電化學(xué)發(fā)光免疫析法ppt課件

1、各位老師、同事：中午好！電化學(xué)發(fā)光免疫分析法Electro-Chemiluminescence Immunoassay (ECLI ) w免疫分析法w發(fā)光和化學(xué)發(fā)光w化學(xué)發(fā)光免疫分析法w電化學(xué)發(fā)光w電化學(xué)發(fā)光免疫分析法免疫分析w 基于抗原和抗體的特異性反應(yīng)進(jìn)行檢測的一種手段；w 免疫標(biāo)記技術(shù)是將一些既易測定又具有高度敏感性的物質(zhì)標(biāo)記到特異性抗原或抗體分子上，通過這些標(biāo)記物的增強(qiáng)放大效應(yīng)來顯示反應(yīng)系統(tǒng)中抗原或抗體的性質(zhì)與含量。免疫學(xué)檢測歷史演進(jìn)w 放射免疫檢測興起于20世紀(jì)70年代，現(xiàn)仍普遍使用于縣級以上醫(yī)院）；w 酶聯(lián)免疫檢測興起于20世紀(jì)80年代，各臨床機(jī)構(gòu)普遍使用）；w 以化學(xué)發(fā)光為代表的

2、光生物學(xué)標(biāo)記及免疫檢測技術(shù)20世紀(jì)90年代開始推廣使用，產(chǎn)品步入成長期三個階段。w免疫分析法w發(fā)光和化學(xué)發(fā)光w化學(xué)發(fā)光免疫分析法w電化學(xué)發(fā)光w電化學(xué)發(fā)光免疫分析法發(fā)光現(xiàn)象螢火蟲發(fā)光深海魚發(fā)光發(fā)光分類w 光照發(fā)光:發(fā)光劑經(jīng)短波長入射光照射后進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)回復(fù)至基態(tài)時發(fā)出較長波長的可見光。w 生物發(fā)光：反應(yīng)底物在熒光素酶的催化下利用ATP產(chǎn)能，生成激發(fā)態(tài)的氧化熒光素，后者在回復(fù)到基態(tài)時多余的能量以光子形式放出。w 化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光Chemiluminescence (CL) w 化學(xué)發(fā)光是指在某些特殊的化學(xué)反應(yīng)中，反應(yīng)的中間體或產(chǎn)物由于吸收了反應(yīng)釋放的化學(xué)能而處于電子激發(fā)態(tài)，當(dāng)其回到基態(tài)時

3、伴隨產(chǎn)生的光輻射現(xiàn)象。 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)包括兩個關(guān)鍵步驟，即化學(xué)激發(fā)和發(fā)光?；瘜W(xué)發(fā)光反應(yīng)能級圖化學(xué)發(fā)光分析w 根據(jù)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)在某一時刻的發(fā)光強(qiáng)度或反應(yīng)的發(fā)光總量來確定反應(yīng)中相應(yīng)組分含量的分析方法，稱為化學(xué)發(fā)光分析?；瘜W(xué)發(fā)光分析優(yōu)點w 化學(xué)發(fā)光具有熒光的特異性，同時不需要激發(fā)光，就避免了熒光分析中激發(fā)光雜散光的影響有很高的靈敏度，w 并且不象放射分析那樣存在強(qiáng)烈的環(huán)境污染和健康危害，是一種非常優(yōu)秀的定量分析方法?；瘜W(xué)發(fā)光分析缺點w 雖然化學(xué)發(fā)光具備很高的特異性和很小的干擾，但化學(xué)分析本身的不特異性，制約了整個方法的使用。w免疫分析法w發(fā)光和化學(xué)發(fā)光w化學(xué)發(fā)光免疫分析法w電化學(xué)發(fā)光w電化學(xué)發(fā)光免疫分

4、析法化學(xué)發(fā)光免疫分析chemiluminescence immunoassay（ CLIA）w CLIA是將化學(xué)發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種新的免疫分析技術(shù)。w 這種方法兼有發(fā)光分析的高靈敏度和抗原抗體反應(yīng)的高度特異性。 化學(xué)發(fā)光免疫分析（ CLIA分類w 按分離方法不同分w 微粒子化學(xué)發(fā)光免疫測定w 磁顆?；瘜W(xué)發(fā)光免疫測定化學(xué)發(fā)光免疫分析（ CLIA分類w 按發(fā)光劑不同分為w 發(fā)光酶免疫測定chemiluminescence enzyme immunoasssay， CLEIA ）w 化學(xué)發(fā)光免疫測定技術(shù) （chemiluminescence immunoassay， CLIA ）w

5、 電化學(xué)發(fā)光免疫測定技術(shù)electrochemiluminescence immunoassay， ECLI ）w免疫分析法w發(fā)光和化學(xué)發(fā)光w化學(xué)發(fā)光免疫分析法w電化學(xué)發(fā)光w電化學(xué)發(fā)光免疫分析法電致化學(xué)發(fā)光ECL)w 電致化學(xué)發(fā)光 (ECL) 是通過在電極上施加一定波形的電壓或電流信號進(jìn)行電解反應(yīng)的產(chǎn)物之間或與體系中共存組分反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的現(xiàn)象。電致化學(xué)發(fā)光ECL)w ECL與CL的差異在于ECL是電啟動發(fā)光反應(yīng)，而CL是通過化合物混合啟動發(fā)光反應(yīng)。因此ECL反應(yīng)易精確控制，具有靈活性。電化學(xué)發(fā)光劑w 定義：指通過在電極表面進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)而發(fā)出光的物質(zhì)。w 特點w 反應(yīng)在電極進(jìn)行w 化學(xué)發(fā)光

6、劑：三聯(lián)毗啶釕w 電子供體為：三丙胺TPA）三聯(lián)毗啶釕分子結(jié)構(gòu)圖NNNNNNRuOONOO三聯(lián)吡啶釕（ Ru(bpy)32+ ）特點w ECL分析中采用Ru(bpy)32+作為標(biāo)記物，其活化衍生物是Ru(bpy)32+N羥基琥珀酸胺酯NHS） ，該衍生物具有水溶性，且高度穩(wěn)定，保證電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的高效和穩(wěn)定，而且避免了本底噪聲的干擾。三聯(lián)吡啶釕（ Ru(bpy)32+ ）特點w Ru(bpy)32+衍生物與免疫球蛋白結(jié)合的分子比超過20仍不會影響抗體的可溶性和免疫活性；w Ru(bpy)32+分子量小，空間位阻小 ，即便小分子的核酸也能標(biāo)記，使檢測的菜單大大豐富，更重要的是為其檢測菜單的開發(fā)前

7、景提供了廣闊空間。電化學(xué)發(fā)光原理圖TPA+TPARu(bpy)3+Ru(bpy)Ru(bpy)2+光子(620nm)333*基態(tài)激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定w免疫分析法w發(fā)光和化學(xué)發(fā)光w化學(xué)發(fā)光免疫分析法w電化學(xué)發(fā)光w電化學(xué)發(fā)光免疫分析法電化學(xué)發(fā)光免疫分析(Electro-Chemiluminescence Immunoassay, ECLI)w ECLI是繼EIA、RIA、FIA、時間分辨熒光免疫技術(shù)TRFIA之后的新一代標(biāo)記免疫測定技術(shù)； w ECLI是電化學(xué)發(fā)光(ECL)和免疫測定相結(jié)合的產(chǎn)物；w ECLI是目前最先進(jìn)的標(biāo)記免疫測定技術(shù)之一。 ECLI原理w 在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，

8、用電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕Ru(bpy)32+標(biāo)記Ab，通過Ag-Ab反應(yīng)和磁珠分離技術(shù)，根據(jù)三聯(lián)吡啶釕在電極上發(fā)出的光強(qiáng)度對待測的Ag或Ab進(jìn)行定量/定性。ECLIA檢測流程圖一雙抗體夾心的形成）ECLIA檢測流程圖二 （生物素與親和素結(jié)合）ECLIA體系結(jié)構(gòu)圖ECLIA檢測流程圖三 （磁珠吸引吸附于電極表面）ECLIA檢測流程圖四 （電極充電啟動電化學(xué)反應(yīng)）ECLIA檢測流程圖五 （撤消磁場沖洗磁珠）方法評價w 采用的固相載體是帶有磁性的直徑約2.8 m的聚苯乙烯微粒。其特點是反應(yīng)面積比板式擴(kuò)大2030倍，吸附效率高；在液體中形成均勻的懸液，參與反應(yīng)時類似液相，反應(yīng)速度大大加快；方法評價w “鏈霉親和素-生物素是是具有很強(qiáng)的非共價相互作用的一對化合物，具有牢固而特異的結(jié)合，應(yīng)用此放大系統(tǒng)，使檢測的靈敏度大大提高；方法評價w 利用氧化鐵的磁性，使用電磁場分離結(jié)合態(tài)和游離態(tài)，方便迅速，實現(xiàn)了精確的全自動化；w 標(biāo)記物的再循環(huán)利用，使發(fā)光時間更長、強(qiáng)度更高、易于測定。ELIA優(yōu)越性w 高度敏感，可達(dá)pgml或pmol水平；w 特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，CV5。w 測定范圍寬，可達(dá)7個數(shù)量級。w 試劑穩(wěn)定，無毒害，無污染，有