殺菌劑生物測(cè)定技術(shù)學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1殺菌劑生物測(cè)定技術(shù)殺菌劑生物測(cè)定技術(shù)第一頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。 殺菌劑室內(nèi)生物測(cè)定的主要內(nèi)容是將殺菌物質(zhì)作用于細(xì)菌、真菌或其他病原微生物，根據(jù)其作用的大小來(lái)判定藥劑的毒力。或?qū)⒕镔|(zhì)施于植物，對(duì)病害發(fā)生的有無(wú)或輕重觀察比較來(lái)判定藥劑的效果。第1頁(yè)/共90頁(yè)第二頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。供試病原菌要求在分類(lèi)上有一定代表性，最好是重要的農(nóng)業(yè)植物病害的病原菌，而且容易培養(yǎng)，多代繁殖不易產(chǎn)生變異。一、供試菌種第2頁(yè)/共90頁(yè)第三頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。番茄灰霉病菌（Botrytis cintrea）番茄早疫病菌（Alternaria solani）辣椒炭疽病菌（Col

2、letotrichum capsici）蘋(píng)果輪紋病菌（Physalospora berengeriana）蘋(píng)果炭疽病菌（Glomerella cingulata）蘋(píng)果腐爛病菌（Valsa mali）葡萄黑痘病菌（Elsinoe ampelina）葡萄白腐病菌（Coniothyrium diplodiella）常用的供試菌種第3頁(yè)/共90頁(yè)第四頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。水稻稻瘟病菌（Piricularia oxyzae）小麥赤霉病菌 (Gibberella zeae)小麥全蝕病菌（Gaeumannomyces graminis）玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）玉米彎

3、孢病菌（Curvularia lunocto）棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporium）枯草桿菌（Bacillus subtilis）白菜軟腐病菌（Erwinia carotovora sub sp.carotovora）水稻白葉枯病菌（Xanthomonas campestrispv.oryzae）等。第4頁(yè)/共90頁(yè)第五頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。 1 從大量合成化合物中篩選出有可能作為殺菌劑的化合物 2 為特定的植物病害尋找有效的藥劑，為此需要進(jìn)行篩選殺菌劑毒力的比較 3 殺菌劑作用方式及作用機(jī)制的研究二、殺菌劑生物測(cè)定的應(yīng)用第5頁(yè)/共90頁(yè)第六頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十

4、三分。 4 殺菌劑抗性的研究 5 殺菌劑混用及劑型研究 6 殺菌劑抗雨水沖刷能力及殘效作用的研究 7 某些殺菌劑（特別是農(nóng)用抗菌素）的微量分析第6頁(yè)/共90頁(yè)第七頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。孢子萌發(fā)法孢子萌發(fā)法 管碟法管碟法含毒介質(zhì)培養(yǎng)法濾紙片法含毒介質(zhì)培養(yǎng)法濾紙片法 抑菌圈法抑菌圈法孔碟法孔碟法 生長(zhǎng)速率法生長(zhǎng)速率法最小濃度法最小濃度法 葉碟法葉碟法 三、殺菌劑室內(nèi)主要生測(cè)方法 第7頁(yè)/共90頁(yè)第八頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。 孢子萌發(fā)法是歷史最悠久而廣泛被采用的殺菌劑毒力測(cè)定方法。早在1807年。Prevost 就采用此法，后經(jīng)不少學(xué)者改進(jìn)，使之日趨規(guī)范、合理。1.孢子萌發(fā)法第8頁(yè)

5、/共90頁(yè)第九頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。原理：都是將供試藥劑附著在載玻片上或其他平面上，然后將供試病菌孢子懸浮液滴在上面（或?qū)⑹┯趹腋∫汉退幰夯旌虾蟮卧诓Ｆ希?，在保溫，保溫條件下培養(yǎng)一定時(shí)間后鏡檢，以孢子萌發(fā)率判斷殺菌劑毒力。孢子萌發(fā)法的突出優(yōu)點(diǎn)是快速，試驗(yàn)當(dāng)天即可獲得結(jié)果，尤其適合于保護(hù)劑的篩選。第9頁(yè)/共90頁(yè)第十頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。 以病菌孢子作為指示物進(jìn)行殺菌劑毒力測(cè)定。用孢子液和不同濃度的藥液混合，恒溫保濕培養(yǎng)，培養(yǎng)一定時(shí)間后即可檢查孢子萌發(fā)率。一般在低倍鏡下，每處理隨機(jī)檢查200個(gè)孢子。孢子萌發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)孢子萌發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)第10頁(yè)/共90頁(yè)第十一頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二

6、十三分。孢子萌發(fā)率（%）萌發(fā)孢子數(shù)/檢查孢子數(shù)X100若對(duì)照組有20%以上孢子不萌發(fā)，則應(yīng)重做。對(duì)照萌發(fā)率處理萌發(fā)率抑制孢子萌發(fā)率（%）X100對(duì)照萌發(fā)率抑制率計(jì)算抑制率計(jì)算第11頁(yè)/共90頁(yè)第十二頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。 將抑制孢子萌發(fā)率換算成機(jī)率值，作為Y；藥劑的濃度以對(duì)數(shù)值來(lái)表示作為X，直線回歸，求得回歸方程Ya+bx，可得LC50和LC95.。LC50 和LC95的計(jì)算第12頁(yè)/共90頁(yè)第十三頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。孢子萌發(fā)法只適用于產(chǎn)生孢子的真菌。一般的供試病菌有：馬鈴薯晚疫病菌（Phytophthora infestans）水稻稻瘟病菌（Piricularia or

7、yzae）小麥赤霉病菌（Gibberella zeae）玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）孢子萌發(fā)法的適用范圍第13頁(yè)/共90頁(yè)第十四頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。2.含毒介質(zhì)培養(yǎng)法 有有3 3種：種：（1）抑菌圈法（2）生長(zhǎng)速率法 （3）最小濃度法 第14頁(yè)/共90頁(yè)第十五頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分?；驹砘驹硎窃谝呀?jīng)接種供試菌的洋菜培養(yǎng)基（通常是在已經(jīng)接種供試菌的洋菜培養(yǎng)基（通常在培養(yǎng)皿內(nèi)）表面，利用各種方法（在培養(yǎng)皿內(nèi)）表面，利用各種方法（管碟法，濾紙管碟法，濾紙片法，孔碟法片法，孔碟法 ）使藥液和培養(yǎng)基接觸，恒溫培養(yǎng)一定）使藥液和培養(yǎng)基接觸，恒溫培養(yǎng)一

8、定時(shí)間后，由于藥劑的滲透擴(kuò)散作用，施藥部位周?chē)牟r(shí)間后，由于藥劑的滲透擴(kuò)散作用，施藥部位周?chē)牟【粴⑺阑蛏L(zhǎng)受到抑制，從而產(chǎn)生了抑制圏。根據(jù)抑菌被殺死或生長(zhǎng)受到抑制，從而產(chǎn)生了抑制圏。根據(jù)抑菌圈的大小來(lái)比較不同殺菌劑的毒力大小。菌圈的大小來(lái)比較不同殺菌劑的毒力大小。 （1）抑菌圈法的原理第15頁(yè)/共90頁(yè)第十六頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。u抑菌圏法的優(yōu)點(diǎn) 精確度高 操作簡(jiǎn)單u抑菌圏法的缺點(diǎn) 溶解性 擴(kuò)散性抑菌圏法的優(yōu)缺點(diǎn)第16頁(yè)/共90頁(yè)第十七頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。抑菌圈法示意圖含有孢含有孢子的培子的培養(yǎng)基養(yǎng)基不同濃度不同濃度的藥液的藥液第17頁(yè)/共90頁(yè)第十八頁(yè)，編輯于星期

9、二：點(diǎn) 二十三分。第18頁(yè)/共90頁(yè)第十九頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。 根據(jù)施加藥劑在洋菜培養(yǎng)基表面的方式，抑菌圈法又分為管碟法（牛津杯法）、濾紙片法、孔碟法。第19頁(yè)/共90頁(yè)第二十頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。（1） 用滅菌蒸餾水將供試藥劑配制成一系列梯度濃度，一般57個(gè)濃度。（ 2 ） 制備一定“濃度”的供試菌懸浮液（如真菌，則宜用孢子懸浮液），濃度以在低倍鏡（15X10倍）下每視野80一100個(gè)左右孢子為宜。 管碟法又稱(chēng)牛津杯法第20頁(yè)/共90頁(yè)第二十一頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。（3）待培養(yǎng)基冷至50左右（憑經(jīng)驗(yàn)估計(jì)），迅速吸取10ml菌液加入培養(yǎng)基內(nèi)，充分混合后，倒入滅菌

10、的培養(yǎng)皿中，制成含菌培養(yǎng)基平板。 第21頁(yè)/共90頁(yè)第二十二頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。（4）在每皿培養(yǎng)基上按合適的間隔放置6個(gè)不銹鋼小管（即牛津杯，外徑8.0士 0.lmm。內(nèi)徑6.0士0.1mm，高10.0士0.lmm），其中1個(gè)管為對(duì)照，其余5管為5個(gè)不同濃度的藥液，在適合的溫度下培養(yǎng)一段時(shí)間，取出用十字交叉法測(cè)是抑菌圈的直徑。第22頁(yè)/共90頁(yè)第二十三頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。抑菌圈法示意圖第23頁(yè)/共90頁(yè)第二十四頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。l上述操作應(yīng)盡量在無(wú)菌條件下進(jìn)行，以防污染l操作室的溫度最好在2628左右，如室溫太低，則50左右的培養(yǎng)基在操作過(guò)程中迅速冷凝，無(wú)

11、法制作平板l十字交叉法測(cè)量抑菌圈的直徑 ，消除誤差注意事項(xiàng)第24頁(yè)/共90頁(yè)第二十五頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。（1）配制不同濃度的藥液（2）配孢子懸浮液（3） 制含孢子的平板濾紙片法濾紙片法前三步完全和上述管碟法相同第25頁(yè)/共90頁(yè)第二十六頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。（4）用消毒鑷子夾取滅菌的圓形濾紙片（直徑為0.6或0.8cm）投入不同濃度藥液中，1分鐘后取出，放入含真菌孢子的培養(yǎng)基上，每皿放6片（5個(gè)濃度各1片，另1片為對(duì)照片），恒溫培養(yǎng)一定時(shí)間，測(cè)抑菌圏直徑。第26頁(yè)/共90頁(yè)第二十七頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。l各濾紙片間距要適合，以防形成的抑菌圈不園l放濾紙片時(shí)要平放

12、、更迅速、準(zhǔn)確、放下后不能再移動(dòng)l用十字交叉法測(cè)量抑菌圈的直徑注意事項(xiàng)第27頁(yè)/共90頁(yè)第二十八頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。 用滅菌后的打孔器直接在凝固好的含孢培養(yǎng)基上打成圓孔，將定量的藥液滴入圓孔中，恒溫培后測(cè)量抑菌圏的大小，進(jìn)行殺菌劑毒力比較?？椎ǖ?8頁(yè)/共90頁(yè)第二十九頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。主要有以下幾個(gè)方面的1對(duì)供試菌的要求在較粗放的比較殺菌劑毒力的測(cè)定中，對(duì)菌種的要求不必過(guò)嚴(yán)，只要在培養(yǎng)基中容易培養(yǎng)而且抑菌圈清楚的均可采用。影響抑菌圈法測(cè)定結(jié)果的因素第29頁(yè)/共90頁(yè)第三十頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。特別是為某一特定病害尋求有效的防治藥劑時(shí)，實(shí)際上不可能對(duì)供試菌

13、進(jìn)行選擇，但以水平擴(kuò)散法作生物定量測(cè)定，如抗菌素效價(jià)測(cè)定，則必須對(duì)供試菌有如下的要求： 對(duì)被測(cè)定的藥劑有適當(dāng)?shù)拿舾行?，抑菌圈界限明顯 培養(yǎng)容易，生長(zhǎng)迅速不易為雜菌污染不易發(fā)生變異 容易作成接種菌液（菌絲體或孢子懸浮液） 菌種有較強(qiáng)的耐熱能力第30頁(yè)/共90頁(yè)第三十一頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。2對(duì)藥劑的要求 用抑菌圈法測(cè)定一種藥劑的抑菌作用的大小，有一定的局限性。如與該藥劑的理化性質(zhì)有密切的關(guān)系。如是否容易擴(kuò)散。若有很好的擴(kuò)散性能，就能真實(shí)反映該藥劑的殺菌毒力。如由于大多數(shù)抗生素都有一定的水溶性，因此，抑菌圈法為抗生素的科研和生產(chǎn)廣泛采用。而有相當(dāng)一部分殺菌劑的原藥是不易溶解于水，故擴(kuò)散性

14、不好，要用該法，就要用適量的乙醇或丙酮溶解后，再用水稀釋至所需的濃度。 有效好的水溶性第31頁(yè)/共90頁(yè)第三十二頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。 將不同濃度的藥液和熱的培養(yǎng)基混合，用這種含毒培養(yǎng)基培育病，以病原菌的生長(zhǎng)進(jìn)度的快慢來(lái)判定藥劑的毒力大小。 （2）生長(zhǎng)速率法原理第32頁(yè)/共90頁(yè)第三十三頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。有2種：菌落達(dá)到一定的大小所需時(shí)間，一定時(shí)間內(nèi)菌落的直徑大小。病原菌生長(zhǎng)的表示方法第33頁(yè)/共90頁(yè)第三十四頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。優(yōu)點(diǎn)：操作比較簡(jiǎn)單適用范圍廣，適用于乳油、水劑、可濕性粉劑等重復(fù)性好。只要操作認(rèn)真，均可得到可靠的結(jié)果生長(zhǎng)速率法的優(yōu)缺點(diǎn)第34頁(yè)/

15、共90頁(yè)第三十五頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。缺點(diǎn)： 對(duì)供試菌種要求嚴(yán)格，病菌要易于培養(yǎng)，生長(zhǎng)較快且邊緣整齊、產(chǎn)孢子緩慢，而且是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上重要的的病原菌。 對(duì)供試藥劑要求，有一定的耐熱性，遇熱不易分解。 第35頁(yè)/共90頁(yè)第三十六頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。蘋(píng)果腐爛病菌（Valsa mali）小麥紋枯病菌（Rhzoctonia solani ）棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporium）葡萄白腐病菌（Coniothyrium diplodiella）小麥全蝕病菌（Gaeumannomyces graminis）辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）生長(zhǎng)速率法常

16、用的菌種第36頁(yè)/共90頁(yè)第三十七頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。（1）制備菌餅：用無(wú)菌的打孔器在供試菌種邊緣打下菌塊即菌餅（在無(wú)菌條件下進(jìn)行）（2）含毒培養(yǎng)基的制備：獎(jiǎng)供試藥劑稀釋成一系列梯度濃度后，準(zhǔn)確取一定量的藥液加入到熱的培養(yǎng)基中，混勻，倒入滅菌的小培養(yǎng)皿中（直徑為6cm），待冷凝后即為含毒培養(yǎng)基生長(zhǎng)速率法生長(zhǎng)速率法第37頁(yè)/共90頁(yè)第三十八頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。（3）移植菌餅用接種針或消毒的攝子將菌餅反面（有菌絲的一面向下和培養(yǎng)基貼合）移植到帶毒培養(yǎng)基平板上，一個(gè)培養(yǎng)皿最好接一個(gè)菌餅。（4）測(cè)定菌落直徑恒溫培養(yǎng)到預(yù)定時(shí)間后，取出培養(yǎng)皿測(cè)量菌落直徑。每個(gè)菌落十字交叉測(cè)兩次直徑

17、。第38頁(yè)/共90頁(yè)第三十九頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。生長(zhǎng)速率法示意圖生長(zhǎng)速率法示意圖菌餅菌餅含藥劑的含藥劑的培養(yǎng)基培養(yǎng)基第39頁(yè)/共90頁(yè)第四十頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。菌餅含毒培養(yǎng)基第40頁(yè)/共90頁(yè)第四十一頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。純生長(zhǎng)量菌落直徑菌餅直徑對(duì)照的純生長(zhǎng)量處理的生長(zhǎng)量抑制率X100對(duì)照的純生長(zhǎng)量 計(jì)算公式第41頁(yè)/共90頁(yè)第四十二頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。 將算出的各處理（濃度）的抑制率換成機(jī)率值，以對(duì)數(shù)表示濃度，用作圖法或最小二乘法求出EC50或EC95，并以此比較毒力。毒力方程的計(jì)算第42頁(yè)/共90頁(yè)第四十三頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。 在比

18、較粗放的進(jìn)行幾種殺菌劑的毒力比較時(shí)，可以采用最低抑制濃度法。 （3）最低抑制濃度法第43頁(yè)/共90頁(yè)第四十四頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。最小濃度法基本原理 是藥劑按等比或等差級(jí)數(shù)系列濃度和培養(yǎng)基混合后接入供試菌，定溫培養(yǎng)一定時(shí)間后，找出“終點(diǎn)”（明顯地抑制供試菌生長(zhǎng)發(fā)育的最高稀釋倍數(shù)，即最低濃度）的那個(gè)濃度，即為最低抑制濃度。通過(guò)比較幾種不同藥劑的最抵抑制濃度即可比較其毒力。顯然，最低抑制濃度最小的，其毒力最大。第44頁(yè)/共90頁(yè)第四十五頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。根據(jù)培養(yǎng)基是固態(tài)還是液態(tài)又將最低抑制濃度法分為u液體培養(yǎng)基稀釋法u固體培養(yǎng)基稀釋法第45頁(yè)/共90頁(yè)第四十六頁(yè)，編輯于星期

19、二：點(diǎn) 二十三分。 取若干只滅菌試管，順序編號(hào)，在每只試管中加入適合供試菌生長(zhǎng)的液體培養(yǎng)基Nml，然后在第一號(hào)試管中加入一定濃度的供試藥液Xml，充分混合后自第一管中取Nml放入第二管，充分混合后取Xml加入第3管，直到最后一管不加藥液作為對(duì)照。自倒數(shù)第二管中取出Xml棄去不用，如此所得的一系列濃度順序相差一倍。 液體培養(yǎng)基稀釋法第46頁(yè)/共90頁(yè)第四十七頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。 在各管中加入供試菌懸浮液一滴，在該供試菌最適溫度下培養(yǎng)一定時(shí)間，取出觀察“終點(diǎn)”，一般以混濁度為準(zhǔn)，即以某編號(hào)試管以下不再發(fā)生明顯混濁現(xiàn)象，這一試管的濃度就是最低抑制濃度。第47頁(yè)/共90頁(yè)第四十八頁(yè)，編輯于

20、星期二：點(diǎn) 二十三分。12345CK第48頁(yè)/共90頁(yè)第四十九頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。 用滅菌蒸餾水將供試藥制按等比或等差級(jí)數(shù)稀釋一系列藥液濃度。分別取每種濃度的藥液Xml分放50ml滅菌三角瓶，加入滅菌并冷至60左右的培養(yǎng)基Yml，立即搖勻倒入培養(yǎng)皿內(nèi)凝固。用接種環(huán)沾取供試菌液進(jìn)行劃線培養(yǎng)，至一定時(shí)間后觀察抑制病菌生長(zhǎng)的最高稀釋倍數(shù)即最低抑制濃度。固體培養(yǎng)基稀釋法第49頁(yè)/共90頁(yè)第五十頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。接菌餅，若不能生長(zhǎng)，此濃度是最低抑制濃度第50頁(yè)/共90頁(yè)第五十一頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。劃線接細(xì)菌，不能生長(zhǎng)，此濃度為最低抑制濃度第51頁(yè)/共90頁(yè)第五十二頁(yè)

21、，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。 葉碟法比較簡(jiǎn)易，能在室內(nèi)進(jìn)行，比孢子萌發(fā)法和含毒介質(zhì)培養(yǎng)法接近生產(chǎn)實(shí)際，可看作是盆栽試驗(yàn)的過(guò)渡階段。3.葉碟法第52頁(yè)/共90頁(yè)第五十三頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。 葉碟法的基本原理是將容易感染供試菌的植物葉片（如蠶豆葉片）經(jīng)不同濃度的藥劑處理后平放在培養(yǎng)皿內(nèi)，再將一塊培養(yǎng)好的供試菌菌絲體（如紋枯病菌）放在葉片上，經(jīng)保濕培養(yǎng)一定時(shí)間，檢查其病斑面積，并以此衡量供試藥劑的毒力。第53頁(yè)/共90頁(yè)第五十四頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。 還有一種葉碟漂浮法，其原理是將容易感染供試菌的植物葉片（如黃瓜葉片）制成直徑1.5cm葉碟，漂浮在不同濃度的藥液中，將供試菌（

22、如黃瓜霜霉病菌）孢子懸浮液定量滴加在葉碟上，在光照下培養(yǎng)一定時(shí)間，調(diào)查病斑面積。葉碟漂浮法第54頁(yè)/共90頁(yè)第五十五頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。四、殺線蟲(chóng)劑的生物測(cè)定技術(shù)供試線蟲(chóng)： 番茄根結(jié)線蟲(chóng)Meloidogyne incognita馬鈴薯莖線蟲(chóng) Ditylenchus destructor Thorne 但如果是針對(duì)某種線蟲(chóng)篩選合適的殺線蟲(chóng)劑，則只能以此種線蟲(chóng)為指示生物。 第55頁(yè)/共90頁(yè)第五十六頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。殺線蟲(chóng)劑的生物測(cè)定方法殺線蟲(chóng)劑的生物測(cè)定方法依藥劑性質(zhì)分為兩類(lèi)：依藥劑性質(zhì)分為兩類(lèi)：（一）非熏蒸劑測(cè)定方法（一）非熏蒸劑測(cè)定方法（二）熏蒸劑測(cè)定方法（二）熏蒸

23、劑測(cè)定方法第56頁(yè)/共90頁(yè)第五十七頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。v將供試藥劑蒸餾水稀釋成57個(gè)梯度濃度v取上面藥液1.5ml加入一個(gè)小玻皿（高 1cm直徑 2 cm）中v每種濃度重復(fù)3皿v對(duì)照則加入1.5ml蒸餾水v將分離的供試線蟲(chóng)經(jīng)清水漂洗后挑入小皿中，皿1520條/皿v將盛有藥液和線蟲(chóng)的小皿置于襯有濕濾紙保溫的大培養(yǎng)皿中，在2425恒溫箱中保持24h或48h后取出，在雙目解剖鏡下檢查線蟲(chóng)的存活情況。（）非熏蒸劑的生物測(cè)定（）非熏蒸劑的生物測(cè)定第57頁(yè)/共90頁(yè)第五十八頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。 通常將不能活動(dòng)的，伸長(zhǎng)的線蟲(chóng)或是蟲(chóng)體有著通常將不能活動(dòng)的，伸長(zhǎng)的線蟲(chóng)或是蟲(chóng)體有著凸凹不

24、平的彎曲部分，內(nèi)含物為黑色顆粒者，都定凸凹不平的彎曲部分，內(nèi)含物為黑色顆粒者，都定為死線蟲(chóng)。為死線蟲(chóng)。1、觸動(dòng)法、觸動(dòng)法2、染色法、染色法線蟲(chóng)死亡的判斷標(biāo)準(zhǔn)第58頁(yè)/共90頁(yè)第五十九頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。12345CK第59頁(yè)/共90頁(yè)第六十頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。 死亡線蟲(chóng)數(shù)死亡率X100 供試線蟲(chóng)總數(shù) 將濃度取對(duì)數(shù)值，線蟲(chóng)死亡率轉(zhuǎn)換成機(jī)率值，用殺蟲(chóng)劑毒力測(cè)定中的方法求出LC50或LC95，并以此來(lái)比較毒力大小。計(jì)算公式第60頁(yè)/共90頁(yè)第六十一頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。以熏蒸作用為主的殺線蟲(chóng)劑的毒力測(cè)定和殺蟲(chóng)劑的情以熏蒸作用為主的殺線蟲(chóng)劑的毒力測(cè)定和殺蟲(chóng)劑的情形相似

25、。形相似。 在在0.33L熏蒸瓶壁上貼一濾紙，瓶底放一小玻皿熏蒸瓶壁上貼一濾紙，瓶底放一小玻皿（高（高1cm，直徑，直徑2 cm），皿中注入蒸餾水，使水位），皿中注入蒸餾水，使水位高高2mm左右，放入左右，放入1520條供試線蟲(chóng)，同時(shí)在瓶底放條供試線蟲(chóng)，同時(shí)在瓶底放一濾紙片（一濾紙片（1X 3mm），用微量注射器將供試藥劑?。梦⒘孔⑸淦鲗⒐┰囁巹┎〖釉跒V紙上。測(cè)定要求設(shè)加在濾紙上。測(cè)定要求設(shè)5個(gè)濃度，加二溴氯丙烷，個(gè)濃度，加二溴氯丙烷，可設(shè)置可設(shè)置100、50、25、12、6mgL和不給藥對(duì)照，重復(fù)和不給藥對(duì)照，重復(fù)3次。次。2425下熏蒸下熏蒸24h，檢查線蟲(chóng)死亡率，檢查線蟲(chóng)死亡率。（二

26、）熏蒸劑的毒力測(cè)定熏蒸劑的毒力測(cè)定第61頁(yè)/共90頁(yè)第六十二頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。線蟲(chóng)濾紙片第62頁(yè)/共90頁(yè)第六十三頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。五、殺菌劑盆栽試驗(yàn)第63頁(yè)/共90頁(yè)第六十四頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。藥劑（殺菌劑）藥劑（殺菌劑）病原菌病原菌室內(nèi)生測(cè)示意圖室內(nèi)生測(cè)示意圖第64頁(yè)/共90頁(yè)第六十五頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。寄主植物寄主植物殺菌劑殺菌劑病原菌病原菌第65頁(yè)/共90頁(yè)第六十六頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。殺菌劑盆栽藥效試驗(yàn)殺菌劑盆栽藥效試驗(yàn)利用盆、缽培育幼嫩植物進(jìn)行生物測(cè)定，利用盆、缽培育幼嫩植物進(jìn)行生物測(cè)定，是研究殺菌劑的有效方法之一。盆栽

27、試驗(yàn)法克是研究殺菌劑的有效方法之一。盆栽試驗(yàn)法克服了在離體條件下對(duì)病菌無(wú)效而在活體條件下服了在離體條件下對(duì)病菌無(wú)效而在活體條件下有效的化合物的漏篩。同時(shí)，盆栽試驗(yàn)法更接有效的化合物的漏篩。同時(shí)，盆栽試驗(yàn)法更接近于大田實(shí)際情況，所得資料對(duì)指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)際近于大田實(shí)際情況，所得資料對(duì)指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)際有較高的參考價(jià)值。此外，盆栽試驗(yàn)所用材料有較高的參考價(jià)值。此外，盆栽試驗(yàn)所用材料易得，條件易于控制，在當(dāng)前的殺菌劑研究中易得，條件易于控制，在當(dāng)前的殺菌劑研究中，越來(lái)越重視盆栽試驗(yàn)法，有些公司在進(jìn)行活，越來(lái)越重視盆栽試驗(yàn)法，有些公司在進(jìn)行活性篩選時(shí)甚至只用盆栽試驗(yàn)法，而淘汰了離體性篩選時(shí)甚至只用盆栽試驗(yàn)法，而淘

28、汰了離體試驗(yàn)法。試驗(yàn)法。第66頁(yè)/共90頁(yè)第六十七頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。1和大田藥效試驗(yàn)相比，供試菌的培養(yǎng)不受自然條件限制，可較快得出結(jié)果，可用作大量化合物的活性篩選2多種條件易于控制，測(cè)定結(jié)果比較穩(wěn)定可靠 3接近大田實(shí)際情況，其結(jié)果對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐有較大的參考價(jià)值。 其不足之處是：和室內(nèi)生測(cè)方法相比，由于有寄主植物參與，測(cè)定工作比較麻煩而且測(cè)定周期比較長(zhǎng)。室內(nèi)盆栽毒力測(cè)定的優(yōu)點(diǎn)室內(nèi)盆栽毒力測(cè)定的優(yōu)點(diǎn)第67頁(yè)/共90頁(yè)第六十八頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。對(duì)供試植物的要求：對(duì)供試植物的要求：容易栽培容易栽培生長(zhǎng)迅速生長(zhǎng)迅速是主要農(nóng)作物是主要農(nóng)作物如水稻、小麥、黃瓜、棉花、番茄等等如水稻、

29、小麥、黃瓜、棉花、番茄等等。供試植物供試植物第68頁(yè)/共90頁(yè)第六十九頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。 供試病菌基本上是由供試植物決定的。如供試植供試病菌基本上是由供試植物決定的。如供試植物是水稻，就用水稻主要病害（如水稻稻瘟病，物是水稻，就用水稻主要病害（如水稻稻瘟病，水稻紋枯?。┑牟≡蝗艄┰囍参锸切←?，就水稻紋枯?。┑牟≡?；若供試植物是小麥，就用小麥主要病害（全蝕、赤霉、銹病、白粉、病用小麥主要病害（全蝕、赤霉、銹病、白粉、病毒?。?；供試植物是玉米，就用玉米主要?。ù蠖静。?；供試植物是玉米，就用玉米主要?。ù笮“卟。?。小斑病）。 供試病菌供試病菌第69頁(yè)/共90頁(yè)第七十頁(yè)，編輯于星期

30、二：點(diǎn) 二十三分。影響殺菌劑盆栽的因素影響殺菌劑盆栽的因素v植物的抗病性植物的抗病性v病原菌的致病力病原菌的致病力v環(huán)境條件（主要是溫濕度）環(huán)境條件（主要是溫濕度）第70頁(yè)/共90頁(yè)第七十一頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。植物的抗病性植物的抗病性供試植物應(yīng)選感病品種或者供試植物應(yīng)選感病品種或者中抗品種，不能選種抗病性品種中抗品種，不能選種抗病性品種或免疫品種?；蛎庖咂贩N。第71頁(yè)/共90頁(yè)第七十二頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。供試菌種的致病力，是盆栽試驗(yàn)成功與失敗的主要因素。病原菌的致病力不是固定不變的性狀。在同一病原菌中，有致病力強(qiáng)弱不同的菌系和小種。病原菌的致病性與其生理、生化及其他生物

31、學(xué)特性有密切關(guān)系，在適應(yīng)新的環(huán)境的同時(shí)，病原菌可以改變其致病性。如用高粱粒培養(yǎng)的水稻稻瘟病菌孢子和采自田間的感病稻莖節(jié)經(jīng)保濕后產(chǎn)生的孢子，其致病力相差較大，一般情況下，后者的致病力較強(qiáng)。即使同是人工培養(yǎng)基產(chǎn)生的孢子，因培養(yǎng)基配方不同，培養(yǎng)條件不同，其孢子的致病能力也不同，這些都應(yīng)加以注意。病原菌的致病力病原菌的致病力第72頁(yè)/共90頁(yè)第七十三頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。環(huán)境條件環(huán)境條件溫度溫度濕度濕度光照光照第73頁(yè)/共90頁(yè)第七十四頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。病害的傳播方式不同，接菌方法也不同。必須首先了解要接種的病原菌的主要傳播方式和侵染途徑。氣流及雨水傳播的病害可用噴霧法或噴粉法

32、接菌。如病菌主要由氣孔侵入，接菌時(shí)應(yīng)注意在葉背面接菌。噴霧法接菌一般是將孢子懸浮液噴在植物表面，為了使孢子在懸浮液中均勻分散，可適當(dāng)加入濕潤(rùn)劑，這不但有利于孢子分散，而且也有利于懸浮液在植株上附著。如果孢子在懸浮液中分散不勻，植株發(fā)病后有些葉片可能病斑連成一片，有些葉片則沒(méi)有或很少有病班，給病情調(diào)查帶來(lái)困難和誤差，孢子懸浮液中孢子的密度以及是否加入粘著劑對(duì)發(fā)病影響很大。以稻瘟病菌的接菌為例，稻瘟病菌孢子以在低倍鏡下（10 X 15）每視野100個(gè)孢子為宜，在孢子懸浮液中加入0.25的明膠作粘著劑也會(huì)收到良好效果。 主要的接種方法主要的接種方法第74頁(yè)/共90頁(yè)第七十五頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十

33、三分。噴霧接菌最好用特制的噴霧裝置。粗放一點(diǎn)的工作也可用家庭衛(wèi)生用小型手持噴霧器。接種銹菌和白粉菌時(shí)，可先在小麥植株上噴水，以造成在葉片上有水膜，然后用滑石粉將孢子粉稀釋?zhuān)捎脟姺垩b置接菌。水稻紋枯病菌可在栽種水稻的盆水中接種菌核，但更多的是用其菌絲塊夾在稻莖基部葉鞘上。水稻白葉枯病菌常采用針刺接菌，或剪去部分稻葉，造成人工傷口，再?lài)姲兹~枯病菌細(xì)菌）懸浮液接菌。接種方法接種方法第75頁(yè)/共90頁(yè)第七十六頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。由種子傳染的病害可用病菌孢子拌種或孢子懸浮液浸種法進(jìn)行接菌；而土壤傳染病害則可將病原菌拌入土壤中接種或?qū)⒅参锔拷腈咦討腋∫褐羞M(jìn)行接種。接種方法接種方法第76頁(yè)

34、/共90頁(yè)第七十七頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。 環(huán)境條件不但影響供試植物的正常生長(zhǎng)，更重要的是影響接菌的成敗。為創(chuàng)造有利于病菌入侵的條件，應(yīng)十分注意對(duì)環(huán)境因子如光照、溫度、濕度等的控制。發(fā)病的環(huán)境因子發(fā)病的環(huán)境因子第77頁(yè)/共90頁(yè)第七十八頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。 在設(shè)備良好的研究所或公司，擁有現(xiàn)代化溫室，或人工氣候室，光照及溫、濕度可隨意調(diào)節(jié)；但在基層研究單位，條件較差，環(huán)境因子的控制就不那么容易。如果沒(méi)有專(zhuān)門(mén)的溫室，試驗(yàn)應(yīng)安排在自然條件下供試病菌發(fā)生的季節(jié)進(jìn)行，以滿(mǎn)足對(duì)溫度的要求。濕度的控制比溫度更重要，只有滿(mǎn)足病菌對(duì)濕度的要求，病菌才能萌發(fā)生長(zhǎng)。環(huán)境條件環(huán)境條件第78頁(yè)/共90頁(yè)第七十九頁(yè)，編輯于星期二：點(diǎn) 二十三分。光照一般對(duì)孢子萌發(fā)入侵不利，但寄主植物卻要在光照下才能正常生長(zhǎng)。如利用自然光，最好在下午太陽(yáng)落山后接菌，這樣，經(jīng)過(guò)一個(gè)晚上，大多數(shù)病菌孢子可以萌發(fā)入侵光