第四章現(xiàn)代液相色譜分離技術

1、第四章 液相色譜分離技術第一節(jié) 液相色譜儀器系統(tǒng)411 液相色譜儀基本組成現(xiàn)代液相色譜儀主要分為分析、制備、專用三種類型。雖然各類儀器的型號很多，性能各異，應用范圍不同，但是其基本組成部件是類似的，即由輸液系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、柱分離系統(tǒng)、檢測和記錄系統(tǒng)組成，包括溶劑貯液器、高壓泵、進樣器、色譜分離柱、檢測器、記錄儀等主要部件，見圖4-1，還有梯度、溫度控制器、自動進樣器、數(shù)據(jù)處理裝置等。412 溶劑貯存器及溶劑脫氣 溶劑貯存器通常用不銹鋼、玻璃或聚四氟塑料制成，體積為0.5-2升。在使用過程中，一定要蓋嚴，以免溶劑揮發(fā)影響流動相組成比例的變化。所有溶劑在放入溶劑瓶之前，一定要過濾。液相色譜的流動相

2、在進入高壓泵之前，還要脫氣，否則，很容易在系統(tǒng)的低壓部分逸出氣泡，氣泡的出現(xiàn)，不僅影響色譜柱的分離效率，而且影響檢測器的局限穩(wěn)定性，降低靈敏度，甚至不能正常工作。常用的脫氣方法有抽真空法、吹氦法、超聲波脫氣法等。真空法和超聲波法分別將流動相處于一定真空度下和超聲波清洗器中進行脫氣；吹氦法是在表壓1公斤/平方厘米，流速60ml/min的條件下保持15min，氦氣將溶劑中的空氣帶出并使溶劑飽和。 溶劑貯液器 流動相 泵 梯度控制單元 檢測器 色譜分離柱 進樣器 自動進樣裝置 樣品 固定相 溫度控制器 記錄儀 溫度控制器 積分儀 餾分接收儀 數(shù)據(jù)處理器（工作站） 圖4-1 現(xiàn)代液相色譜儀結構框圖41

3、3 輸液系統(tǒng) 高壓泵是現(xiàn)代液相色譜儀的關鍵部件之一，其功能是將貯液器內(nèi)的流動相以高壓的形式連續(xù)不斷地送入液路系統(tǒng)，使樣品在色譜柱中完成分離過程。泵的性能優(yōu)劣直接關系著整個分析結果的可靠性，為得到好的分離效果，對泵有以下嚴格要求， 輸出壓力高：150-300公斤/平方厘米柱入口壓力，最高輸出壓力應達到500公斤/平方厘米。 流量范圍廣：分析型的在0.1-10ml/min，制備型的在10-100 ml/min。 流量穩(wěn)定：流量重復性和精度在0.5%左右。 耐腐蝕：適合于各種溶劑、緩沖溶液。 其他：密封性好，泵室體積小，便于清洗，便于實現(xiàn)梯度洗脫。 1.氣動泵是最簡單的高壓泵，是現(xiàn)代液相色譜中應用最

4、早的一種。它是以高壓氣源為動力，調(diào)節(jié)氣壓可以調(diào)節(jié)流量。應用較多的是氣動放大泵，根據(jù)壓力傳導原理設計制成的，主要部件由汽缸和液缸組成。 2.往復柱塞泵這是目前用的最多的一種，它由液缸、柱塞、單向閥、驅(qū)動機構組成，見圖4-2。 活塞 色譜分離柱 偏心輪 單向閥 密封環(huán) 貯液器 圖4-2 往復柱塞泵 這種往復泵的往復頻率較高，100次/min，所以對其密封墊和單向閥的剛度、精度、耐磨性要求很高，密封墊一般由聚四氟乙烯-石墨制成，而單向閥的閥球、閥座、柱塞則由人工紅寶石材料制成。泵體的結構決定了泵的基本性能，如輸液能力、穩(wěn)定性、重復性等。為了獲得高穩(wěn)定性、重復性的輸液效果，現(xiàn)在多采用多泵頭結構。例如3

5、多泵頭高壓泵就是三個泵頭間有120度的相位差，所以流量的波動得到了補償，減小了脈沖。雙泵頭可以組成串聯(lián)和并聯(lián)（180度的相位差）兩種形式。414 進樣系統(tǒng) 進樣系統(tǒng)是將樣品送入色譜柱的裝置，目前常用的方式是閥式進樣。高壓進樣閥是現(xiàn)代液相色譜儀的優(yōu)良進樣裝置，通常采用帶有定量管的六通閥。它的優(yōu)點是進樣量可變范圍大，進樣量大，重復性高，分析和制備通用。缺點是死體積大，容易引起峰變寬，制造工藝要求高。 六通閥通常由閥體、閥芯、定量管組成。閥體用不銹鋼制成，內(nèi)壁精密加工。旋轉(zhuǎn)密封部分由堅硬的鋁合金陶瓷材料或耐磨的聚四氟乙烯材料制作，既耐磨又有良好的密封性。操作分兩步驟進行（見圖4-3），當閥處于裝樣時

6、，1和6，2和3連通，樣品從4（針孔）位置進入定量管，多余的從6排出；當閥處于進樣時，將閥芯順時針旋轉(zhuǎn)60度，這時，1和2，3和4，5和6連通，貯存于定量管中的樣品在流動相的帶動下，進入色譜柱，實現(xiàn)分離。 泵 1 2 6 3 色譜柱 裝樣狀態(tài) 5 4 針孔 泵 1 2 6 3 色譜柱 進樣狀態(tài) 5 4 圖4-3 六通閥進樣步驟 第二節(jié) 液相色譜柱現(xiàn)代液相色譜的發(fā)展與色譜柱技術的突破密不可分的。色譜柱是色譜儀的重要附件之一，是色譜儀的心臟?，F(xiàn)代液相色譜柱分為常規(guī)、快速、微徑柱等，其主要參數(shù)列于表4-1。表4-1 現(xiàn)代液相色譜柱主要參數(shù)柱類型管內(nèi)徑（mm）柱長（cm）填料粒徑（微米）流速（ml/m

7、in）檢測池體積（微升）常規(guī)快速微徑2-52-50.5-110-503-510-305-1031-30.5-22-50.1-1<10<3<1 421 色譜柱的結構 1色譜柱材料與尺寸 為了能夠耐高壓、耐腐蝕，色譜柱一般采用優(yōu)質(zhì)不銹鋼制成。不銹鋼的內(nèi)壁必須進行精細的拋光處理（光潔度要求在Ñ8以上）， 若內(nèi)壁有縱向溝槽或光潔度不夠，均會引起波譜峰的變寬，使柱效下降。 對于現(xiàn)代色譜而言，色譜柱的規(guī)格一般為10-30cm長，內(nèi)徑為2-5mm，所裝填料（或稱固定相）顆粒在3-10mm之間。管徑明顯影響柱效，因為組分在柱內(nèi)不僅存在縱向擴散，而且存在徑向擴散，特別是當流速較慢時，

8、徑向擴散更加嚴重，使峰展寬。一般而言，柱長應不小于柱徑的10-20倍，柱徑應為粒徑的60-80倍。2. 濾片、柱接頭、連接管 色譜柱兩端的接頭是為了通過連接管與色譜系統(tǒng)相連接，在接頭內(nèi)要裝上不銹鋼燒結濾片，柱出口端的濾片是為了擋住固定相，防止其六如檢測器或堵塞管路。濾片的空隙度要小于固定相的顆粒粒徑。 柱接頭和連接管不僅要耐腐蝕，更重要的是死體積小，進樣器與柱，柱與檢測器之間的連接管的直徑要小于0.25mm。422 色譜柱填料的一般特性 填料的特性決定了色譜柱的性能。填料的熱力學特性影響色譜柱的選擇性，填料的結構特點決定了色譜柱的柱效率，這在第二章中已經(jīng)涉及過?？傊?，從Van Deemter速

9、率方程可以看出，無論從停滯流動相的質(zhì)量傳遞，或者從渦流擴散和流動相質(zhì)量傳遞來考慮，填料的粒徑小，均有助于提高柱效。 1. 表面多孔型（薄殼型）填料 表面多孔型（Superficially porous）或薄殼型（Pellicular Bead）填料（圖4-4）是為現(xiàn)代液相色譜設計的第一種優(yōu)質(zhì)填料，多用在20世紀60、70年代。這種填料的中心是一個惰性的硬核，在核的表面包敷一層很薄的多孔物質(zhì)，如硅膠、氧化鋁、聚酰胺、離子交換樹脂等，也可以是鍵合固定相。它的粒徑通常在20-40mm，比表面積在1-15m2/g，孔徑在100-500埃之間。其機械強度高、滲透性好、傳質(zhì)速度快，柱效較高。 1-2mm

10、核內(nèi)深坑 實心核 表面多孔型 球型 全多孔型 圖4-4 液相色譜填料類型 2全多孔填料 包括球形和無定形，直徑在3-10mm，比表面積為60-600m2/g，孔體積在0.2-2ml/g之間。改善了固定相和停滯流動相的傳質(zhì)速率，提高了柱效。 小顆粒粒徑對提高柱效非常有利，但是柱壓也會急劇增加，因此要在較低的柱壓下操作，必須減小柱長度。此時也可提高分析速度。423 色譜柱的裝填方法分干法和濕法兩種。對于粒徑大于20mm的填料來講，采用干法，小于20mm的填料，采用濕法裝填。濕法也叫勻漿法，即以一合適的溶劑為分散介質(zhì)，經(jīng)超聲波分散、脫氣處理后，形成勻漿，然后在高壓下將勻漿壓入色譜柱，即完成了裝柱過程

11、。勻漿法有平衡密度法、非平衡密度法、高粘度法，不論采用哪種方法，目的是盡量減低填料顆粒的自由沉降速度，保證填充均勻。目前通常采用第二種方法，即選用環(huán)己烷/二氧六環(huán)或四氯化碳/二氧六環(huán)作溶劑。裝填的壓力在350-450 kg/cm2的水平上，見圖4-5。 高壓閥 勻漿罐 氣壓表 色譜柱 氣動泵 圖4-5 色譜柱填充裝置423色譜柱的性能評價 對一根色譜柱無論是自己裝填的，還是購買的，在使用前都應進行評價。柱性能的評價標準雖然并不統(tǒng)一，但是應主要從動力學角度考慮。表4-2列出了評價不同色譜柱所用的測試物質(zhì)。表4-2 評價不同色譜柱所用的測試物質(zhì)柱類型測試物質(zhì)流動相吸附柱苯、萘、聯(lián)苯己烷反相柱苯、萘

12、、聯(lián)苯甲醇/水（8：2）氰基柱甲苯、苯乙睛、苯乙酮己烷/異丙醇（98：2）氨基柱聯(lián)苯、硝基苯庚烷醚基柱鄰間對硝基苯胺己烷/二氯甲烷/異丙醇（70：30：5）1. 柱效 根據(jù)塔板數(shù)的公式計算。 2.計算色譜的對稱性 10%峰高處A/B的比值。 3. 孔隙率e e為色譜柱的自由截面積與實際截面積的比值。 e=4Ft0/Lpdc2 （4-1）dc為柱內(nèi)徑。 4. 滲透性K0 K0= Luh/DP （4-2）DP為柱壓降。第三節(jié) 檢測器431 紫外吸收檢測器 該檢測器是液相色譜使用最廣泛的一種檢測器，幾乎所有的液相色譜儀都配有紫外檢測器。它對溫度和流速不敏感，適用于梯度洗脫，選用無紫外吸收的溶劑作流動

13、相，用于有紫外吸收的物質(zhì)檢測。它遵循郎伯-比耳定律，即， A=e C l （4-3）e為摩爾吸收系數(shù)，l為樣品池的光路長度。 按光路系統(tǒng)分有單、雙光路兩種，按波長分有固定和和可變波長兩種。常用的固定波長有214、230、254、280nm。檢測池的體積和構型直接影響柱效和靈敏度。標準的池體積為5-8ml，光程5-10mm。常用的流通池的形狀為Z和H形，見圖4-6。 光 光 流動相 流動相 Z形 H形 圖4-6 常見紫外檢測器的樣品池432 熒光檢測器它是一種高靈敏、高選擇性檢測器，可檢測有熒光的物質(zhì)。很多生化物質(zhì)包括某些代謝產(chǎn)物、藥物、氨基酸、胺類、維生素、甾族化合物都有熒光，可用該檢測器進行

14、檢測。具有某種特殊結構的化合物，受紫外光激發(fā)后，能輻射出比紫外光波長較長的光線，一般在可見光線范圍內(nèi)。這種光線叫做熒光（Stokes熒光），波長較短的光線叫激發(fā)光，波長較長的熒光叫發(fā)射光。熒光檢測器測定的是物質(zhì)的熒光強度F，F(xiàn)=2.3QKI0eCl (4-4)Q為熒光量子效率，K是熒光收集效率，I0是入射光強度，C為組分的濃度。該檢測器分多波長和分光光度兩種，前者用濾光片單色器，后者為光柵單色器。熒光檢測器的光源通常為山燈，它可以在250-600nm的范圍內(nèi)發(fā)出連續(xù)光譜，經(jīng)單色器分光后，選擇合適的波長作為激發(fā)光，激發(fā)光進入樣品池后，樣品受激發(fā)后在垂直激發(fā)光的方向上發(fā)出熒光，由光電倍增管接收放大

15、。433 示差折光檢測器 示差折光檢測器是通過連續(xù)地測定流出液的折光指數(shù)變化來測定樣品濃度，它的靈敏度與溶劑和溶質(zhì)的性質(zhì)有關，其響應信號由下式表示， R=Z（n-n0） （4-5）式中，Z為儀器常數(shù)，n為溶液的折射率，n0為溶劑的折射率。根據(jù)稀溶液中的相加定律，溶液的折射率等于溶劑和溶質(zhì)各自摩爾濃度之和， n=C0n0+Cini （4-6）Ci是溶質(zhì)的摩爾百分數(shù)，C0是溶劑的摩爾百分數(shù)，ni為溶質(zhì)的折射率。因為C0+Ci =1，所以， n=（1-Ci）n0+Cini = n0+Ci（ni - n0） 或， n-n0 = Ci（ni - n0） （4-7）即， R=Z Ci（ni - n0） （

16、4-8）R與溶質(zhì)的濃度成正比。由于ni - n0的差值較小，所以響應信號R的數(shù)值較小，即檢測靈敏度較低，但是只要有足夠的差值，就可以用這種檢測器進行檢測。434 電化學檢測器電化學檢測器是一種高靈敏度檢測器，線性范圍通常有4-5個數(shù)量級。它有電導、電勢、電流三種形式。電導記錄的是柱后流出物的電導變化，電流的檢測原理是當電活性物質(zhì)流經(jīng)電極表面時，在電極表面發(fā)生氧化還原反應，產(chǎn)生電流，經(jīng)放大后檢測記錄，得到色譜圖。電極表面的電子轉(zhuǎn)移所產(chǎn)生的電流符合法拉第定律， Q=nFN （4-9） i=nF（dN/dt） （4-10）或者， i=NFC1（1-C2/C1）FD （4-11）N為電活性物質(zhì)的摩爾數(shù)

17、，Q為電荷量，F(xiàn)D為流動相流速，C1、C2分別是進入電解池和流出電解池時電活性物質(zhì)的濃度。當C2/C1恒定時，電流與溶質(zhì)組分的濃度成正比。第四節(jié) 常用固定相 固定相也叫填料和吸附劑，多孔無定形硅膠是液相色譜的經(jīng)典填料。20世紀60年代中后期，發(fā)展了 薄殼形填料，1972年以后，出現(xiàn)的多孔微球硅膠，小粒徑減小了渦流效應，縮短了組分在兩相間的傳質(zhì)擴散過程，從而提高了色譜柱的分離效率。HPLC固定相主要以液固吸附、鍵合相和液液分配三種類型為主，固定相是色譜分離的心臟，是液相色譜技術的重要研究課題。441 液固吸附色譜固定相 液固色譜吸附劑按其性質(zhì)可分為極性和非極性兩種類型。極性吸附劑包括硅膠、氧化鋁

18、、分子篩、聚酰胺等?；钚蕴繉俜菢O性吸附劑。在炭上有較強保留的是高折光指數(shù)的化合物，包括分子量較高的同系物、芳香化合物以及含氯、硫、溴、碘原子的分子。 極性吸附劑可進一步分為酸性吸附劑和堿性吸附劑。酸性吸附劑包括硅膠、硅酸鎂，堿性吸附劑包括氧化鋁、氧化鎂、聚酰胺等。前者適合于分析堿性物質(zhì)如胺，后者適合于分析酸性物質(zhì)如酚、羧酸、吡咯衍生物。聚酰胺本身不是典型的多孔吸附劑，但是它對分離酚類和芳香族硝基化合物有較好的選擇性。氧化鋁對分離不飽和化合物（烯烴或芳烴）及相應的鹵代烴特別有效。盡管個別吸附劑對某些化合物具有特殊的選擇性，但是通用的仍然為硅膠。許多薄層色譜和經(jīng)典的柱色譜使用的就是硅膠。表面多孔型

19、硅膠的商品有Corasil（Waters 公司）、Zipax（Du Pont 公司）、Perisorb（E Merck 公司）等，全多孔微粒型硅膠的商品有Lichrosorb（E Merck 公司）、Zorbax（Du Pont 公司）、Porasil（Waters 公司）、Partisil（Whatman 公司）、Uitrasphere（Alltech）等。 硅膠的色譜保留特性取決于硅膠的表面特征。色譜級硅膠通常是由硅酸鈉與無機酸反應制備的。聚合的結果形成了三維空間排列的SiO4四面體。這種聚硅酸脫水時形成的多孔固體，表面的終端或是硅羥基（ºSi-OH）或是硅氧橋（ºSi

20、-O-Siº），見圖4-8。 H H H O O O O Si Si - O - Si Si O Si 游離型硅羥基 氫基化硅羥基 硅氧橋 圖4-8 硅膠的表面結構 值得提出的是，當采用有機溶劑作流動相時，少量水分或其它極性溶劑會使硅膠吸附固定相的活性大大降低。442 化學鍵合固定相 以微粒硅膠為基質(zhì)的化學鍵合固定相在HPLC中得到了最廣泛的應用。通過有機硅烷與硅膠表面的化學反應，形成了Si-O-Si-C鍵，它對溶劑、熱具有相當?shù)姆€(wěn)定性。椐統(tǒng)計，化學鍵合固定相色譜在HPLC中占80%，它是HPLC中最重要的一種類型。 要形成化學鍵合固定相，要滿足兩個條件，一是所用的材料有某種反應活性

21、，二是有機固定相表面應有易發(fā)生反應的官能團。自由型的硅膠對鍵合反應十分有利，實驗表明，硅膠在200度以前烘干僅能失去表面的物理吸附水分子，在200-600度之間，結合水（即羥基）逐漸脫除呈現(xiàn)硅氧橋結構，但硅膠骨架不變；600度以上，骨架開始發(fā)生變化。按照晶體點陣計算，硅膠表面的硅羥基密度為8個/nm2。用化學法測定的數(shù)值為5個/nm2，硅膠表面存在著足夠的活性羥基，加上它的機械強度高，孔結構和表面積易為人控制，良好的化學穩(wěn)定性，因而是理想的鍵合固定相基質(zhì)材料?；瘜W鍵合固定相有以下三大優(yōu)越性。 1. 減少了表面活性作用點，清除了某些可能的催化活性，減少表面的不可逆化學吸附幾率，使得操作步驟簡化，

22、峰形對稱，允許溶劑中有小量的變化。此外，溶劑的殘留效應小，梯度沖洗平衡快，和液固吸附色譜相比較，流動相性質(zhì)可以比較緩和，柱子不“嬌”。 2. 耐溶劑沖洗，這是傳統(tǒng)的液液分配色譜（LLC）逐漸被鍵合相色譜取代的根本原因。在近代液相色譜發(fā)展的初期，常和氣相色譜一樣把有限的幾種固定液，例如b,b氧二丙晴、聚乙二醇、三甲撐乙二醇和角鯊烷等涂漬在載體表面上，用一種性質(zhì)相差很大的溶劑沖洗，進行分離。實際上兩種完全互不相溶的溶劑體系幾乎不存在，因而在LLC中固定液的流失就十分嚴重。為了克服這個缺點，曾采取溶劑預先用固定液飽和及柱前增加預飽和柱的方法，但這樣做既不方便，柱系統(tǒng)的穩(wěn)定性也差。不可抽提的化學鍵合相

23、的出現(xiàn)使這個弊病得到克服，柱壽命大大延長，并且擴大了可應用溶劑的范圍。 3.表面改性靈活，容易獲得重復性的產(chǎn)品。改變鍵合用的硅烷，可以獲得不同的鍵合相填料，控制硅膠的質(zhì)量和鍵合工藝，可以獲得工業(yè)制備規(guī)模。根據(jù)鍵合有機基團的結構，分為以下鍵合固定相類型： 1. Si-O-Si鍵型（硅膠與醇類物質(zhì)反應） Si-OH + HO-R Si-OR + H2O 它的反應條件是在150-250度下反應3-8小時，它是HPLC早期的一種正相鍵合填料，國外的Durapak和天津試劑二廠的HDG系列就是這一種。 2. Si-N鍵型（硅膠與胺類物質(zhì)反應） Si-OH + SOCl2 Si-Cl + SO2 + HC

24、l Si-Cl +R-NH2 Si-NHR +HCl這種鍵型的穩(wěn)定性比前一種好。 3.Si-C鍵型（硅膠與鹵代烷反應） 利用格里亞反應合成固定相。Si-Cl +RXMg Si-R +MgXCl它的穩(wěn)定性也相當好，以上三種為刷型固定相。 4.Si-O-Si-C鍵型（硅膠與有機硅烷反應） 它是目前的主導鍵合類型，具有良好的熱、化學穩(wěn)定性，可在PH2-8的介質(zhì)中使用。 Si-OH +X-Si(R)(R1)(R2) Si-O- Si(R)(R1)(R2) +HX反應式中，X為Cl、CH3O或C2H5O，R1、R2可以與X相同，也可以是甲基。 反應體系中如果控制適量的水分，可能產(chǎn)生聚合型的鍵合固定相：

25、Si-O R Cl R Si-O R H2O O Si + Si O Si R Si-O OH Cl Cl Si-O O-Si-O O Si-OH Cl Si-O-Si（CH3）2-O-Si（CH3）2-Cl H2O O + Si（CH3）2 O Si-OH Cl Si-O-Si（CH3）2-O-Si（CH3）2-Cl R O Si -O-Si（CH3）2-O-Si（CH3）2-Si-O-Si-R RSCl3+H2O O O O Si -O-Si（CH3）2-O-Si（CH3）2-Si-O-Si-R R O有機硅烷的R是區(qū)分不同鍵合相分類的基礎，R可以是極性、非極性、離子交換基團等, 表4-3

26、是常用硅烷化試劑。表4-3 常用硅烷化試劑名稱分子式分子量沸點度/kPa備注三甲基氯硅烷（CH3）3SiCl108.757/101丁基二甲基氯硅烷C4H9（CH3）2SiCl150.7140/101C2反相辛基二甲基氯硅烷C8H17（CH3）2SiCl206.7105/3C8反相十八烷基二甲基氯硅烷C18H37（CH3）2SiCl346.7140-5/ 0.013C2反相苯基二甲基氯硅烷C6H5（CH3）2SiCl170.587/2.4二甲基二氯硅烷（CH3）2SiCl2129.170二丁基二氯硅烷（C4H9）2SiCl2213.2212辛基甲基二氯硅烷C8H17（CH3）SiCl2227.3

27、94/4.8十八烷基甲基二氯硅烷C18H37（CH3）SiCl2367.5185/0.35苯基甲基二氯硅烷C6H5（CH3）SiCl2191.1205甲基三氯硅烷（CH3）SiCl3149.066丁基三氯硅烷（C4H9）2SiCl3191.6142-3辛基三氯硅烷C8H17 SiCl3247.7224/97.3十八烷基三氯硅烷C18H37SiCl3388.0160-2/0.4苯基三氯硅烷C6H5 SiCl3211.6201環(huán)氧丙氧基丙基三乙氧基硅烷（C2H5O）3Si（CH3）2 O CH2（C2H3O）263.3260凝膠離子交換氰基乙基二甲基氯硅烷CNC2H4（CH3）2SiCl146.6

28、83/2.4氨丙基三乙氧基硅烷NH2（CH2）3Si（OC2H5）3221.4g-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷CH2C（CH3）COO（CH2）3 Si（OCH3）3248.3g-巰基丙基三乙氧基硅烷HS（CH2）3Si（OC2H5）3238.3親和六甲基二硅氮烷（CH3）3SiNHSi（CH3）3151.3 在制備鍵合固定相時，硅膠要進行酸處理，使硅氧橋斷開盡可能多的形成硅羥基，有利于反應進行。酸處理還可以除去表面的雜質(zhì)金屬離子。在200度下烘干后除去吸附水。反應時，一般用多量的硅烷化試劑。表4-4給出了十八烷基鍵合固定相的反應條件。表4-4 十八烷基鍵合固定相反應條件反應時間（h） 0.

29、8 2.5 5 6.5 18 24C（%）表面濃度（mmol/m2） 3.0 3.6 4.2 6.5 10.5 11 0.36 0.45 0.52 0.84 1.46 1.54反應溫度（度） 110 138 170反應溶劑C（%）反應時間（h） 甲苯 二甲苯 硅烷本身 10 15 23 18 15 2 ODS是HPLC中常用的色譜固定相。為獲得性能優(yōu)良的固定相，一是其粒徑分布要均勻狹窄，二是優(yōu)化鍵合條件，鍵合均勻，硅羥基被完全覆蓋。表4-6給出了常見的HPLC鍵合固定相。表4-6 常見HPLC鍵合固定相類型商品牌號官能團粒度備注弱極性中極性Lichrosorb DiolPolygosil-60

30、-D-N(CH3)2Nucleosil-N(CH3)2Polygosil-NO2Nucleosil-NO2RSIL NO2Nucleosil-OHSeparon Si CNPartisil 10-PACChromosorb LC-8Sepherisorb CNLiChrosorb CNRSIL CN二醇基三烷基胺三烷基胺硝基硝基硝基醇羥基乙基睛睛基氨CN丙基睛CN丙基睛105,105,105,105,105,105,7105,1055,105,105,10強極性化合物分離弱陰離子交換芳香化合物5% C水濕潤性能好氨基與睛基比例為1：1比表面為350m2/g比表面為220m2/g接上表類型商品牌

31、號官能團粒度um備注強極性非極性Nucleosil CNBondpark CNPolygosil CNAlltech CNZorbax CNCPS-HypersilSpheri-5-CyanoFinepak NH LiChrosorb NH2Nucleosil N H2Bondpark N H2Polygosil N H2Alltech N H2Zorbax N H2APS-HypersilSpheri-5- N H2Techsphere C22Finepak sil C18LiChrosorb RP-18Nucleosil C18Bondpark C18Polygosil C18Alltec

32、h C18Zorbax C18Partisil-ODS1Partisil-ODS2Partisil-ODS3Superisorb-ODSTechsphere LiChrosorb RP-8CNCNCNCNCN丙基睛丙基睛亞胺基氨基氨基氨基氨基氨基氨基氨基氨基C22C18C18C18C18C18C18C18C18C18C18C18C8C8101010101063,5,101010105,105,105,103,5,105,105,10105,105,105103,5,105101010105,105,1010單層鍵合8% C單層鍵合弱堿性10% C5% C22% C15% C10% C11% C

33、15% C5% C15% C10% C10% C13% C接上表類型商品牌號官能團粒度備注Polygosil C8Alltech C8Zorbax C8Nucleosil C8Zorbax TMSLiChrosorb RP-2RSIL C3Apex C2Techsil C2Spherisorb C6Hchrom C6Chromegabond C6Spherisorb PNucleosil PhenylRSIL PhenylBondapak PhenylC8C8C8C8三甲基C2C3C2C2C6C6C6苯基苯基苯基苯基3,5,7,101053,5,7,101010105,1055,10555105,101010% C15% C10% C7% C3% C10% C10% C10% C10% C 離子交換鍵合相是在有機硅烷的分子末端連上離子交換基團，通常為磺酸基、羧基、氨基、胺基等。分為強陰離