分子標(biāo)記及遺傳連鎖圖譜

1、基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和Set the flags on the genomesSet the flags on the genomes基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和遺傳圖譜與物理圖譜遺傳圖譜與物理圖譜v遺傳作圖遺傳作圖(genetic mapping)(genetic mapping)：采用遺傳學(xué)分析方法將：采用遺傳學(xué)分析方法將基因或其它基因或其它DNADNA順序標(biāo)定在染色

2、體上構(gòu)建連鎖圖。順序標(biāo)定在染色體上構(gòu)建連鎖圖。這一方法包括雜交實驗，家系分析。遺傳圖距單位這一方法包括雜交實驗，家系分析。遺傳圖距單位為厘摩（為厘摩（cMcM），每單位厘摩定義為），每單位厘摩定義為1 1交換率。交換率。v物理作圖（物理作圖（Physical mappingPhysical mapping）：采用分子生物學(xué)技）：采用分子生物學(xué)技術(shù)直接將術(shù)直接將DNADNA分子標(biāo)記、基因或克隆標(biāo)定在基因組分子標(biāo)記、基因或克隆標(biāo)定在基因組實際位置。物理圖的距離依作圖方法而異，如輻射實際位置。物理圖的距離依作圖方法而異，如輻射雜種作圖的計算單位為厘鐳（雜種作圖的計算單位為厘鐳（cRcR），限制性片段

3、作），限制性片段作圖與克隆作圖的圖距為堿基對，即圖與克隆作圖的圖距為堿基對，即DNADNA的長度。的長度?；蚪M學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和v遺傳圖譜遺傳圖譜(genetic map)(genetic map)又稱遺傳連鎖圖譜或又稱遺傳連鎖圖譜或連鎖圖譜連鎖圖譜(linkage map)(linkage map)。 經(jīng)典遺傳經(jīng)典遺傳 學(xué)時代的遺傳連鎖圖譜主要是以家學(xué)時代的遺傳連鎖圖譜主要是以家系分析或不同性狀個體間雜交為基礎(chǔ)，根據(jù)系分析或不同性狀

4、個體間雜交為基礎(chǔ)，根據(jù)同源染色體上同源染色體上 等位基因的變化，通過等位基因的變化，通過計算重計算重組率組率，確定染色體上基因座位的順序和距離，確定染色體上基因座位的順序和距離，構(gòu)建基因的連鎖圖譜。構(gòu)建基因的連鎖圖譜?；蚪M學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和v人們把單倍體配子所有染色體上的全部基因稱為一個人們把單倍體配子所有染色體上的全部基因稱為一個基基 因組。基因組內(nèi)每條染色體上的連鎖基因稱為一個因組?；蚪M內(nèi)每條染色體上的連鎖基因稱為一個連鎖群。繪制遺傳圖譜就是要進(jìn)行每條染連鎖群。繪制遺傳圖譜就是要進(jìn)行每條染 色體上基因色體上基因座位的順

5、序和距離的確定，即主要通過家系分析，對座位的順序和距離的確定，即主要通過家系分析，對不同性狀之間、性狀與標(biāo)不同性狀之間、性狀與標(biāo) 記之間、標(biāo)記與標(biāo)記之間的記之間、標(biāo)記與標(biāo)記之間的連鎖遺傳頻率進(jìn)行計算，最終繪制遺傳連鎖圖。連鎖遺傳頻率進(jìn)行計算，最終繪制遺傳連鎖圖。v人類遺傳圖譜包括女性一種配子的人類遺傳圖譜包括女性一種配子的2323條染色體條染色體( (記作記作2323，X)X)和男性兩種配子的和男性兩種配子的2323條染色體條染色體(23 (23 ，X)X)、(23(23，Y)Y)上上的所有基因位點。的所有基因位點?；蚪M學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院

6、 向太和向太和v7070年代發(fā)展起來的年代發(fā)展起來的DNADNA重組技術(shù)、重組技術(shù)、8080年代發(fā)展起來的分子標(biāo)年代發(fā)展起來的分子標(biāo)記技術(shù)為拓展遺傳圖譜的構(gòu)建途徑創(chuàng)造了技術(shù)條件，也使基記技術(shù)為拓展遺傳圖譜的構(gòu)建途徑創(chuàng)造了技術(shù)條件，也使基因定位的方法從細(xì)胞及染色體水平過渡到分子水平。因定位的方法從細(xì)胞及染色體水平過渡到分子水平。vDNADNA水平的多態(tài)性標(biāo)記位點作為繪制現(xiàn)代遺傳圖譜的主要界水平的多態(tài)性標(biāo)記位點作為繪制現(xiàn)代遺傳圖譜的主要界標(biāo)，大大提高圖譜的標(biāo)，大大提高圖譜的 精確度、準(zhǔn)確性。遺傳圖譜的繪制也因精確度、準(zhǔn)確性。遺傳圖譜的繪制也因此進(jìn)入了一個嶄新的時代。此進(jìn)入了一個嶄新的時代。 v現(xiàn)代

7、遺傳圖譜的概念是由現(xiàn)代遺傳圖譜的概念是由Botstein DBotstein D等等(1980)(1980)首先提出的，在首先提出的，在此基礎(chǔ)上，限制性片段長此基礎(chǔ)上，限制性片段長 度多態(tài)性度多態(tài)性RFLPRFLP作為遺傳圖譜的第一作為遺傳圖譜的第一代嶄新標(biāo)記得以問世代嶄新標(biāo)記得以問世 。遺傳圖譜的第二代標(biāo)記位點是大量的。遺傳圖譜的第二代標(biāo)記位點是大量的可變數(shù)量串聯(lián)重復(fù)（可變數(shù)量串聯(lián)重復(fù)（VNTR)VNTR)，包括微、小衛(wèi)星，包括微、小衛(wèi)星(MS)(MS)或短串聯(lián)或短串聯(lián)重復(fù)重復(fù)(STR (STR 或或SSLP)SSLP)。第三代標(biāo)記是位點極其豐富的單核苷。第三代標(biāo)記是位點極其豐富的單核苷 酸

8、多酸多態(tài)性態(tài)性(SNP)(SNP)。 基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和v遺傳學(xué)上穩(wěn)定、可見的外部特征遺傳學(xué)上穩(wěn)定、可見的外部特征遺傳與環(huán)境、結(jié)遺傳與環(huán)境、結(jié)構(gòu)基因與調(diào)控基因綜合作用的結(jié)果。構(gòu)基因與調(diào)控基因綜合作用的結(jié)果。 如穗形、芒長、穗長、粒色、穗形、矮稈、卷葉等。如穗形、芒長、穗長、粒色、穗形、矮稈、卷葉等。v特點：特點：直觀簡單直觀簡單 從基因型到表現(xiàn)型存在基因表達(dá)、調(diào)控、個體發(fā)育等從基因型到表現(xiàn)型存在基因表達(dá)、調(diào)控、個體發(fā)育等環(huán)節(jié)，表型差異有時難以反映基因型差異。環(huán)節(jié)，表型差異有時難以反映基因型差異。 二、遺傳標(biāo)記的二、遺傳標(biāo)

9、記的 種類種類基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和v染色體數(shù)目變異及結(jié)構(gòu)變異，表現(xiàn)在染色體核型染色體數(shù)目變異及結(jié)構(gòu)變異，表現(xiàn)在染色體核型（數(shù)目、大小、隨體、著絲點位置等）和帶型（數(shù)目、大小、隨體、著絲點位置等）和帶型（C C帶、帶、NN帶、帶、G G帶等）。帶等）。 隨著分帶、細(xì)胞原位雜交等研究技術(shù)的發(fā)展，可隨著分帶、細(xì)胞原位雜交等研究技術(shù)的發(fā)展，可在染色體水平揭示更多遺傳變異。在染色體水平揭示更多遺傳變異。v特點：特點：直觀、快速而經(jīng)濟(jì)，但變異十

10、分有限，當(dāng)直觀、快速而經(jīng)濟(jì)，但變異十分有限，當(dāng)染色體數(shù)目形態(tài)相似時難以分辨。染色體數(shù)目形態(tài)相似時難以分辨。 基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和人類染色體端粒人類染色體端粒DNA的熒光原位雜交照片的熒光原位雜交照片 基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州

11、師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和v種子的貯藏蛋白：種子的貯藏蛋白：v同工酶：同工酶：v等位酶：等位酶：優(yōu)點：優(yōu)點：經(jīng)濟(jì)、方便、成本較低。經(jīng)濟(jì)、方便、成本較低。缺點：缺點：結(jié)構(gòu)基因表達(dá)產(chǎn)物，對非結(jié)構(gòu)基因無能為力；所結(jié)構(gòu)基因表達(dá)產(chǎn)物，對非結(jié)構(gòu)基因無能為力；所檢測位點只是基因組一部分；數(shù)量有限，有時受發(fā)育時檢測位點只是基

12、因組一部分；數(shù)量有限，有時受發(fā)育時期和環(huán)境影響。期和環(huán)境影響?；蚪M學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和v同工酶同工酶( (isozyme)isozyme)：由由一個以上一個以上基因座位編碼的基因座位編碼的酶的不同形式。催化同一種化學(xué)反應(yīng)，但其蛋酶的不同形式。催化同一種化學(xué)反應(yīng)，但其蛋白質(zhì)本身的分子結(jié)構(gòu)組成有所不同的一組酶。白質(zhì)本身的分子結(jié)構(gòu)組成有所不同的一組酶。v等位酶等位酶( (allozyme)allozyme)：由由一個位點一個位點的不同等位基的不同等位基因編碼的同種酶的不同類型。因編碼的同種酶的不同類型。p電泳可區(qū)分電泳可區(qū)分同一種酶

13、（系統(tǒng)）的不同變化同一種酶（系統(tǒng)）的不同變化?；蚪M學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和材料的采集材料的采集研磨和酶的提取研磨和酶的提取酶的保存酶的保存淀粉凝膠制備淀粉凝膠制備電泳電泳凝膠切片凝膠切片酶的組織化學(xué)染色酶的組織化學(xué)染色酶譜的記錄與分析酶譜的記錄與分析數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和夏臘梅同工酶譜照片夏臘梅同工酶譜照片基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭

14、州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和v廣義的分子標(biāo)記廣義的分子標(biāo)記(molecular marker)(molecular marker)是指可遺傳的并可是指可遺傳的并可檢測的檢測的DNADNA序列或蛋白質(zhì)。序列或蛋白質(zhì)。 蛋白質(zhì)標(biāo)記包括種子貯藏蛋白和同工酶（指由一個以上蛋白質(zhì)標(biāo)記包括種子貯藏蛋白和同工酶（指由一個以上基因位點編碼的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同基因位點編碼的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位點的不同等位基因編碼的酶的不同分子形式）。一基因位點的不同等位基因編碼的酶的不同分子形式）。v狹義的分子標(biāo)記概念只是指狹義的分子標(biāo)記概念只是指DNADNA標(biāo)記，而這個界定

15、現(xiàn)在標(biāo)記，而這個界定現(xiàn)在被廣泛采納，被廣泛采納，即現(xiàn)在通常所說的分子標(biāo)記都是特指即現(xiàn)在通常所說的分子標(biāo)記都是特指DNADNA標(biāo)記。標(biāo)記。它能反映生物個體或種群間基因組中某種差異特它能反映生物個體或種群間基因組中某種差異特征的征的DNADNA片段，它直接反映基因組片段，它直接反映基因組DNADNA間的差異。間的差異?；蚪M學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和 本質(zhì)是以核苷酸序列作為標(biāo)記，一般特點：本質(zhì)是以核苷酸序列作為標(biāo)記，一般特點：（1 1）以）以DNADNA的形式表現(xiàn)，在生物體的各個組織、各個發(fā)育階段的形式表現(xiàn)，在生物體的各個組織、各個發(fā)育階

16、段均可檢測到，不受季節(jié)、環(huán)境限制，不存在表達(dá)與否等問題。均可檢測到，不受季節(jié)、環(huán)境限制，不存在表達(dá)與否等問題。（2 2）多態(tài)性高，自然界存在許多等位變異，無須人為創(chuàng)造。）多態(tài)性高，自然界存在許多等位變異，無須人為創(chuàng)造。（3 3）數(shù)量豐富，多態(tài)性遍及整個基因組。）數(shù)量豐富，多態(tài)性遍及整個基因組。（4 4）表現(xiàn)為）表現(xiàn)為“中性中性”，不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)，與不良性狀無，不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)，與不良性狀無必然的連鎖。必然的連鎖。（5 5）許多分子標(biāo)記表現(xiàn)共顯性，能鑒別純合雜合基因型，提供）許多分子標(biāo)記表現(xiàn)共顯性，能鑒別純合雜合基因型，提供完整的信息。完整的信息?；蚪M學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)

17、境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和遺傳標(biāo)記（遺傳標(biāo)記（genetic markergenetic marker）具有多型性具有多型性易于鑒別易于鑒別與目標(biāo)基因緊密連鎖與目標(biāo)基因緊密連鎖 性狀標(biāo)記性狀標(biāo)記 色澤，色澤， 形態(tài)形態(tài) 細(xì)胞學(xué)標(biāo)記細(xì)胞學(xué)標(biāo)記 倒位，易位，倒位，易位，G/N/CG/N/C帶帶 生化標(biāo)記生化標(biāo)記 同功酶同功酶 分子標(biāo)記分子標(biāo)記 RFLPRFLP、RAPDRAPD、SSRSSR、AFLPAFLP、SNPSNP 基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和第一類是以第一類是以分子雜交為核心的分子標(biāo)記技術(shù)分子雜交

18、為核心的分子標(biāo)記技術(shù)，包括：包括：v限制性片段長度多態(tài)性標(biāo)記（限制性片段長度多態(tài)性標(biāo)記（Restriction Restriction fragment length polymorphism, fragment length polymorphism, 簡稱簡稱RFLPRFLP標(biāo)記）；標(biāo)記）；vDNADNA指紋技術(shù)（指紋技術(shù)（DNA FingerprintingDNA Fingerprinting）；）；v原位雜交（原位雜交（in situ hybridizationin situ hybridization）等。）等?；蚪M學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科

19、學(xué)學(xué)院 向太和向太和第二類是第二類是以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction ,Polymerase chain reaction ,簡稱簡稱PCRPCR反應(yīng)）為核心的分子標(biāo)記技術(shù)反應(yīng)）為核心的分子標(biāo)記技術(shù)，包括，包括v隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNADNA標(biāo)記（標(biāo)記（Random amplification Random amplification polymorphism DNA, polymorphism DNA, 簡稱簡稱RAPDRAPD標(biāo)記）；標(biāo)記）；v 簡單序列重復(fù)標(biāo)記（簡單序列重復(fù)標(biāo)記（Simple sequence repeat,

20、 Simple sequence repeat, 簡稱簡稱SSRSSR標(biāo)記）或標(biāo)記）或簡單序列長度多態(tài)性（簡單序列長度多態(tài)性（Simple sequence length polymorphism, Simple sequence length polymorphism, 簡稱簡稱SSLPSSLP標(biāo)記）；標(biāo)記）；v擴(kuò)展片段長度多態(tài)性標(biāo)記（擴(kuò)展片段長度多態(tài)性標(biāo)記（Amplified fragment length Amplified fragment length polymorphism, polymorphism, 簡稱簡稱AFLPAFLP標(biāo)記）；標(biāo)記）；v序標(biāo)位（序標(biāo)位（Sequence

21、tagged sites, Sequence tagged sites, 簡稱簡稱STSSTS標(biāo)記）；標(biāo)記）；v序列特征化擴(kuò)增區(qū)域（序列特征化擴(kuò)增區(qū)域（Sequence charactered amplified region, Sequence charactered amplified region, 簡稱簡稱SCARSCAR標(biāo)記）等。標(biāo)記）等?；蚪M學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和第三類是第三類是一些新型的分子標(biāo)記一些新型的分子標(biāo)記，如：，如：v單核苷酸多態(tài)性（單核苷酸多態(tài)性（Single nuleotide Single nuleo

22、tide polymorphism, polymorphism, 簡稱簡稱SNPSNP標(biāo)記）；標(biāo)記）；v表達(dá)序列標(biāo)簽（表達(dá)序列標(biāo)簽（Expressed sequences tags, Expressed sequences tags, 簡簡稱稱ESTEST標(biāo)記）等。標(biāo)記）等?；蚪M學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和 Botstein再次提出。1983年Solle

23、r和Beckman最先應(yīng)用于品種鑒別和品系的純度的測定。v自從人的RFLP圖譜構(gòu)建后，已經(jīng)分別構(gòu)建了果蠅、牛、大豆、小麥、水稻等多種生物的RFLP圖譜。l一、RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)標(biāo)記技術(shù)的原理基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和v特定生物類型的基因組特定生物類型的基因組DNADNA經(jīng)某一種限制性內(nèi)切酶完全經(jīng)某一種限制性內(nèi)切酶完全酶解后，會酶解后，會產(chǎn)生分子量不同的同源等位片段產(chǎn)生分子量不同的同源等位片段，或稱限制，或稱限制性等位片段。性等位片段。v RFLP RFLP

24、標(biāo)記技術(shù)的基本原理就是標(biāo)記技術(shù)的基本原理就是通過電泳的方法分離和通過電泳的方法分離和檢測這些片段檢測這些片段。v凡是可以引起酶解位點變異的突變，如點突變（新產(chǎn)生凡是可以引起酶解位點變異的突變，如點突變（新產(chǎn)生和去除酶切位點）和一段和去除酶切位點）和一段DNADNA的重新組織（如插入和缺的重新組織（如插入和缺失造成酶切位點間的長度發(fā)生變化）等均可導(dǎo)致限制性失造成酶切位點間的長度發(fā)生變化）等均可導(dǎo)致限制性等位片段的變化，從而產(chǎn)生等位片段的變化，從而產(chǎn)生RFLPRFLP。 即：物種的基因組即：物種的基因組DNADNA在限制性內(nèi)切酶作用下，產(chǎn)生相在限制性內(nèi)切酶作用下，產(chǎn)生相當(dāng)多的大小不等的片段，用放射

25、性同位素標(biāo)記的當(dāng)多的大小不等的片段，用放射性同位素標(biāo)記的DNADNA作作探針，把與被標(biāo)記探針，把與被標(biāo)記DNADNA相關(guān)的片段檢測出來，從而構(gòu)建相關(guān)的片段檢測出來，從而構(gòu)建出多態(tài)性圖譜。出多態(tài)性圖譜?；蚪M學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和A A samplesample : 5 : 5 AG-GAATTC-GAAT AG-GAATTC-GAATT TC-GAATTC-CG 3C-GAATTC-CG 3 3 3 TC-CTTAAG-CTTA TC-CTTAAG-CTTAA AG-CTTAAG-GC 5G-CTTAAG-GC 5 AG- AG-

26、G G AATTC- AATTC-G G AATTC- AATTC-G G AATTC-CG AATTC-CG TC-CTTAA TC-CTTAA G G-CTTAA -CTTAA G G-CTTAA -CTTAA G G-GC-GCB B simplesimple : 5 : 5 AG-GAATTC-GAAT AG-GAATTC-GAATC CC-GAATTC-CG 3C-GAATTC-CG 3 3 3 TC-CTTAAG-CTTA TC-CTTAAG-CTTAG GG-CTTAAG-GC 5G-CTTAAG-GC 5 AG- AG-G G AATTC-GAATCC- AATTC-GAATC

27、C-G G AATTC-CG AATTC-CG TC-CTTAA TC-CTTAA G G-CTTAGG-CTTAA -CTTAGG-CTTAA G G-CG-CG基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和lAlBlAlBl限制性內(nèi)切酶位點l與放射性探針結(jié)合部位l 限制性內(nèi)切酶酶切后；l 電泳分離DNA片段；l 轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜；l 與放射性探針雜交，l 分析陽性條帶基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和 DNA限制性內(nèi)切酶酶切限制性內(nèi)切酶酶切 電泳電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜轉(zhuǎn)移到硝酸纖維

28、素濾膜 同位素或非放射標(biāo)記（如地高辛等）的探針雜交同位素或非放射標(biāo)記（如地高辛等）的探針雜交膠片放射自顯影，顯示酶切片段大小膠片放射自顯影，顯示酶切片段大小基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和vDNADNA提?。禾崛。簐酶切：酶切：3-5 ug DNA3-5 ug DNA，以以20 20 U U內(nèi)切酶酶切內(nèi)切酶酶切6 6小時小時至過夜。至過夜。 v電泳：電泳：0.6-0.8%0.6-0.8%瓊脂糖膠瓊脂糖膠30-60 30-60 V V電泳電泳6 6小時至小時至過夜。過夜。v染色觀察：染色觀察： 酶切電泳印跡基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)

29、生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和v變性：變性： 脫嘌呤：脫嘌呤：0.25 0.25 mol/Lmol/L中脫嘌呤，中脫嘌呤，10 10 minmin。變性：變性：0.5 0.5 mol/L NaOHmol/L NaOH， 1.5 1.5 mol/L NaClmol/L NaCl，45 45 minmin。水冼；水冼；中和：中和：1 1 mol/Ltris-HCl (pH7.5) mol/Ltris-HCl (pH7.5) ，1.5 mol/L NaCl1.5 mol/L N

30、aCl，30min30min。v印跡：印跡：用用10 10 SSC SSC ，進(jìn)行進(jìn)行Southern Southern 印跡印跡v沖洗：沖洗：以以2 2SSC SSC 冼膠，風(fēng)干冼膠，風(fēng)干基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和v預(yù)雜交：預(yù)雜交：將雜交膜放人預(yù)雜交液（水、將雜交膜放人預(yù)雜交液（水、5 5 HSBHSB、DenhardtDenhardt）中，中， 封好后置封好后置6565溫溫箱中振蕩箱中振蕩5 56 6小時。小時。v雜交：雜交：預(yù)雜交液

31、中加入標(biāo)記好的預(yù)雜交液中加入標(biāo)記好的markermarker和探和探針，放入雜交膜浸勻。封好雜交盒后，置針，放入雜交膜浸勻。封好雜交盒后，置6565溫箱中振蕩過夜。溫箱中振蕩過夜。v洗脫：洗脫：將膜轉(zhuǎn)入洗脫盒，加入洗脫液將膜轉(zhuǎn)入洗脫盒，加入洗脫液65 65 振蕩洗脫兩次（振蕩洗脫兩次（1515min/min/次）次），吸干包好。吸干包好?；蚪M學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和v將洗脫好的雜交膜置于增感屏上將洗脫好的雜交膜置于增感屏上, , 于暗室中將于暗室中將 X-X-光片放于雜交膜上，光片放于雜交膜上， 再放上另一張增感屏，再放上另一張增

32、感屏，裝人暗袋，并用夾板夾好。置裝人暗袋，并用夾板夾好。置-80-80超低溫冰超低溫冰箱中曝光過夜至箱中曝光過夜至1010天左右。天左右。v使用磷屏儀，操作更方便。使用磷屏儀，操作更方便。v用計算機(jī)處理得到的數(shù)據(jù)信息用計算機(jī)處理得到的數(shù)據(jù)信息基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和v來源：來源：cDNAcDNA探針與基因組探針與基因組DNADNA（gDNAgDN

33、A）探針探針cDNAcDNA探針探針: : 保守性較強(qiáng)，探針檢測的多態(tài)性頻率保守性較強(qiáng)，探針檢測的多態(tài)性頻率較低。較低。gDNAgDNA探針探針: : 檢測的多態(tài)性頻率較高，但不同種屬檢測的多態(tài)性頻率較高，但不同種屬特異性較強(qiáng)。特異性較強(qiáng)。如：如：水稻水稻RFLPRFLP探針可以在下列網(wǎng)頁獲?。禾结樋梢栽谙铝芯W(wǎng)頁獲?。?玉米玉米RFLPRFLP探針可以在下列網(wǎng)頁獲?。禾结樋梢栽谙铝芯W(wǎng)頁獲取： /probes. html /probes. html基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生

34、命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和v標(biāo)記物：放射性和非放射性兩種標(biāo)記物：放射性和非放射性兩種v放射性：放射性： v非放射性：生物素、地高辛素、熒光素非放射性：生物素、地高辛素、熒光素 放射性同位素標(biāo)記：放射性同位素標(biāo)記： 靈敏度高，成本低靈敏度高，成本低 但操作不便，標(biāo)記效率不太穩(wěn)定，壽命受半衰期限制但操作不便，標(biāo)記效率不太穩(wěn)定，壽命受半衰期限制 非放射性標(biāo)記（地高辛、生物素、熒光素等）：非放射性標(biāo)記（地高辛、生物素、熒光素等）： 安全，標(biāo)記穩(wěn)定，探針壽命較長安全，標(biāo)記穩(wěn)定，探針壽命較長 但靈敏度較低，背景較高，成本高但靈敏度較低，背景較高，成本高l32P、35S和3H 基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范

35、大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和v（1）隨機(jī)引物法v（2）切口平移法 v（3）末端標(biāo)記法v（4）單鏈DNA探針標(biāo)記v（5）寡核苷酸探針標(biāo)記法 標(biāo)記方法基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和v25 25 ngng變性變性DNA DNA v5 5 uL uL 寡聚核苷酸寡聚核苷酸v2 uL BSA2 uL BSAv3 uL -3 uL -3232P dCTP P dCTP v2 2 uL KlenowuL Klenow酶酶v加水至加水至50 50 uLuL，3737中標(biāo)記反應(yīng)中標(biāo)記反應(yīng)2 h2 h?；蚪M學(xué)基因

36、組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和q RFLP標(biāo)記技術(shù)所用的儀器設(shè)備l 雜交箱l 紫外交聯(lián)儀l 同位素檢測儀l 水浴及搖床l 電泳及轉(zhuǎn)膜裝置基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和優(yōu)點：v共顯性，可以區(qū)別純合和雜合基因型。v 穩(wěn)定、重復(fù)性強(qiáng)。v某些植物中開發(fā)探針已遍及整個基因組。缺點：vDNA需要量較大，技術(shù)復(fù)雜。v用于做圖較費時，難以分析大量樣品。v在基因組較大、嚴(yán)格自花授粉作物上多態(tài)性很低，使遺傳圖飽和度低?；蚪M學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和

37、向太和主題一、主題一、RAPDRAPD標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記技術(shù)基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和vRAPD (RRAPD (Randomandom A Amplifiedmplified P Polymorphismolymorphism D DNANA) )：Williams Williams (Du Pont)(Du Pont)等于等于19901990年創(chuàng)立。年創(chuàng)立。Williams J G K et al, Nucl Acids Res, 1990(18):6531 v其基本原理基于其基本原理基于PCRPCR技術(shù)：技術(shù)： RAPDRAPD

38、標(biāo)記技術(shù)就是用一個隨機(jī)引物（標(biāo)記技術(shù)就是用一個隨機(jī)引物（1010個堿基左右）非定點個堿基左右）非定點地擴(kuò)增基因組地擴(kuò)增基因組DNADNA，然后用凝膠電泳分開擴(kuò)增片段。，然后用凝膠電泳分開擴(kuò)增片段。遺傳材料的基因組遺傳材料的基因組DNADNA如果在特定引物結(jié)合區(qū)域發(fā)生如果在特定引物結(jié)合區(qū)域發(fā)生DNADNA片片段插入、缺失或堿基突變，就有段插入、缺失或堿基突變，就有可能導(dǎo)致引物結(jié)合位點的分可能導(dǎo)致引物結(jié)合位點的分布發(fā)生相應(yīng)的變化，導(dǎo)致布發(fā)生相應(yīng)的變化，導(dǎo)致PCRPCR產(chǎn)物增加、缺少或發(fā)生分子量產(chǎn)物增加、缺少或發(fā)生分子量變化。變化。若若PCRPCR產(chǎn)物增加或缺少，產(chǎn)物增加或缺少，則產(chǎn)生則產(chǎn)生RAPD

39、RAPD標(biāo)記。標(biāo)記。 基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和 二二、PCRPCR技術(shù)技術(shù)-回顧：回顧：PCR(PCR(P Polymerase olymerase C Chain hain R Reaction)eaction)技術(shù)：技術(shù)：vThree steps:Three steps: denaturation, denaturation, primer annealing, primer annealing, polymerization. polymerization.vP Peoples eoples C Choice hoice

40、 R Reactioneaction基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和 95 95o oC step toC step to denature denature the duplex DNA, the duplex DNA, An An annealingannealing step of around 55C to allow step of around 55C to allow the primers to bind,the primers to bind, 72 72o oC C polymerization polymeriz

41、ation step. step. Mg Mg2+2+, dNTPs, dNTPs are required in addition to are required in addition to template,primers,buffer and enzymetemplate,primers,buffer and enzyme基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和vTemplate (DNA/cDNA),Template (DNA/cDNA),vprimers,primers,vTaq enzyme,Taq enzyme,v1010PC

42、R buffer, with PCR buffer, with MgMg2+,2+,vdNTPsdNTPspre-denaturation-pre-denaturation-denature completelydenature completelyDenaturationDenaturationannealingannealingElongationElongationcycles: 25-30cycles: 25-30基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和u PCR reaction components and their funct

43、ions PCR reaction components and their functionsp template template： ssDNA, dsDNAssDNA, dsDNA mRNA needed to be RT as cDNA mRNA needed to be RT as cDNAsamplessamples：from blood,sperm or any other from blood,sperm or any other tissue,from older forensic specimens, from tissue,from older forensic spec

44、imens, from ancient biological samples or in the lab. From ancient biological samples or in the lab. From bacterial colonies or phage plaques.bacterial colonies or phage plaques.DNADNA：very stablevery stable基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和q primersprimersIf the PCR product is to be clo

45、ned, it is If the PCR product is to be cloned, it is sensible to include the sequence of unique sensible to include the sequence of unique restriction enzyme sites within the 5restriction enzyme sites within the 5-ends -ends of the primers.of the primers.Can amplify fragments over 10kb in lengthCan

46、amplify fragments over 10kb in lengthStore:Store:純化引物在純化引物在2525乙腈溶液中乙腈溶液中44；凍；凍干引物于干引物于-20-20可保存可保存1-21-2年，液體狀態(tài)于年，液體狀態(tài)于- -2020可保存可保存6 6個月。不用時應(yīng)個月。不用時應(yīng)-20-20保存。保存?；蚪M學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和 Primer design Primer designMost important!Most important!(1)(1)length:length: 20 2030bp30bp(

47、2)(2)G+C contents:G+C contents:ATCG random distributedATCG random distributed(3)(3)primers :primers : no complementary sequence no complementary sequence(4)(4)3 3end of the primer:end of the primer: no modification no modification(5)(5)5 5end of the primer:end of the primer:product lengthproduct len

48、gth，can becan be modified modified(6) (6) specificity:specificity:less than 70% homology with non-less than 70% homology with non-specific amplification sequence, or 8bpspecific amplification sequence, or 8bpcontinuous complementary basecontinuous complementary base基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)

49、境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和 Primer designed with the help of Primer designed with the help of computercomputervDNA databaseDNA databasevconservative region comparision, blast conservative region comparision, blast vPrimer designed softwarePrimer designed software基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和q buff

50、er buffer：10-50 mmol/L 10-50 mmol/L Tris-HClTris-HCl(pH8.3-8.8, 20)(pH8.3-8.8, 20)。1.5-2.5 mmol/L1.5-2.5 mmol/L Mg Mg2+2+： forfor Taq polymerase activityTaq polymerase activity Low Low conc.: low activityow activity high high conc. : non-specific amplification: non-specific amplificationq dNTPsdNTPs

51、：貯備貯備dNTPdNTP液液：1 mol/L NaOH 1 mol/L NaOH 調(diào)調(diào)pHpH至中性。貯備濃度至中性。貯備濃度為為5-10mmol/L5-10mmol/L，終濃度為，終濃度為20-200 umol/L20-200 umol/L，分裝，分裝-20-20保存。保存。4 4種種dNTPdNTP濃度應(yīng)相同。濃度應(yīng)相同?；蚪M學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和q Taq DNA polymeraseTaq DNA polymerase：from thermophilic bacteria. from thermophilic bact

52、eria. Taq polymerase from Taq polymerase from Thermus aquaticusThermus aquaticus. .other thermostable DNA polymerase with other thermostable DNA polymerase with greater accuracy used for certain applications.greater accuracy used for certain applications.基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太

53、和v分離分離: : 19691969年，美國黃石國家公園溫泉。年，美國黃石國家公園溫泉。v分子量分子量: : 94KDa94KDav活性：活性：在幾種水生棲熱菌中活性最高，在幾種水生棲熱菌中活性最高，200000U/mg200000U/mgv離子需要：離子需要：對對MgMg2+2+、單價離子性質(zhì)和濃度較單價離子性質(zhì)和濃度較 敏感。最適濃度為敏感。最適濃度為50mmol/L50mmol/Lv忠實性忠實性: : 沒有校正單核苷酸錯配功能沒有校正單核苷酸錯配功能- -致命弱點。一致命弱點。一般出錯率為般出錯率為2 21010-4-4核苷酸核苷酸/ /每輪循環(huán)，利用每輪循環(huán)，利用PCRPCR克隆、克隆

54、、測序時尤應(yīng)注意。測序時尤應(yīng)注意?；蚪M學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和v抑制劑抑制劑: : 尿素、乙醇、尿素、乙醇、DMSODMSO、DMFDMF、甲、甲酰胺、酰胺、SDSSDS及許多其他化學(xué)藥劑。及許多其他化學(xué)藥劑。v內(nèi)源內(nèi)源DNA:DNA: 不同來源的酶可能由于制備過不同來源的酶可能由于制備過程中殘留的原細(xì)菌程中殘留的原細(xì)菌DNADNA或或PCRPCR產(chǎn)物的污染產(chǎn)物的污染而含有不明來源的而含有不明來源的DNADNA。在使用擴(kuò)增保。在使用擴(kuò)增保守序列的通用引物時，會在無模板對照管守序列的通用引物時，會在無模板對照管出現(xiàn)擴(kuò)增帶。出現(xiàn)擴(kuò)增帶

55、。v保存保存: : 在在-20-20至少至少6 6個月。個月?；蚪M學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和Selection for DNA polymeraseSelection for DNA polymeraseKlenowKlenow酶酶早期采用早期采用該酶不耐熱，缺點有該酶不耐熱，缺點有: :溫度要求低溫度要求低(37)(37)，受熱即失活；，受熱即失活；產(chǎn)物特異性不高；產(chǎn)物特異性不高；積累大量的失活殘酶，使反應(yīng)產(chǎn)物純度大大降低；積累大量的失活殘酶，使反應(yīng)產(chǎn)物純度大大降低；擴(kuò)增的最長序列約擴(kuò)增的最長序列約400bp400bp（TaqTa

56、q酶則能擴(kuò)增酶則能擴(kuò)增10kb10kb）基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和thermostable DNA polymerasesthermostable DNA polymerasesTaq DNA polymeraseTaq DNA polymeraseTth DNA polymeraseTth DNA polymerasefrom from T.thermophilusT.thermophilusVENT DNA polymeraseVENT DNA polymerasefrom from T.litoralisT.litoral

57、isSac polymeraseSac polymerasepfu polymerasepfu polymerase基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和qmineral oil基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和q PCR optimization PCR optimization變性溫度和時間變性溫度和時間92-9592-95，富含，富含G G和和C C的序列，可適當(dāng)提高，但過高或的序列，可適當(dāng)提高，但過高或時間過長都會導(dǎo)致酶活性損失。時間過長都會導(dǎo)致酶活性損失。退火溫度與時間退火

58、溫度與時間引物中引物中G G、C C含量高、含量高、 長度長并與模板完全配對時，長度長并與模板完全配對時，應(yīng)提高溫度。溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。通常應(yīng)提高溫度。溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。通常37-37-5555、1-21-2分鐘。分鐘。延伸溫度和時間延伸溫度和時間溫度：溫度：7272，接近，接近TaqTaq酶的最適酶的最適7575時間：過長會導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加。但對低濃度的時間：過長會導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加。但對低濃度的目的序列，則可適當(dāng)增加時間。目的序列，則可適當(dāng)增加時間。循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)循環(huán)過多，非特異性產(chǎn)物大量增加循環(huán)過多，非特異性產(chǎn)物大量增加基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)

59、學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太和向太和PCRPCR技術(shù)技術(shù)發(fā)展速度驚人，沒有一種技術(shù)發(fā)展速度驚人，沒有一種技術(shù)能與之相比。能與之相比。PCRPCR技術(shù)技術(shù)是目前引用論文最多的技術(shù)，是目前引用論文最多的技術(shù)，應(yīng)用范圍十分廣泛。應(yīng)用范圍十分廣泛。PCR PCR 技術(shù)技術(shù)19931993年度諾貝爾化學(xué)獎年度諾貝爾化學(xué)獎（MullisMullis），與開創(chuàng)了），與開創(chuàng)了“寡核苷酸基因定寡核苷酸基因定點誘變點誘變”加拿大籍英國科學(xué)家加拿大籍英國科學(xué)家Michael Michael SmithSmith共獲共獲 。 基因組學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院

60、向太和向太和三、三、RAPDRAPD技術(shù)與常規(guī)技術(shù)與常規(guī)PCRPCR不同的地方：不同的地方：引物長度短：引物長度短：常規(guī)常規(guī)PCRPCR中需要兩個引物，長度中需要兩個引物，長度20-3020-30個核苷酸。個核苷酸。 RAPDRAPD只需一個引物，長度只需一個引物，長度9-109-10個核苷酸，而且個核苷酸，而且是隨機(jī)引物。是隨機(jī)引物。退火溫度低：退火溫度低：RAPDRAPD引物短，因此退火溫度要低，一般為引物短，因此退火溫度要低，一般為35-35-3737。擴(kuò)增結(jié)果可以是擴(kuò)增結(jié)果可以是1 1至多條帶至多條帶?；蚪M學(xué)基因組學(xué) 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 向太