膀胱尿路上皮癌Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白表達及意義

1、膀胱尿路上皮癌Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白表達及意義【摘要】 目的 研究Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域 (FADD) 蛋白在膀胱尿路上皮癌（BUC）組織的表達，并探討其與腫瘤生物學(xué)行為之間的關(guān)系。方法 采用免疫組化SP法檢測68例BUC及13例正常膀胱黏膜組織FADD蛋白表達。原位雜交法檢測其中34例BUC組織FADD mRNA 表達水平。結(jié)果 正常膀胱黏膜FADD蛋白呈陽性表達。FADD的陽性率在不同組織學(xué)分級、不同臨床分期的BUC組織中差異均有極顯著性(2=15.38、11.34，P<0.01)；復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組FADD的陽性率分別為36.84%和53.33%,差異無顯著意義(2=1.85

2、，P>0.05)。BUC組織中FADD mRNA陽性率為44.12%, FADD蛋白陽性率為47.06%,兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(2=0.06，P>0.05)。結(jié)論 FADD表達異常在BUC的發(fā)展中可能起著重要作用, FADD陽性表達與BUC病理分級、浸潤關(guān)系密切，但與BUC復(fù)發(fā)無關(guān)。 【關(guān)鍵詞】 Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白；膀胱腫瘤；免疫組織化學(xué)；原位雜交 ABSTRACT Objective To investigate the Fas-associated death domain (FADD) protein and its biological behavio

3、r in bladder urothelial carcinoma (BUC). Methods The expressions of FADD in 68 BUC and 13 normal bladder tissue were detected by streptavidin-peroxidase immunohistochemical technique. Of which, 34 BUC were studied by in-situ hybridization for FADD mRNA. Results The various exprssions of FADD were as

4、 follows: it positively expressed in normal bladder mucosa; the differences of positive expression were significant among different histological grading and clinical staging (2 / 132=15.38,11.34;P<0.01); its expression in recurrent group and non-recurrent group was 36.84% and 53.33%, respecti

5、vely, the difference was insignificant (2=1.85,P>0.05). In BUC, the positive FADD mRNA was 44.12% and FADD protein was 47.06%, with no statistical difference was noted between them (2=0.06,P>0.05)。 Conclusion The abnormal expression of FADD may play an important role in the development

6、 of BUC. The positive expression of FADD in the cancer is closely related to the pathological grading and invasion, but not related to its recurrence. KEY WORDS Fas-associated death domain protein; Bladder neoplasmas; Immunohistochemistry; In situ hybridization Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域(FADD)蛋白能與Fas相互作用而誘導(dǎo)細胞凋亡,在細胞

7、凋亡信號傳導(dǎo)通路中起重要作用,但其在膀胱尿路上皮癌（BUC）發(fā)病過程中的作用尚不清楚。我們分別采用免疫組化SP法、原位雜交法檢測BUC組織中FADD蛋白及mRNA表達, 并探討FADD與BUC生物學(xué)行為之間的關(guān)系?，F(xiàn)報告如下。 1 材料與方法 1.1 標(biāo)本 隨機選取我院19992002年經(jīng)手術(shù)切除的初發(fā)性BUC石蠟標(biāo)本68例，男49例，女19例；年齡3085歲，平均60.2歲。臨床病理分期按國際抗癌協(xié)會（UICC-TNM）標(biāo)準(zhǔn)確定，其中淺表性(TisT1)腫瘤32例，浸潤性(T2T4)腫瘤36例。病理分級按世界衛(wèi)生組織（WHO）1998年標(biāo)準(zhǔn)確定，其中級（G1）13例，級（G2）29例，級（G

8、3）26例。68例病人均獲隨訪，復(fù)發(fā)38例。其中34例為新鮮組織標(biāo)本，用于原位雜交。13例正常膀胱黏膜組織標(biāo)本取自非腫瘤病人。標(biāo)本均5 m厚連續(xù)組織切片，分別進行蘇木精-伊紅染色、免疫組織化學(xué)染色及原位雜交。所有病例術(shù)前均未經(jīng)放療、化療及免疫治療。 1.2 FADD蛋白檢測 采用免疫組化SP法。山羊抗人FADD單克隆抗體為Santa Cruz Biotech公司產(chǎn)品,其工作濃度為130；兔抗山羊血清及SP試劑盒為北京中山生物有限公司產(chǎn)品；DAB為Sigma公司產(chǎn)品。用已知肺癌陽性切片作陽性對照，用PBS代替山羊抗人FADD單克隆抗體作陰性對照，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹脂封片。具體操作步驟

9、按試劑盒說明書進行。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：FADD蛋白陽性細胞為胞漿內(nèi)有棕黃色細顆粒；每張切片隨機選擇5個高倍視野, 每視野計數(shù)200個細胞(癌組織計數(shù)癌細胞,正常膀胱黏膜組織計數(shù)上皮細胞)，無陽性反應(yīng)為陰性(-),陽性細胞數(shù)<25%為弱陽性(+),25%75%為中度陽性(),>75%為強陽性()。 1.3 FADD核酸原位雜交 探針序列：5-GACCCGTTCCTGGTGCTGCT-GCACTCGGTG-3;5-AGCTGGAGCGCGTGCAG-AGCGGCCTAGACC-3;5-GAGCAGAACGACCTGGAGCCCGGGCACACC-3。實驗嚴(yán)格按說明書進行,原

10、位雜交陽性對照片由試劑盒提供,省去探針步驟為陰性對照。最后用DAB顯色,鏡下觀察,FADD mRNA陽性細胞為胞質(zhì)內(nèi)有藍色顆粒。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn): 采用半定量分析方法（AB值法），連續(xù)觀察5個高倍視野，每視野計數(shù)200個癌細胞。以染色強度評分：0分為細胞無著色，1分為淺藍色，2分為深藍色；以顯色細胞比例評分：<25%為0分, 25%75%為1分, >75%為2分。兩項相加,得分<2分為陰性,24分為陽性。 1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計學(xué)軟件，采用2檢驗及Spearman相關(guān)分析進行統(tǒng)計學(xué)處理。 2 結(jié) 果 2.1 FADD蛋白的表達 13

11、例正常膀胱黏膜組織FADD蛋白均呈陽性表達，68例BUC組織中30例FADD蛋白陽性表達（44.12%），二者相比差異有極顯著性(2=13.69，P<0.01)。BUC組織中FADD蛋白表達大多呈中度或強陽性(24/30),而正常膀胱黏膜組織大多呈弱陽性(11/13),BUC組織中FADD蛋白表達強度高于正常膀胱黏膜組織(2=15.84,P<0.01)。 2.2 FADD mRNA的表達 本文BUC組織中FADD mRNA的陽性表達率為44.12%(15/34),而FADD蛋白陽性表達率為47.06%(16/34)。其中2例免疫組化結(jié)果陽性,而原位雜交結(jié)果陰性;1例

12、免疫組化結(jié)果陰性,而原位雜交結(jié)果陽性,兩者符合率為81.67%。免疫組化與原位雜交檢測陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(2=0.06，P>0.05)。 2.3 FADD蛋白表達與BUC病理分級、臨床分期的關(guān)系 本文BUC組織G1、G2、G3陽性表達率分別為84.62%、48.28%、19.23%，差異有極顯著性（2=15.38，P<0.01）；兩兩比較,G1與G2、G2與G3差異有顯著意義(2=4.92、5.12，P<0.05)，G1與G3間差異有極顯著性(2=15.31，P<0.01)。FADD蛋白的陽性表達率隨腫瘤細胞分化程度的降低而降低,兩者

13、呈顯著正相關(guān)(rs=0.47,P<0.01)。淺表性BUC的陽性表達率為65.63%，浸潤性BUC為25.00%，兩者差異有極顯著性（2=11.34，P<0.01）；FADD蛋白的陽性表達率隨腫瘤臨床分期的升高而降低,兩者呈顯著負相關(guān)(rs=-0.41,P<0.01)。 2.4 FADD蛋白表達與BUC復(fù)發(fā)的關(guān)系 本文38例復(fù)發(fā)者FADD蛋白陽性表達14例（36.84%），30例無復(fù)發(fā)者FADD蛋白陽性表達16例（53.33%），兩者差別無顯著性（2=1.85，P>0.05）。FADD蛋白的陽性表達率與腫瘤復(fù)發(fā)與否無關(guān)(rs=0.16,P

14、>0.05)。 3 討 論 FADD蛋白是由CHINNAIYAN 等1和BOLDIN等2于1995年幾乎同時篩選出來的一種能與Fas分子胞內(nèi)段死亡域相互作用的新蛋白。FADD蛋白是一種相對分子質(zhì)量為2.3 萬的胞漿蛋白，其基因定位于人染色體11q13.3上, 由2個外顯子和1個內(nèi)含子組成,編碼208個氨基酸。FADD蛋白由羧基末端的死亡結(jié)構(gòu)域(DD)和氨基末端的死亡效應(yīng)域(DED)兩部分組成。 腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是多因素參與的復(fù)雜過程，其中細胞凋亡調(diào)控失調(diào)是腫瘤組織過度生長的重要原因3。參與調(diào)控細胞凋亡的蛋白很多,其中FADD是Fas、TNFR1和DR3凋亡信號途徑中的必需蛋白4,

15、尤其在Fas凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著承上啟下的關(guān)鍵作用。FADD以其羧基末端死亡結(jié)構(gòu)域(FADD-DD)直接與Fas的死亡結(jié)構(gòu)域結(jié)合,相互作用之后顯露出其氨基末端的死亡效應(yīng)域(FADD-DED),并隨即與無活性的caspase-8酶原發(fā)生同嗜性交聯(lián),使之活化, 構(gòu)成所謂死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體,進而引起隨后的caspase級聯(lián)反應(yīng),最終導(dǎo)致細胞凋亡4,5。因此，F(xiàn)ADD蛋白表達異?；蚬δ軉适?將使Fas/ Fasl 結(jié)合后的促細胞凋亡信號不能有效地轉(zhuǎn)導(dǎo),從而阻止細胞凋亡。研究表明，F(xiàn)ADD異常導(dǎo)致凋亡通路異常與多種腫瘤發(fā)病之間有密切關(guān)系6,7。體外實驗表明，一些腫瘤的治療是通過調(diào)節(jié)FADD的凋亡信號通

16、路而發(fā)揮作用的8,這為今后BUC的藥物或基因治療提供了線索和思路。 我們在檢測FADD蛋白表達的同時,對FADD mRNA的表達也進行了檢測,統(tǒng)計學(xué)分析顯示,免疫組化與原位雜交檢測陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義,并證實了兩者的一致性。 本實驗用免疫組化方法從蛋白合成水平檢測人BUC組織中FADD的表達，并將FADD表達與反映BUC惡性生物學(xué)行為的各項病理參數(shù)結(jié)合起來分析。結(jié)果顯示，BUC組織中FADD陽性表達顯著低于正常膀胱黏膜組織,而且BUC組織中FADD陽性表達與腫瘤分化程度及臨床分期密切相關(guān),表明其表達水平與腫瘤的惡性程度、浸潤深度有一定關(guān)系。但FADD蛋白的陽性表達與腫瘤復(fù)發(fā)與否無關(guān)，提示FA

17、DD對BUC預(yù)后判斷價值不大。同時還顯示，BUC組織中FADD表達程度多為中等或強陽性,顯著強于正常膀胱黏膜組織, 這種BUC組織中FADD高表達,可能是機體主動抗腫瘤的一種自衛(wèi)機制。FADD表達減少會導(dǎo)致BUC細胞凋亡減少，從而促使癌細胞累積增多,表明FADD表達異常在BUC發(fā)病機制中起重要作用。 綜上所述，F(xiàn)ADD表達異常在BUC的發(fā)展中可能起著重要作用, FADD陽性表達與BUC病理分級、浸潤關(guān)系密切，但與腫瘤復(fù)發(fā)無關(guān)。 【參考文獻】 1CHINNAIYAN A M, OROURKE K, TEWARI M, et al. FADD, a novel death domain-conta

18、ining protein, interacts with the death domain of Fas and initiates apoptosisJ. Cell, 1995,81(4):505-512. 2BOLDIN M P, METT I L, VARFOLOMEEV E E, et al. Self-association of the “death domains” of the p55 tumor necrosis factor (TNF) receptor and Fas/APO1 prompts signaling for TNF and Fas/APO1 effects

19、J. J Biol Chem, 1995,270(1):387-391. 3羅波.VEGF和上皮鈣黏蛋白在膀胱移行細胞癌組織表達J. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2005,41(4):317-319. 4CHINNAIYAN A M, OROURKE K, YU G L, et al. Signal transduction by DR3, a death domain-containing receptor related to TNFR-1 and CD95J. Science, 1996,274(5289):990-992. 5CHINNAIYAN A M, TEPPER C G, SELDIN M F, et al. FADD/MORT1 is a common mediator of CD95 (Fas/APO1) and tumor necrosis factor-induced apoptosisJ. J Biol