第五講核酸的分子雜交13.10.)

1、第五講第五講 分子雜交與印跡技術(shù)分子雜交與印跡技術(shù) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 宋宋 方方 洲洲2013.12013.10 0 在分子生物學(xué)操作上，分子雜交與印跡技在分子生物學(xué)操作上，分子雜交與印跡技術(shù)實(shí)質(zhì)上是術(shù)實(shí)質(zhì)上是兩個(gè)不同的技術(shù)兩個(gè)不同的技術(shù)，下面首先予以，下面首先予以單獨(dú)介紹，然后介紹其關(guān)聯(lián)和區(qū)分。單獨(dú)介紹，然后介紹其關(guān)聯(lián)和區(qū)分。分子雜交與印跡技術(shù)分子雜交與印跡技術(shù) 區(qū)別區(qū)別1.1.雜交雜交(hybridization(hybridization） 從遺傳的角度來說從遺傳的角度來說, ,雜交指雜交指基因型不同的個(gè)體基因型不同的個(gè)體之間進(jìn)行的交配之間進(jìn)行的交配。

2、 遺傳學(xué)中經(jīng)典的也是常用的實(shí)驗(yàn)方法。通過不遺傳學(xué)中經(jīng)典的也是常用的實(shí)驗(yàn)方法。通過不同的基因型的個(gè)體之間的交配而取得某些雙親基因同的基因型的個(gè)體之間的交配而取得某些雙親基因重新組合的個(gè)體的方法。一般情況下，把通過重新組合的個(gè)體的方法。一般情況下，把通過生殖生殖細(xì)胞相互融合而達(dá)到這一目的過程稱為細(xì)胞相互融合而達(dá)到這一目的過程稱為雜交雜交；而把；而把由體細(xì)胞相互融合達(dá)到這一結(jié)果的過程稱為體細(xì)胞由體細(xì)胞相互融合達(dá)到這一結(jié)果的過程稱為體細(xì)胞雜交。雜交。一、分子雜交的概念一、分子雜交的概念2.2.分子雜交（分子雜交（moleucularmoleucular hybridizationhybridizati

3、on） 分子雜交在分子生物學(xué)上一般即指核酸分子雜分子雜交在分子生物學(xué)上一般即指核酸分子雜交，是指核酸分子在變性后再?gòu)?fù)性的過程中，來交，是指核酸分子在變性后再?gòu)?fù)性的過程中，來源不同但互補(bǔ)配對(duì)的源不同但互補(bǔ)配對(duì)的DNADNA或或RNARNA單鏈（包括單鏈（包括DNADNA和和DNADNA，DNADNA和和RNARNA和和RNARNA和和RNARNA）相互結(jié)合形成雜合）相互結(jié)合形成雜合雙鏈的特性或現(xiàn)象。雙鏈的特性或現(xiàn)象。 依據(jù)此特性建立的一種對(duì)目的核酸分子進(jìn)行依據(jù)此特性建立的一種對(duì)目的核酸分子進(jìn)行定性和定量分析的技術(shù)則稱為定性和定量分析的技術(shù)則稱為分子分子/核酸分子雜核酸分子雜交技術(shù)交技術(shù)(通常是將

4、一種核酸單鏈用同位素或非同通常是將一種核酸單鏈用同位素或非同位素標(biāo)記即探針，再與另一種核酸單鏈進(jìn)行分位素標(biāo)記即探針，再與另一種核酸單鏈進(jìn)行分子雜交，通過對(duì)探針的檢測(cè)而實(shí)現(xiàn)對(duì)未知核酸子雜交，通過對(duì)探針的檢測(cè)而實(shí)現(xiàn)對(duì)未知核酸分子的檢測(cè)和分析分子的檢測(cè)和分析)。3.3.核酸分子雜交（核酸分子雜交（nucleic acid moleucularnucleic acid moleucular hybridizationhybridization）是指具有互補(bǔ)序列的兩條核酸是指具有互補(bǔ)序列的兩條核酸單鏈單鏈在一定條件下按在一定條件下按堿基配對(duì)原則堿基配對(duì)原則形成形成雙鏈雙鏈的過的過程。雜交的雙方分別稱為程

5、。雜交的雙方分別稱為探針探針與與待測(cè)核酸待測(cè)核酸，雜交，雜交后形成的異源雙鏈分子稱為后形成的異源雙鏈分子稱為雜交分子雜交分子。 DNADNA雜交分子雜交分子DNARNA雜交分子雜交分子 DNA分子分子DNA分子分子復(fù)性復(fù)性RNADNA分子雜交分子雜交和和印跡技術(shù)印跡技術(shù)是目前生物醫(yī)學(xué)研究中最是目前生物醫(yī)學(xué)研究中最為常用的基本分子生物學(xué)技術(shù)，在生物醫(yī)學(xué)為常用的基本分子生物學(xué)技術(shù)，在生物醫(yī)學(xué)基基礎(chǔ)研究礎(chǔ)研究以及以及臨床診斷臨床診斷應(yīng)用等方面廣泛應(yīng)用，譬應(yīng)用等方面廣泛應(yīng)用，譬如用于基因克隆的篩選、基因的定量和定性分如用于基因克隆的篩選、基因的定量和定性分析及基因突變的檢測(cè)等。析及基因突變的檢測(cè)等。二

6、、核酸分子雜交的用途二、核酸分子雜交的用途 核酸分子雜交技術(shù)核酸分子雜交技術(shù)是目前生命科學(xué)研究領(lǐng)域中應(yīng)用最是目前生命科學(xué)研究領(lǐng)域中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一。廣泛的技術(shù)之一。用途：用途：1.1.是是定性定性或或定量檢測(cè)定量檢測(cè)特異特異DNADNA或或RNARNA序列片段的有力工具；序列片段的有力工具；2.2.在基因工程技術(shù)中，用放射性標(biāo)記或非放射性標(biāo)記的在基因工程技術(shù)中，用放射性標(biāo)記或非放射性標(biāo)記的寡核苷酸或寡核苷酸或cDNAcDNA探針進(jìn)行菌落雜交，探針進(jìn)行菌落雜交，可從可從cDNAcDNA文庫(kù)或基文庫(kù)或基因組文庫(kù)中篩選出特定的克隆，獲得某一重組體；因組文庫(kù)中篩選出特定的克隆，獲得某一重組體；3.

7、3.用克隆化的用克隆化的DNADNA片段作探針進(jìn)行片段作探針進(jìn)行SouthernSouthern雜交雜交，可確，可確定基因組定基因組DNADNA上上特定區(qū)域的核苷酸同源順序特定區(qū)域的核苷酸同源順序；4.4.用用S1S1核酸酶或核酸酶或RNARNA酶消化酶消化DNADNA/ /RNARNA或者或者RNARNA/ /RNARNA雜交雜交體是分析體是分析基因轉(zhuǎn)錄或基因轉(zhuǎn)錄或RNARNA加工加工的重要方法；的重要方法；5.5.對(duì)某一已知基因或已克隆測(cè)序的基因可利用核酸對(duì)某一已知基因或已克隆測(cè)序的基因可利用核酸雜交技術(shù)進(jìn)行染色體定位；雜交技術(shù)進(jìn)行染色體定位；6.6.可用于遺傳病的可用于遺傳病的基因診斷基

8、因診斷，用于限制性片段長(zhǎng)度，用于限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性作疾病的相關(guān)分析，基因連鎖分析，多態(tài)性作疾病的相關(guān)分析，基因連鎖分析，法醫(yī)學(xué)法醫(yī)學(xué)上的上的性別分析和親子鑒定性別分析和親子鑒定。7.7.在人類學(xué)研究中也有應(yīng)用價(jià)值。在人類學(xué)研究中也有應(yīng)用價(jià)值。核酸分子雜交的基本原理是：核酸分子雜交的基本原理是：具有互補(bǔ)序列的兩條單具有互補(bǔ)序列的兩條單鏈核酸分子在一定條件下鏈核酸分子在一定條件下（適宜的（適宜的溫度溫度及及離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度等等）堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，重新形成雙鏈堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，重新形成雙鏈；在這一過程中；在這一過程中，核酸分子經(jīng)歷了，核酸分子經(jīng)歷了變性變性和和復(fù)性復(fù)性的變化，以及復(fù)性過程的變化，以

9、及復(fù)性過程中分子間鍵的形成和斷裂等。雜交的雙方是中分子間鍵的形成和斷裂等。雜交的雙方是待測(cè)核酸待測(cè)核酸序列和序列和已知核酸已知核酸序列。在雜交體系中序列。在雜交體系中已知已知的的核酸序列核酸序列稱作稱作探針探針（probe ），探針通常用于進(jìn)行核素或非核），探針通常用于進(jìn)行核素或非核素示蹤標(biāo)記。素示蹤標(biāo)記。三、核酸分子雜交的原理三、核酸分子雜交的原理探針的意義：探針的意義：要檢測(cè)某一樣品或基因組要檢測(cè)某一樣品或基因組DNADNA中特中特定的定的DNADNA順序或基因片段，首先必須獲得相應(yīng)的順序或基因片段，首先必須獲得相應(yīng)的探針，即已知順序的探針，即已知順序的DNADNA或或RNARNA片段，并

10、使它帶上片段，并使它帶上可檢測(cè)到的示蹤可檢測(cè)到的示蹤標(biāo)記標(biāo)記。 A T C G G T A C A T T A G C C A T G T A 探針探針序列序列待測(cè)樣本待測(cè)樣本序列序列分子雜交的形式：分子雜交的形式： 固固液相雜交液相雜交 一般在進(jìn)行某一核酸順序的檢測(cè)一般在進(jìn)行某一核酸順序的檢測(cè)時(shí)，先將待測(cè)的單鏈靶核酸時(shí)，先將待測(cè)的單鏈靶核酸固定在適當(dāng)?shù)妮d體固定在適當(dāng)?shù)妮d體上，然后置于上，然后置于含相應(yīng)單鏈核酸探針的含相應(yīng)單鏈核酸探針的雜交反應(yīng)體系雜交反應(yīng)體系中，通過堿基互補(bǔ)配對(duì)中，通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，兩條單鏈的同源順序通過氫鍵互相結(jié)合，形成雙鏈結(jié)原則，兩條單鏈的同源順序通過氫鍵互相結(jié)合，形

11、成雙鏈結(jié)構(gòu)。經(jīng)過對(duì)標(biāo)記探針的檢測(cè)可以判斷待檢測(cè)樣品中相應(yīng)順序構(gòu)。經(jīng)過對(duì)標(biāo)記探針的檢測(cè)可以判斷待檢測(cè)樣品中相應(yīng)順序的的存在與否存在與否及及分子量大小分子量大小。 液相雜交液相雜交 有時(shí)也將待測(cè)核酸和已知核酸同時(shí)放有時(shí)也將待測(cè)核酸和已知核酸同時(shí)放在在液體中液體中進(jìn)行雜交反應(yīng)。進(jìn)行雜交反應(yīng)。 兩種雜交形式的兩種雜交形式的基本原理都是一樣的?；驹矶际且粯拥?。 從發(fā)展歷史來看從發(fā)展歷史來看, ,先有先有液相雜交液相雜交, ,后有后有固固液相雜交液相雜交. . 1.1.變性變性：在：在物理或化學(xué)因素物理或化學(xué)因素作用下，例如作用下，例如加熱加熱、酸酸堿堿或或紫外線紫外線照射，可以導(dǎo)致兩條照射，可以導(dǎo)致

12、兩條DNADNA鏈之間的鏈之間的氫鍵斷氫鍵斷裂裂，而核酸分子中的所有共價(jià)鍵（如磷酸二酯鍵、，而核酸分子中的所有共價(jià)鍵（如磷酸二酯鍵、糖苷鍵等）則不受影響，稱為糖苷鍵等）則不受影響，稱為DNADNA變性變性（DNA DNA denaturationdenaturation）。）。 四、核酸分子雜交的過程四、核酸分子雜交的過程DNADNA的的變性變性與與復(fù)性復(fù)性導(dǎo)致導(dǎo)致DNADNA變性的常用方法有三種：變性的常用方法有三種：熱變性熱變性堿變性堿變性化學(xué)試劑變性?；瘜W(xué)試劑變性。變性的情況：變性的情況：a. T70a. T700 0C C，DNADNA幾乎不變性；幾乎不變性；b. 70b. 700 0

13、CT90CT90c. T900 0C C，DNADNA變性使雙鏈打開，成為單鏈分子；變性使雙鏈打開，成為單鏈分子；d .T100d .T1000 0C C，DNADNA雙鏈分離。雙鏈分離。 所以，一般核酸變性的溫度都選在所以，一般核酸變性的溫度都選在90901001000 0C C之間。之間。 （1 1）熱變性）熱變性：當(dāng)升高核酸溶液的溫度時(shí)，核酸當(dāng)升高核酸溶液的溫度時(shí)，核酸雙鏈間的氫鍵發(fā)生斷裂，核酸的雙鏈逐漸打開。雙鏈間的氫鍵發(fā)生斷裂，核酸的雙鏈逐漸打開。（2 2）酸堿變性）酸堿變性：當(dāng)核酸溶液的：當(dāng)核酸溶液的pHpH低于低于3 3或高于或高于1010時(shí)，核時(shí)，核酸的雙鏈可以完全打開成為單鏈

14、核酸分子。在分子雜交酸的雙鏈可以完全打開成為單鏈核酸分子。在分子雜交中，中，最常用最常用的核酸變性方法是的核酸變性方法是堿變性堿變性。因通常需要的核。因通常需要的核酸的載體如酸的載體如凝膠凝膠或或膜膜對(duì)熱都不穩(wěn)定對(duì)熱都不穩(wěn)定。（3 3）化學(xué)試劑變性）化學(xué)試劑變性：當(dāng)核酸溶液中含有一定濃度的化學(xué)試劑：當(dāng)核酸溶液中含有一定濃度的化學(xué)試劑如如尿素、甲醛尿素、甲醛等時(shí)，兩條鏈之間的氫鍵可以斷裂而形成單鏈核等時(shí)，兩條鏈之間的氫鍵可以斷裂而形成單鏈核酸分子。酸分子。 除物理、化學(xué)因素外，除物理、化學(xué)因素外，DNADNA分子的組成也影響變性。最主分子的組成也影響變性。最主要的因素是要的因素是DNADNA分子

15、中的分子中的GCGC含量，含量，GCGC含量高的含量高的DNADNA不易變性，而不易變性，而ATAT含量高的含量高的DNADNA容易變性。容易變性。另外另外, ,環(huán)狀環(huán)狀DNADNA比線性比線性DNADNA難于變性難于變性. . DNADNA的變性是可逆的的變性是可逆的，即兩條互補(bǔ)的單鏈，即兩條互補(bǔ)的單鏈DNADNA分分子在變性條件除去后子在變性條件除去后重新重新按堿基互補(bǔ)原則以氫鍵相按堿基互補(bǔ)原則以氫鍵相連連形成雙鏈形成雙鏈DNADNA分子分子，這一過程稱作，這一過程稱作DNADNA復(fù)性復(fù)性（DNA DNA renaturationrenaturation） 。如果是如果是異源雙鏈分子的結(jié)合

16、異源雙鏈分子的結(jié)合則稱為則稱為雜交雜交(hybridization) 。 相似的復(fù)性或雜交反應(yīng)可以發(fā)生在任何具有互補(bǔ)相似的復(fù)性或雜交反應(yīng)可以發(fā)生在任何具有互補(bǔ)核苷酸順序的兩條單股核酸鏈之間，如核苷酸順序的兩條單股核酸鏈之間，如DNA/DNA/DNADNA，DNA/DNA/RNARNA，RNA/RNA/RNARNA或人工合成的寡核苷酸片段與或人工合成的寡核苷酸片段與DNADNA、RNARNA等。等。2.2.復(fù)性復(fù)性1.1.核酸分子的濃度和長(zhǎng)度：核酸分子的濃度和長(zhǎng)度：濃度越大，復(fù)性速度越快；分子濃度越大，復(fù)性速度越快；分子 量越大，復(fù)性速度越慢。量越大，復(fù)性速度越慢。 一般情況下：探針濃度為一般情

17、況下：探針濃度為0.10.10.5g0.5g；長(zhǎng)度為；長(zhǎng)度為5050300 bp300 bp2.2.溫度：溫度：適宜溫度為適宜溫度為 比比TmTm值值低低 25250 0C C TmTm雙鏈雙鏈DNADNA變性一半所需要的溫度變性一半所需要的溫度(DNA(DNA的溶解溫度，的溶解溫度，meltingmelting temperature,Tm temperature,Tm）3.3.離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度： 低離子（低離子（NaNa+ +）強(qiáng)度下，核酸雜交非常緩慢，）強(qiáng)度下，核酸雜交非常緩慢，離離 子強(qiáng)度增加，雜交反應(yīng)率增提高。所以，必須維持較高的子強(qiáng)度增加，雜交反應(yīng)率增提高。所以，必須維持較高的

18、雜交反應(yīng)液和洗膜液的鹽濃度雜交反應(yīng)液和洗膜液的鹽濃度 五、影響核酸分子雜交的因素五、影響核酸分子雜交的因素 核酸分子雜交實(shí)際上就是兩條互補(bǔ)的單鏈核酸分子通過復(fù)性核酸分子雜交實(shí)際上就是兩條互補(bǔ)的單鏈核酸分子通過復(fù)性重新締合形成雙鏈的過程。這一過程受到重新締合形成雙鏈的過程。這一過程受到諸多因素諸多因素的影響。的影響。4.4.雜交液中的甲酰胺：雜交液中的甲酰胺：甲酰胺能降低核酸雜交的甲酰胺能降低核酸雜交的TmTm值，從而使得：（值，從而使得：（1 1）在低溫下探針更穩(wěn)定；）在低溫下探針更穩(wěn)定； （2 2）能更好地保留非共價(jià)結(jié)合）能更好地保留非共價(jià)結(jié)合 的核酸。的核酸。 一般是：一般是：50%50%

19、甲酰胺甲酰胺 353542420 0C C5.5.核酸分子的復(fù)雜性：核酸分子的復(fù)雜性：不同順序的總長(zhǎng)度不同順序的總長(zhǎng)度( (堿基數(shù)）堿基數(shù)）6.6.非特異性雜交反應(yīng)：非特異性雜交反應(yīng)： 須在雜交前封閉非特異性雜須在雜交前封閉非特異性雜 交位點(diǎn)，以減少其對(duì)探針的非特異性吸附作用交位點(diǎn)，以減少其對(duì)探針的非特異性吸附作用1. Southern1. Southern印跡雜交（印跡雜交（Southern blotSouthern blot） 鑒別鑒別DNADNA靶分子（待測(cè)核酸是靶分子（待測(cè)核酸是DNADNA）六、核酸分子雜交的基本方法六、核酸分子雜交的基本方法3. 3. 斑點(diǎn)雜交、斑點(diǎn)雜交、4. 4.

20、 原位雜交、原位雜交、5. 5. 核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)等。核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)等。2. Northern2. Northern印跡雜交（印跡雜交（Northern blotNorthern blot） 鑒別鑒別RNARNA靶分子（待測(cè)核酸是靶分子（待測(cè)核酸是RNARNA）根據(jù)其用途可將核酸分子雜交分為幾種基本類型：根據(jù)其用途可將核酸分子雜交分為幾種基本類型：SouthernSouthern印跡雜交印跡雜交是指是指DNADNA與與DNADNA的雜交，將電泳分的雜交，將電泳分離的待測(cè)離的待測(cè)DNADNA片段轉(zhuǎn)印并結(jié)合到一定的固相支持物片段轉(zhuǎn)印并結(jié)合到一定的固相支持物上，然后用標(biāo)記的上，然后用標(biāo)記的DNADNA

21、探針檢測(cè)待測(cè)探針檢測(cè)待測(cè)DNADNA的一種方法。的一種方法。這是這是19751975年英國(guó)愛丁堡大學(xué)的年英國(guó)愛丁堡大學(xué)的SouthernSouthern建立的方法，建立的方法，因此而得名。因此而得名。 基本步驟：基本步驟：（一）（一）SouthernSouthern印跡雜交印跡雜交 1.1.待測(cè)核酸樣品的制備待測(cè)核酸樣品的制備（1 1）制備待測(cè)）制備待測(cè)DNADNA：從樣本的細(xì)胞或組織中制備從樣本的細(xì)胞或組織中制備DNADNA（2 2）DNADNA的限制酶消化：的限制酶消化：將將DNADNA切割成大小不同的片段切割成大小不同的片段 2.2.待測(cè)待測(cè)DNADNA樣品的電泳分離：樣品的電泳分離：將

22、將DNADNA樣品在樣品在0.80.81.0%1.0%瓊脂瓊脂糖凝膠中電泳，以對(duì)糖凝膠中電泳，以對(duì)DNADNA片段進(jìn)行分離（瓊脂糖凝膠是由瓊片段進(jìn)行分離（瓊脂糖凝膠是由瓊脂糖形成的網(wǎng)狀物質(zhì)，具有分子篩的作用，脂糖形成的網(wǎng)狀物質(zhì)，具有分子篩的作用，DNADNA因其分子大因其分子大小小而在瓊脂糖凝膠中的泳動(dòng)而在瓊脂糖凝膠中的泳動(dòng)速度不同速度不同達(dá)到分離）。達(dá)到分離）。 3.3.凝膠中核酸的變性：凝膠中核酸的變性：對(duì)凝膠中的對(duì)凝膠中的DNADNA進(jìn)行堿變性，使其進(jìn)行堿變性，使其形成較短的單鏈片段。形成較短的單鏈片段。 4.Southern 4.Southern 轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜：將凝膠中的將凝膠中的DNA

23、DNA片段轉(zhuǎn)移到硝酸纖維片段轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜（膜（NCNC）等固相支持物上。各個(gè)）等固相支持物上。各個(gè)DNADNA片段在膜上的相對(duì)位置片段在膜上的相對(duì)位置與在凝膠中的相對(duì)位置是一樣的，故稱為與在凝膠中的相對(duì)位置是一樣的，故稱為印跡印跡（blotblot）。）。 （1 1）毛細(xì)管虹吸印跡法：）毛細(xì)管虹吸印跡法：利用濃鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動(dòng)利用濃鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動(dòng)作用，將凝膠中的作用，將凝膠中的DNADNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。轉(zhuǎn)移到固相支持物上。 （見下頁圖見下頁圖）（2 2）電轉(zhuǎn)印法：通過電泳作用將凝膠中的）電轉(zhuǎn)印法：通過電泳作用將凝膠中的DNADNA轉(zhuǎn)移到濾轉(zhuǎn)移到濾膜上。膜上。（3 3）真空轉(zhuǎn)移法

24、：其原理與毛細(xì)管虹吸印跡法相同。）真空轉(zhuǎn)移法：其原理與毛細(xì)管虹吸印跡法相同。Southern Southern 轉(zhuǎn)膜的方法轉(zhuǎn)膜的方法重物重物濕濾紙濕濾紙吸水紙吸水紙玻璃板玻璃板膠膠膜膜濕濾紙濕濾紙濕濾紙橋濕濾紙橋支持平臺(tái)支持平臺(tái)玻璃容器玻璃容器20SSC毛細(xì)管虹吸法毛細(xì)管虹吸法Southern轉(zhuǎn)膜示意圖轉(zhuǎn)膜示意圖5. 5. 探針的制備：探針的制備：用缺口平移或隨機(jī)引物標(biāo)記的方法用缺口平移或隨機(jī)引物標(biāo)記的方法 制備探針、標(biāo)記。制備探針、標(biāo)記。7.7. 雜交結(jié)果的檢測(cè)雜交結(jié)果的檢測(cè)（1 1） 放射線標(biāo)記放射線標(biāo)記放射自顯影，感光膠片，顯出黑放射自顯影，感光膠片，顯出黑 色雜交帶；色雜交帶；（2 2

25、） 非放射線標(biāo)記非放射線標(biāo)記直接顯出雜交帶，進(jìn)行檢測(cè)。直接顯出雜交帶，進(jìn)行檢測(cè)。6. Southern6. Southern雜交雜交（1 1） 預(yù)雜交預(yù)雜交 封閉膜上所有能與封閉膜上所有能與DNADNA結(jié)合的位點(diǎn)轉(zhuǎn)印后結(jié)合的位點(diǎn)轉(zhuǎn)印后 的膜在預(yù)雜交液（不含探針的雜交液）的膜在預(yù)雜交液（不含探針的雜交液）4 46 6小時(shí)小時(shí)（2 2） 雜交雜交 （過夜）（過夜）分子雜交實(shí)驗(yàn)過程分子雜交實(shí)驗(yàn)過程目目 錄錄放放射射自自顯顯影影照照片片目目 錄錄分分子子雜雜交交電電泳泳圖圖目目 錄錄 SouthernSouthern印跡雜交在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用印跡雜交在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 SouthernSouthern印跡雜交

26、技術(shù)已有印跡雜交技術(shù)已有3030多年的歷史，多年的歷史，在核酸的結(jié)構(gòu)和功能研究中作出過重要貢獻(xiàn)。在核酸的結(jié)構(gòu)和功能研究中作出過重要貢獻(xiàn)。 如：發(fā)現(xiàn)成熟如：發(fā)現(xiàn)成熟B B細(xì)胞中免疫球蛋白基因重細(xì)胞中免疫球蛋白基因重排現(xiàn)象；進(jìn)行克隆基因的酶切圖譜分析；特定排現(xiàn)象；進(jìn)行克隆基因的酶切圖譜分析；特定基因的定性和定量；基因的定性和定量；DNADNA多態(tài)性多態(tài)性(RFLP,RAPD,AFLP(RFLP,RAPD,AFLP等等) )分析分析 NorthernNorthern印跡雜交印跡雜交是指將待測(cè)是指將待測(cè)RNARNA樣品經(jīng)電泳分離后樣品經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)移到固相支持物上，然后與標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行轉(zhuǎn)移到固相支

27、持物上，然后與標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行固固液相雜交，以檢測(cè)液相雜交，以檢測(cè)RNARNA（主要是（主要是mRNAmRNA）的方法。其）的方法。其基本原理和基本過程與基本原理和基本過程與SouthernSouthern印跡雜交印跡雜交基本相同基本相同。只是在以下幾點(diǎn)有所不同。只是在以下幾點(diǎn)有所不同。（二）（二）NorthernNorthern印跡雜交印跡雜交1. 1. 靶核酸靶核酸RNARNA2. RNA2. RNA電泳電泳在變性膠中進(jìn)行（加入變性劑，以維持單在變性膠中進(jìn)行（加入變性劑，以維持單 鏈線性狀態(tài)）鏈線性狀態(tài)）3. 3. 轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜電泳后不需要再進(jìn)行變性和中和，直接用毛電泳后不需要再進(jìn)行變性和中

28、和，直接用毛 細(xì)管虹吸法細(xì)管虹吸法等方法轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移。 （三）斑點(diǎn)及狹縫印跡雜交（三）斑點(diǎn)及狹縫印跡雜交特點(diǎn)：特點(diǎn)：簡(jiǎn)單、快速，可在同一張膜上同時(shí)進(jìn)行多個(gè)簡(jiǎn)單、快速，可在同一張膜上同時(shí)進(jìn)行多個(gè)樣品的檢測(cè)；樣品的檢測(cè)； 但不能鑒別分子量，且特異性不高，但不能鑒別分子量，且特異性不高，有一定比例的假陽性。有一定比例的假陽性。 將將RNARNA或或DNADNA變性后變性后直接點(diǎn)樣直接點(diǎn)樣于硝酸纖維膜和尼龍于硝酸纖維膜和尼龍膜上，用于基因組中特定基因及其表達(dá)的定性及定膜上，用于基因組中特定基因及其表達(dá)的定性及定量研究，稱為量研究，稱為斑點(diǎn)印跡斑點(diǎn)印跡( (dot blotdot blot) )。 如如印

29、跡印跡是線狀則為是線狀則為狹縫印跡狹縫印跡或或狹線印跡狹線印跡( (slot slot blotblot） （四）原位雜交（四）原位雜交 核酸保持在細(xì)胞或組織樣本中，經(jīng)適當(dāng)?shù)姆椒ㄌ幚砑?xì)核酸保持在細(xì)胞或組織樣本中，經(jīng)適當(dāng)?shù)姆椒ㄌ幚砑?xì)胞或組織后，將標(biāo)記的核酸胞或組織后，將標(biāo)記的核酸探針探針與與細(xì)胞或組織中的核酸細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行進(jìn)行雜交雜交，稱為，稱為原位雜交（原位雜交（in situin situ hybridization hybridization）。 這是一種標(biāo)記這是一種標(biāo)記DNADNA與整個(gè)染色體雜交并且發(fā)生雜交的與整個(gè)染色體雜交并且發(fā)生雜交的區(qū)域可通過顯微鏡觀察的技術(shù)。區(qū)域可通過顯

30、微鏡觀察的技術(shù)。特點(diǎn)：特點(diǎn)：（1 1）不受組織成分的影響；不受組織成分的影響；（2 2）靈敏度高；靈敏度高；（3 3）可完可完整保持細(xì)胞或組織形態(tài)，準(zhǔn)確反映組織細(xì)胞的相互關(guān)系及整保持細(xì)胞或組織形態(tài)，準(zhǔn)確反映組織細(xì)胞的相互關(guān)系及功能；功能；（4 4）可檢測(cè)多個(gè)探針?？蓹z測(cè)多個(gè)探針。 核酸原位雜交包括核酸原位雜交包括組織細(xì)胞的固定、預(yù)雜交、雜交、沖組織細(xì)胞的固定、預(yù)雜交、雜交、沖洗洗及及信號(hào)檢測(cè)信號(hào)檢測(cè)等基本步驟。等基本步驟。1. 1. 組織或細(xì)胞的固定組織或細(xì)胞的固定2. 2. 組織細(xì)胞雜交前的預(yù)處理（預(yù)雜交）組織細(xì)胞雜交前的預(yù)處理（預(yù)雜交）3. 3. 探針的選擇和標(biāo)記探針的選擇和標(biāo)記4. 4.

31、 雜交雜交5. 5. 雜交結(jié)果檢測(cè)雜交結(jié)果檢測(cè) 重點(diǎn)介紹重點(diǎn)介紹熒光原位雜交熒光原位雜交（fluorescence fluorescence in situin situ hybridization,FISH hybridization,FISH）概念：概念：液相雜交是指待測(cè)核酸分子與核酸探針都存在于液相雜交是指待測(cè)核酸分子與核酸探針都存在于雜交液中，堿基互補(bǔ)的單鏈核酸分子在液體中配對(duì)形成雜交液中，堿基互補(bǔ)的單鏈核酸分子在液體中配對(duì)形成雜交分子。雜交分子。種類：種類： A. RNAA. RNA酶保護(hù)分析法酶保護(hù)分析法(RNase protection assay, RPA)(RNase pro

32、tection assay, RPA) 用于用于mRNAmRNA定量、定量、mRNAmRNA末端定位及確定內(nèi)含子在相應(yīng)基末端定位及確定內(nèi)含子在相應(yīng)基因中的位置等。因中的位置等。（五）液相雜交（五）液相雜交1. 1. 制備待測(cè)制備待測(cè)RNA; 2. RNARNA; 2. RNA探針的標(biāo)記探針的標(biāo)記3. 3. 雜交雜交; 4. ; 4. 除去單鏈除去單鏈RNARNA5. 5. 電泳分析電泳分析 B.B.核酸酶核酸酶S1S1保護(hù)分析法保護(hù)分析法(nuclease S1 (nuclease S1 protection assay)protection assay) 用于基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)分析及內(nèi)含子剪切

33、用于基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)分析及內(nèi)含子剪切位點(diǎn)分析。位點(diǎn)分析。 其原理與其原理與RNARNA酶保護(hù)分析法類似酶保護(hù)分析法類似. . 分子雜交技術(shù)最早始于分子雜交技術(shù)最早始于Benjamin HallBenjamin Hall等于等于19611961年的探索，他將探針與靶序列在溶液中雜年的探索，他將探針與靶序列在溶液中雜交，通過平衡密度梯度離心來分離雜交體，這交，通過平衡密度梯度離心來分離雜交體，這實(shí)際為實(shí)際為液相雜交液相雜交。 由于雜交后過量的未雜交探針在溶液中除去由于雜交后過量的未雜交探針在溶液中除去較為困難，同時(shí)誤差較高且操作繁瑣復(fù)雜，因較為困難，同時(shí)誤差較高且操作繁瑣復(fù)雜，因此其應(yīng)用較少。此其

34、應(yīng)用較少。 一般都用固固液相雜交液相雜交 1. cDNA1. cDNA探針探針：逆轉(zhuǎn)錄：逆轉(zhuǎn)錄 cDNA cDNA 克隆于載體克隆于載體 擴(kuò)增重組擴(kuò)增重組 質(zhì)粒質(zhì)粒 提取質(zhì)粒提取質(zhì)粒 消化重組質(zhì)粒消化重組質(zhì)粒 切割切割cDNAcDNA片段片段 分離純化分離純化 cDNA cDNA探針探針 cDNAcDNA探針應(yīng)用最廣泛探針應(yīng)用最廣泛2. 2. 基因組基因組DNADNA探針探針：從基因組文庫(kù)：從基因組文庫(kù) 篩選特定基因（或基篩選特定基因（或基 因片段）因片段） 克隆克隆 擴(kuò)增擴(kuò)增 純化純化 切取片段切取片段 分離純化分離純化 探針探針3. 3. 寡核苷酸探針寡核苷酸探針：一定長(zhǎng)度的寡核苷酸片段（

35、十幾個(gè)核苷酸：一定長(zhǎng)度的寡核苷酸片段（十幾個(gè)核苷酸 以上）以上）4. RNA4. RNA探針探針：以：以RNARNA作為探針作為探針 （基因克隆和體外轉(zhuǎn)錄獲得）（基因克隆和體外轉(zhuǎn)錄獲得）七、探針的標(biāo)記七、探針的標(biāo)記（一）探針的種類（一）探針的種類1.1.核素標(biāo)記物核素標(biāo)記物一般用一般用-3232P,P,但但55末端必須用末端必須用-3232P P。2.2.非核素標(biāo)記物非核素標(biāo)記物（1 1）半抗原：）半抗原：生物素生物素(biotin)(biotin)和和地高辛地高辛(digoxin, digacin, DIG)（2 2）配體：）配體：生物素既是生物素既是半抗原半抗原，又是，又是親和素親和素(

36、(avidinavidin， 抗生物素蛋白抗生物素蛋白) )，故可用生物素，故可用生物素- -親和素反親和素反 應(yīng)進(jìn)行雜交信號(hào)檢測(cè)應(yīng)進(jìn)行雜交信號(hào)檢測(cè)（3 3）熒光素：）熒光素：異硫氰酸熒光素異硫氰酸熒光素( FITC)( FITC)（4 4）化學(xué)發(fā)光探針）化學(xué)發(fā)光探針（二）標(biāo)記物（二）標(biāo)記物1. 1. 缺口平移法缺口平移法(nick translation) (nick translation) (見圖見圖) ) 2. 2. 隨機(jī)引物法隨機(jī)引物法(randon primer) (randon primer) （見圖）（見圖）3. PCR3. PCR標(biāo)記法標(biāo)記法4. 4. 末端標(biāo)記法末端標(biāo)記法

37、（三）標(biāo)記方法（三）標(biāo)記方法缺口平移法標(biāo)記缺口平移法標(biāo)記DNADNA探針探針DNase；Mg2+53 模板模板DNADNA35533 隨機(jī)打開缺口隨機(jī)打開缺口5DNA聚合酶；聚合酶；-32P-dCTP；dNTPs標(biāo)記的探針標(biāo)記的探針隨機(jī)引物法標(biāo)記隨機(jī)引物法標(biāo)記DNADNA探針探針53 模板模板DNADNA3553變性變性53Klenow聚合酶；聚合酶；-32P-dCTP；dNTPs變性變性標(biāo)記的探針標(biāo)記的探針隨機(jī)引物隨機(jī)引物1.1.乙醇沉淀法乙醇沉淀法2. Sephadex G-502. Sephadex G-50柱層析法柱層析法3.3.微柱離心法微柱離心法 （四）探針的純化（四）探針的純化

38、印跡技術(shù)不僅可用于核酸的分子檢測(cè)，也可以用印跡技術(shù)不僅可用于核酸的分子檢測(cè)，也可以用于蛋白質(zhì)的檢測(cè)。蛋白質(zhì)在電泳分離之后也可以轉(zhuǎn)于蛋白質(zhì)的檢測(cè)。蛋白質(zhì)在電泳分離之后也可以轉(zhuǎn)移并固定于膜上，相對(duì)應(yīng)于移并固定于膜上，相對(duì)應(yīng)于DNADNA的的SouthernSouthern印跡和印跡和RNARNA的的NorthernNorthern印跡，該印跡方法則被稱為印跡，該印跡方法則被稱為WesternWestern印跡印跡（Western blotWestern blot或或Western blottingWestern blotting）或）或蛋白蛋白印跡印跡。八、八、WesternWestern印跡印跡

39、 蛋白質(zhì)印跡技術(shù)的過程與蛋白質(zhì)印跡技術(shù)的過程與DNADNA和和RNARNA的印跡技術(shù)基本類的印跡技術(shù)基本類似，但也有很多似，但也有很多不同之處不同之處，譬如，譬如Western BlotWestern Blot是采用變是采用變性聚丙烯酰胺性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白質(zhì)分離凝膠電泳進(jìn)行蛋白質(zhì)分離，利用，利用免疫學(xué)的免疫學(xué)的抗原抗原- -抗體反應(yīng)來檢測(cè)被轉(zhuǎn)印的蛋白質(zhì)抗體反應(yīng)來檢測(cè)被轉(zhuǎn)印的蛋白質(zhì)，被檢測(cè)物是蛋，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，白質(zhì)，“探針探針”是抗體是抗體，“顯色顯色”用標(biāo)記的二抗。因?yàn)橛脴?biāo)記的二抗。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)印跡技術(shù)涉及到利用免疫學(xué)的抗原蛋白質(zhì)印跡技術(shù)涉及到利用免疫學(xué)的抗原- -抗體反應(yīng)來抗體反

40、應(yīng)來檢測(cè)被轉(zhuǎn)印的蛋白質(zhì)，故也被稱為檢測(cè)被轉(zhuǎn)印的蛋白質(zhì)，故也被稱為免疫印跡技術(shù)免疫印跡技術(shù)（immuno-blottingimmuno-blotting）。）。Western blot 原理：原理： WesternWestern印跡的基本步驟：印跡的基本步驟：1 1蛋白質(zhì)樣品的制備：蛋白質(zhì)樣品的制備： 根據(jù)樣品的組織來源、細(xì)胞類型和待測(cè)蛋白質(zhì)的性質(zhì)來根據(jù)樣品的組織來源、細(xì)胞類型和待測(cè)蛋白質(zhì)的性質(zhì)來選擇合適的蛋白質(zhì)樣品制備方法。不同來源的組織、細(xì)胞、選擇合適的蛋白質(zhì)樣品制備方法。不同來源的組織、細(xì)胞、目標(biāo)蛋白，蛋白質(zhì)樣品的制備方法也不僅相同。譬如細(xì)菌、目標(biāo)蛋白，蛋白質(zhì)樣品的制備方法也不僅相同。譬如

41、細(xì)菌、酵母、組織培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞、哺乳動(dòng)物組織來源的蛋酵母、組織培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞、哺乳動(dòng)物組織來源的蛋白質(zhì)樣品制備的方法明顯不同，膜蛋白、核蛋白和可溶性白質(zhì)樣品制備的方法明顯不同，膜蛋白、核蛋白和可溶性蛋白的制備方法也明顯不同。蛋白質(zhì)樣品制備好后可用蛋白的制備方法也明顯不同。蛋白質(zhì)樣品制備好后可用BradfordBradford比色法、比色法、LowryLowry法、二喹啉甲酸（法、二喹啉甲酸（BCABCA）比色法等）比色法等來測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，其中以來測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，其中以BradfordBradford比色法最為常用。比色法最為常用。2 2蛋白質(zhì)樣品的分離：蛋白質(zhì)樣品的分離： 主要采用不

42、連續(xù)主要采用不連續(xù)SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝膠（聚丙烯酰胺凝膠（PAGEPAGE）電泳對(duì)蛋白質(zhì)樣品按照分子量大小進(jìn)行分離。通常電泳對(duì)蛋白質(zhì)樣品按照分子量大小進(jìn)行分離。通常同時(shí)使用強(qiáng)陰離子去污劑同時(shí)使用強(qiáng)陰離子去污劑SDSSDS與某一還原劑（如巰與某一還原劑（如巰基乙醇），并通過加熱使蛋白質(zhì)變性解離成單個(gè)的基乙醇），并通過加熱使蛋白質(zhì)變性解離成單個(gè)的亞基后再加樣于電泳凝膠上。亞基后再加樣于電泳凝膠上。3 3轉(zhuǎn)?。恨D(zhuǎn)?。?將經(jīng)過電泳分離的蛋白質(zhì)樣品轉(zhuǎn)移到固相膜將經(jīng)過電泳分離的蛋白質(zhì)樣品轉(zhuǎn)移到固相膜載體上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，載體上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離

43、的多肽類型及其生物學(xué)活性且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。不變。 轉(zhuǎn)印方法主要采用電轉(zhuǎn)印法，主要有水浴式電轉(zhuǎn)印方法主要采用電轉(zhuǎn)印法，主要有水浴式電轉(zhuǎn)印即濕轉(zhuǎn)和半干式轉(zhuǎn)印兩種方式。轉(zhuǎn)印即濕轉(zhuǎn)和半干式轉(zhuǎn)印兩種方式。4 4檢測(cè)與結(jié)果分析：檢測(cè)與結(jié)果分析： 以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體起體起免疫反應(yīng)，再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，最后通過化學(xué)發(fā)光來檢測(cè)目的蛋白的有無和所在反應(yīng)，最后通過化學(xué)發(fā)光來檢測(cè)目的蛋白的有無和所在位置及分子量大小。位置及分子量大小。 需要注意的是，在

44、進(jìn)行抗原需要注意的是，在進(jìn)行抗原- -抗體反應(yīng)之前，一般需抗體反應(yīng)之前，一般需用去脂奶粉等作為封閉劑對(duì)固相膜載體和一些無關(guān)蛋白用去脂奶粉等作為封閉劑對(duì)固相膜載體和一些無關(guān)蛋白質(zhì)的潛在結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行封閉處理，以降低背景信號(hào)和非質(zhì)的潛在結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行封閉處理，以降低背景信號(hào)和非特異性結(jié)合。特異性結(jié)合。 作為分子生物學(xué)的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法，該技術(shù)已經(jīng)被作為分子生物學(xué)的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法，該技術(shù)已經(jīng)被廣泛廣泛應(yīng)用于分子醫(yī)學(xué)領(lǐng)域用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)應(yīng)用于分子醫(yī)學(xué)領(lǐng)域用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)，是當(dāng)代是當(dāng)代分析和鑒定蛋白質(zhì)的最有效的技術(shù)之一分析和鑒定蛋白質(zhì)的最有效的技術(shù)之一。這一技術(shù)的靈。這一技術(shù)的靈敏度能達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的固相放

45、射免疫分析的水平而又無需像敏度能達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的固相放射免疫分析的水平而又無需像免疫沉淀法那樣必須對(duì)靶蛋白進(jìn)行放射性標(biāo)記。此外，免疫沉淀法那樣必須對(duì)靶蛋白進(jìn)行放射性標(biāo)記。此外，由于蛋白質(zhì)的電泳分離幾乎總在變性條件下進(jìn)行，因此，由于蛋白質(zhì)的電泳分離幾乎總在變性條件下進(jìn)行，因此，也不存在溶解、聚集以及靶蛋白與外來蛋白的共沉淀等也不存在溶解、聚集以及靶蛋白與外來蛋白的共沉淀等諸多問題。諸多問題。 印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用（一）（一）DNA印跡技術(shù)印跡技術(shù) (Southern blotting) 用于基因組用于基因組DNADNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。分析。（二）（二）

46、RNA印跡技術(shù)印跡技術(shù) (Northern blotting) 用于用于RNARNA的定性定量分析的定性定量分析。（三）蛋白質(zhì)的印跡分析（三）蛋白質(zhì)的印跡分析 (Western blotting) 用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。 Western Blot 圖片圖片western blot 結(jié)果：結(jié)果：GAPDHBmi-1M 1 2 3 4 5 6 Bmi-1- actinCon GFPsi Bmi-1si M: Marker ; 1, 2: MCF-7/Bmi-1si (Bmi-1si); 3, 4: MCF-7/GFPsi (GFPsi); 5, 6:

47、MCF-7 (con)博士論文答辯博士論文答辯western blotp53Bcl-2BaxpAkt(ser473)tAkt-actin 1 2 3 4 5 6 沉默沉默Bmi-1基因?qū)ο嚓P(guān)蛋白表達(dá)的影響基因?qū)ο嚓P(guān)蛋白表達(dá)的影響 1, MCF-7; 2, MCF-7+DOX; 3, MCF-7/GFPsi; 4, MCF-7/GFPsi+DOX; 5, MCF-7/Bmi-1si; 6, MCF-7/Bmi-1si + DOX。博士論文答辯博士論文答辯WB檢測(cè)檢測(cè)-arrestin1/2 蛋白水平的變化蛋白水平的變化 Fig 2-1. 骨髓中骨髓中-arrestin1/2 蛋白水平的變化蛋白水

48、平的變化 Vs NL, *P0.01*Fig 2-2. 外周血中外周血中-arrestin1/2 蛋白水平的變化蛋白水平的變化 Vs NL, *P0.01*三種印跡技術(shù)的比較三種印跡技術(shù)的比較九、熒光原位雜交（九、熒光原位雜交（FISH）技術(shù)）技術(shù)及其在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用及其在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用（一）熒光原位雜交技術(shù)的概念（一）熒光原位雜交技術(shù)的概念 熒光原位雜交熒光原位雜交(Fluorescence (Fluorescence in situ in situ hybridization , FISH) FISH) 是一種在放射性原位雜交基礎(chǔ)上發(fā)展起來的非放射是一種在放射性原位雜交基礎(chǔ)上發(fā)展起來的非放射性

49、原位雜交技術(shù)，是把性原位雜交技術(shù)，是把生物素生物素或或地高辛地高辛(DIG)(DIG)等標(biāo)記等標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記的物質(zhì)標(biāo)記的DNADNA片段作為片段作為探針探針（probeprobe），與染色體），與染色體DNADNA進(jìn)行進(jìn)行分子雜交分子雜交，利用，利用熒光色素?zé)晒馍貫闄z測(cè)信號(hào)，在為檢測(cè)信號(hào)，在熒熒光顯微鏡光顯微鏡下直接檢測(cè)探針互補(bǔ)的下直接檢測(cè)探針互補(bǔ)的DNADNA片段的存在部位。片段的存在部位。 實(shí)際上是分子生物學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)交叉結(jié)合而實(shí)際上是分子生物學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)交叉結(jié)合而形成的一種現(xiàn)代生物技術(shù)，屬于形成的一種現(xiàn)代生物技術(shù)，屬于分子細(xì)胞生物學(xué)分子細(xì)胞生物學(xué)的范疇。的范疇。 FISHFISH技術(shù)

50、技術(shù)現(xiàn)已成為現(xiàn)已成為分子生物學(xué)分子生物學(xué)與與分子細(xì)胞遺傳分子細(xì)胞遺傳學(xué)學(xué)研究中的重要手段。研究中的重要手段。（二）（二）FISHFISH的基本原理的基本原理 依據(jù)依據(jù)堿基互補(bǔ)堿基互補(bǔ)原理，將原理，將DNADNA探針用特殊修飾的核苷探針用特殊修飾的核苷酸酸分子標(biāo)記分子標(biāo)記（如（如biotin-dUTPbiotin-dUTP或或digoxigenin-dUTPdigoxigenin-dUTP），），然后將標(biāo)記然后將標(biāo)記探針直接探針直接雜交雜交到染色體或到染色體或DNADNA纖維切片上，纖維切片上，再通過直接再通過直接檢測(cè)檢測(cè)（熒光素直接標(biāo)記的探針）或用熒光（熒光素直接標(biāo)記的探針）或用熒光素分子藕聯(lián)

51、的單克隆抗體與探針分子特異性結(jié)合來間素分子藕聯(lián)的單克隆抗體與探針分子特異性結(jié)合來間接檢測(cè)接檢測(cè)DNADNA在染色體或在染色體或DNADNA纖維上的定位。纖維上的定位。 FISHFISH基于基于免疫組織化學(xué)免疫組織化學(xué)（抗原抗體反應(yīng)，即與熒光（抗原抗體反應(yīng)，即與熒光素偶聯(lián)的抗體和抗原結(jié)合）與素偶聯(lián)的抗體和抗原結(jié)合）與分子雜交分子雜交原理。原理。（三）用于（三）用于FISHFISH的探針類型的探針類型a. a. 著絲粒探針著絲粒探針(centromeric probe)(centromeric probe) b. b. 全染色體或染色體區(qū)帶特異性探針全染色體或染色體區(qū)帶特異性探針(whole ch

52、romosome or region-specific probe)(whole chromosome or region-specific probe) c. c. 染色體特異性單一序列探針（染色體特異性單一序列探針（unique sequence unique sequence probe probe ，USPUSP） d. d. 端粒染色體探針端粒染色體探針(telomeric chromosome probes(telomeric chromosome probes 探針探針DNA染色體標(biāo)本染色體標(biāo)本切口平移法切口平移法前處理前處理探針探針DNA變性變性染色體染色體DNADNA變性變性

53、單鏈單鏈DNA單鏈單鏈DNADNA用用PI、DAPI對(duì)染色體染色對(duì)染色體染色（四）熒光原位雜交（四）熒光原位雜交（FISHFISH）示意圖）示意圖 探針探針DNA與染色體與染色體DNA分子雜交分子雜交用抗生物素蛋白用抗生物素蛋白熒光素處理熒光素處理找出雜交信號(hào)找出雜交信號(hào) 用熒光顯微鏡觀察用熒光顯微鏡觀察生物素（地高辛）標(biāo)記生物素（地高辛）標(biāo)記（五）（五）FISHFISH衍生技術(shù)衍生技術(shù) 隨著分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的不斷發(fā)展隨著分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的不斷發(fā)展,FISH,FISH技術(shù)也技術(shù)也在不斷發(fā)展，已形成了一系列衍生技術(shù)在不斷發(fā)展，已形成了一系列衍生技術(shù): :1. 1. 染色體涂染染色體涂染(ch

54、romosomal painting)(chromosomal painting)技術(shù)技術(shù) 2.2.多彩色熒光原位雜交多彩色熒光原位雜交(multicolor-FISH) (multicolor-FISH) 又稱多色涂染技術(shù)又稱多色涂染技術(shù)(multiplex-FISH )(multiplex-FISH )雙色雙色FISHFISH圖圖雙色雙色FISHFISH圖圖多色多色FISHFISH圖圖4.4.基因組原位雜交基因組原位雜交 (genomic (genomic in situ in situ hybridization,hybridization, GISH)GISH) 3.3.引物原位引物原位DNADNA合成合成 (primed(primed in situ in situ DNA systhesis, PRINSDNA systhesis, PRINS）5.5.比較基因組原位雜交（比較基因組原位雜交（CGHCGH） 由于由于FISHFISH具有安全、經(jīng)濟(jì)、靈敏快速和精具有安全、經(jīng)濟(jì)、靈敏快速和精確等優(yōu)點(diǎn)，它