分子遺傳標(biāo)記

1、目 錄一、DNA 分子遺傳標(biāo)記技術(shù)簡(jiǎn)介二、DNA分子遺傳標(biāo)記鑒別的依據(jù)三、DNA分子遺傳標(biāo)記在生藥鑒定中的應(yīng)用四、DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)存在的問(wèn)題DNA 分子遺傳標(biāo)記技術(shù)簡(jiǎn)介DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)( 也稱DNA分子遺傳診斷技術(shù))是指通過(guò)直接分析遺傳物質(zhì)的多態(tài)性來(lái)診斷生物內(nèi)在基因排布規(guī)律及其外在性狀表現(xiàn)規(guī)律的技術(shù)。任何生物種或個(gè)體都具有特定的DNA 多態(tài)性，通過(guò)直接診斷分析DNA的多態(tài)性，便能避開(kāi)遺傳特性表現(xiàn)過(guò)程中的環(huán)境因素、數(shù)量性狀遺傳或部分與完全顯性的干擾，快速準(zhǔn)確地鑒定藥材。DNA 分子遺傳標(biāo)記技術(shù)分類Southern 雜交為基礎(chǔ)的雜交為基礎(chǔ)的DNA分子標(biāo)記技術(shù)分子標(biāo)記技術(shù)PCR 為基礎(chǔ)的

2、分子標(biāo)記技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)mRNA為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)重復(fù)序列為基礎(chǔ)的重復(fù)序列為基礎(chǔ)的DNA分子標(biāo)記技術(shù)分子標(biāo)記技術(shù)Southern 雜交為基礎(chǔ)的雜交為基礎(chǔ)的DNA分子標(biāo)記技術(shù)分子標(biāo)記技術(shù)限制性內(nèi)切酶切片斷長(zhǎng)度多態(tài)性，單鏈構(gòu)象多態(tài)性等技術(shù)。這一類技術(shù)的共同點(diǎn)是利用一種或幾種限制性內(nèi)切酶消化不同生物個(gè)體的DNA分子，再通過(guò)特異性的克隆或合成的探針進(jìn)行分子雜交來(lái)揭示其DNA 的多態(tài)性。PCR PCR 為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)，標(biāo)記位點(diǎn)測(cè)序(STS )，隨機(jī)引物PCR(RP-PCR)，任意引物PCR(AP-PCR) ;寡聚苷酸

3、引物PCR (OP- PCR) 等。這一類技術(shù)的共同特點(diǎn)是利用合成的隨機(jī)引物(常為510個(gè)或更多個(gè)寡聚核苷酸)，通過(guò)PCR擴(kuò)增不同生物個(gè)體的DNA分子，然后直接進(jìn)行電泳分析來(lái)揭示其DNA的多態(tài)性。重復(fù)序列為基礎(chǔ)的重復(fù)序列為基礎(chǔ)的DNA分子標(biāo)記技術(shù)分子標(biāo)記技術(shù)衛(wèi)星DNA(Satellite重復(fù)序列為幾百幾千個(gè)堿基對(duì))，微衛(wèi)星DNA (Microsatellite，重復(fù)序列單位為25個(gè)堿基對(duì))，小衛(wèi)星DNA (Minisatellite，重復(fù)單位為大于5 個(gè)堿基對(duì)) 等。mRNAmRNA為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)差異顯示( Differential Display ,DD)，逆轉(zhuǎn)錄P

4、CR(Revert Transcription PCR,RT-PCR)差異顯示逆轉(zhuǎn)錄PCR (Differential Display Revert Transcription PCR,DDRT-PCR)等二、DNA分子遺傳標(biāo)記鑒別的依據(jù)1.生藥鑒定研究首先要找到具有物種特異性的遺傳標(biāo)記，這種遺傳標(biāo)記主要有形態(tài)、組織細(xì)胞、化學(xué)成分、蛋白質(zhì)、染色體組型、血清學(xué)、同功酶等特征。然而有些特征為生物體的遺傳性和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，它們受到遺傳因素影響的同時(shí)，還與生物體的發(fā)育階段及環(huán)境條件對(duì)生物體的作用有關(guān)。DNA分子作為遺傳信息的直接載體，不受外界因素和生物體發(fā)育階段及器官組織差異的影響，任一體細(xì)

5、胞均含有相同的遺傳信息。因此，用DNA分子特征作為遺傳標(biāo)記進(jìn)行物種鑒別更加準(zhǔn)確可靠。二、DNA分子遺傳標(biāo)記鑒別的依據(jù)2.DNA分子是由A,T,C,G4種堿基構(gòu)成，遺傳上的差異便表現(xiàn)在這4種堿基排列順序的變化之中，這就是遺傳多樣性。比較物種間DNA分子的遺傳多樣性的差異來(lái)鑒別物種就是DNA分子遺傳標(biāo)記鑒別。在DNA分子上，有編碼與物種存活密切相關(guān)的基因區(qū)域、不十分密切相關(guān)的區(qū)域和非編碼區(qū)域?；蚪MDNA的這些不同區(qū)域在生物進(jìn)化過(guò)程中所受到的選擇壓力不同，前者所受選擇壓力大，表現(xiàn)出高度的保守，后者所受選擇壓力小，表現(xiàn)出較大的變異。正是由于這種DNA分子不同區(qū)域承受的選擇壓力不同，使得DNA分子的不

6、同區(qū)域有不同程度的遺傳多樣性。二、DNA分子遺傳標(biāo)記鑒別的依據(jù)3.DNA分子作為遺傳信息的載體具有較高的遺傳穩(wěn)定性，較蛋白質(zhì)、同功酶等還有較高的化學(xué)穩(wěn)定性。在陳舊標(biāo)本中所保存下來(lái)的DNA仍能夠用于DNA分子遺傳標(biāo)記的研究，由于DNA分子所載信息量巨大，并且相對(duì)穩(wěn)定，PCR技術(shù)具有高速、高效和特異性高等特點(diǎn)，因此用DNA分子遺傳標(biāo)記鑒別中藥材品種和對(duì)中藥復(fù)方制劑中組分的檢測(cè)具有快速、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。三、DNA分子遺傳標(biāo)記在生藥鑒定中的應(yīng)用1.生藥真?zhèn)舞b定是生藥學(xué)的重要組成部分對(duì)同屬不同種藥材鑒定及藥材真?zhèn)舞b定，保證中醫(yī)用藥的準(zhǔn)確性，維護(hù)人們身體健康具有重要意義。傳統(tǒng)的中藥鑒定主要

7、依靠顏色、形狀、氣味、味道和質(zhì)地等感性特征，這種鑒定方法的不足之處在于不準(zhǔn)確。利用DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)直接分析藥材的DNA多態(tài)性，找出真品特有的DNA片段，對(duì)此進(jìn)行測(cè)序，進(jìn)而制備DNA探針，來(lái)檢測(cè)相應(yīng)的藥材。是一種便捷、準(zhǔn)確的生藥鑒定方法。三、DNA分子遺傳標(biāo)記在生藥鑒定中的應(yīng)用2.在藥用植物親緣關(guān)系上的應(yīng)用肖培根院士建立了藥用植物親緣學(xué)，采用一些小分子化合物作為鑒定親緣關(guān)系的依據(jù)，由于DNA從本質(zhì)上反映了藥用植物的親緣關(guān)系。汪小全等用5個(gè)引物對(duì)升麻屬(cimicifugaL)的5個(gè)種和類葉升麻(Actaea asiatica Hara)及烏頭屬(Actinium)的一種進(jìn)行了RAPD分析，

8、分析的結(jié)果與經(jīng)典分類學(xué)的研究結(jié)果相吻合。三、DNA分子遺傳標(biāo)記在生藥鑒定中的應(yīng)用3.在藥用植物資源與生物多樣性保護(hù)上的應(yīng)用生物多樣性的研究可以看作是對(duì)生物在空間上存在的現(xiàn)狀和相互關(guān)系的研究，遺傳多樣性的研究是生物多樣性研究的中心環(huán)節(jié)。單純用形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)手段研究遺傳多樣性就失去了分辨能力，而分子生物學(xué)手段則使這些變化成為可能，從而針對(duì)性地制定有效的保護(hù)措施。DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)直接分析遺傳物質(zhì)DNA在不同生物個(gè)體間的差異，使植物分類和資源的研究更加科學(xué)化。三、DNA分子遺傳標(biāo)記在生藥鑒定中的應(yīng)用4.在藥用植物道地性研究上的應(yīng)用藥材道地性的原因就是植物的遺傳物質(zhì)DNA及初生和次生代謝過(guò)程中的酶

9、系統(tǒng)發(fā)生了“道地性”變化。道地性藥材與非道地性藥材畢竟同種，甚至同一亞種。二者在形態(tài)和生藥性狀等特征上，差別往往不明顯，給道地藥材的鑒別帶來(lái)了困難。采用DNA分子診斷技術(shù)并輔以等位酶技術(shù)，可以從分子水平上來(lái)揭示藥材的“道地性”。對(duì)藥材的“道地性”研究有重要意義。三、DNA分子遺傳標(biāo)記在生藥鑒定中的應(yīng)用5.在遺傳育種上的應(yīng)用藥用植物的“優(yōu)良品種”對(duì)藥材生產(chǎn)存在著巨大的潛力，“高含量育種”是藥用植物育種的主要目的和特色。遺傳圖譜是生物種類的分子檔案，對(duì)育種工作者有極大的參考價(jià)值。目前應(yīng)用RAPD技術(shù)已構(gòu)建了一些重要農(nóng)作物的遺傳圖譜。為藥材的開(kāi)發(fā)利用打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。四、DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)存在的問(wèn)題1.沒(méi)有構(gòu)建真正意義上的數(shù)據(jù)庫(kù)DNA分子遺傳標(biāo)記方法穩(wěn)定性受模板、擴(kuò)增條件的諸多因素的影響，沒(méi)有構(gòu)建真正意義上的數(shù)據(jù)庫(kù)。2.藥材處理由于分子標(biāo)記具有高度的靈敏性，藥材中任何生物源的污染，甚至人的觸摸都會(huì)留下外源DNA分子,這種DNA在PCR 擴(kuò)增過(guò)程中可以一同被擴(kuò)增，從而使得到的DNA指紋圖譜失真，因此實(shí)驗(yàn)中要避免二次污染。四、DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)存在的問(wèn)題3.提高穩(wěn)定性中藥材通常為動(dòng)植物的干燥體，均為陳舊標(biāo)本，這對(duì)大片段的DNA擴(kuò)增往往十分困難，而對(duì)小片段的DNA擴(kuò)增影響不大。此外，某些分子生物學(xué)方法本身的穩(wěn)定性問(wèn)題尚待進(jìn)一步提高。4.降低經(jīng)濟(jì)成本目前進(jìn)行分子