 浸泡葉片后吸光率1.33721.33831.33621.33671.33331.3327折光率變化上升上升上升上升下降下降等滲濃度0.352.1.5.2 結(jié)果分析低溫處理后植物水勢上升。3 討論3.1電導率與抗冷性的關(guān)系生物膜是植物細胞及細胞器與環(huán)境的一個界面結(jié)構(gòu),各種逆境對細胞的影響首先

22、作用于生物膜,低溫傷害也是如此。低溫脅迫下,質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)和功能受到傷害,導致細胞膜透性增大,電解質(zhì)外滲,電導率增大,能夠比較客觀地反應(yīng)植物在低溫逆境中的傷害狀況。本試驗通過對九龍品種室溫與低溫脅迫后幼苗的電導率的測定,從測定結(jié)果可知隨著低溫脅迫時間的增加，電導率不斷增加。3.2脯氨酸含量與抗冷性的關(guān)系在低溫條件下,脯氨酸的積累是對低溫環(huán)境的一種保護反應(yīng),脯氨酸能調(diào)節(jié)植物細胞膜的穩(wěn)定性,還具有清除活性氧和穩(wěn)定細胞結(jié)構(gòu)的作用。冷脅迫下脯氨酸含量迅速增加,可以降低水勢,作為防脫水劑來保護植物。脯氨酸的積累可能是由于蛋白質(zhì)合成受阻,也可能是由于合成受激或氧化受阻,還可能是蛋白質(zhì)降解的結(jié)果。在本試驗中發(fā)現(xiàn),從低溫脅迫后,各品種幼苗的脯氨酸含量一直升高,這說明了脯氨酸與水稻抗寒性密切相關(guān)。在植物受到傷害時,脯氨酸可能是通過保護酶的空間結(jié)構(gòu),提供足夠的自由水及生理活性物質(zhì)對細胞起保護作用。3.3保護酶活性與抗冷性