人類免疫缺陷病毒1型p24抗原

1、人類免疫缺陷病毒1型p24抗原酶聯(lián)免疫試劑盒說明書【產(chǎn)品名稱】通用名：人類免疫缺陷病毒1型p24抗原酶聯(lián)免疫試劑盒英文名：ENZYME IMMUNOASSAY FOR DETECTION OF HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS TYPE I P24 ANTIGEN IN HUMAN SERUM, PLASMA AND CELL CULTURE SUPERNATANT【包裝規(guī)格】96人份/盒?！绢A(yù)期用途】本試劑盒用于人類免疫缺陷病毒1型p24抗原（Human Immunodeficiency Virus Type 1 p24 Antigen）的定量檢測，適用于人血清（或血

2、漿）及細(xì)胞培養(yǎng)上清液等標(biāo)本，僅供研究使用。【檢驗原理】本產(chǎn)品采用固相酶聯(lián)免疫吸附分析法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）檢測人血清（或血漿）中的游離HIV-1 p24抗原和細(xì)胞培養(yǎng)上清液等標(biāo)本中的HIV-1 p24抗原。本分析方法是基于雙抗體夾心的非競爭性免疫分析。校準(zhǔn)品和樣品中HIV-1 p24抗原與固相抗- p24單克隆抗體和生物素標(biāo)記的抗-p24多克隆抗體通過免疫反應(yīng)，形成固相抗-p24單克隆抗體p24抗原抗-p24多克隆抗體-生物素復(fù)合物；溫育后洗滌，洗去非特異或多余的抗原和多余的生物素標(biāo)記的抗- p24多克隆抗體；然后加入HRP（Hor

3、seradish Peroxidase，辣根過氧化物酶）標(biāo)記的鏈親和素，形成固相抗- p24單克隆抗體p24抗原抗-p24多克隆抗體-生物素鏈親和素-HRP復(fù)合物；溫育后洗滌，洗去多余的HRP標(biāo)記的鏈親和素。加入TMB-H2O2底物溶液，HRP催化H2O2氧化TMB生成藍色的產(chǎn)物（最大吸收峰655nm），加入終止液終止酶催化反應(yīng)，生成黃色產(chǎn)物（最大吸收峰450nm）。其吸光度與校準(zhǔn)品和樣品中的HIV-1 p24抗原濃度成正相關(guān)。通過劑量反應(yīng)曲線可得出樣品中HIV-1 p24抗原濃度。試驗類型溫育時間試驗所需時間試驗溫度試驗所需樣本體積免疫度量分析120 分鐘大約150分鐘37°C 和

4、室溫（1830）75L反應(yīng)原理圖：MicrowellBiotinylated rabbit anti-HIV-1 p24 antibodiesMouse anti-HIV-1 p24 antibodiesSample HIV-1 p24 AntigenHRP Conjugated StreptavidinAbsorbanceSignal Reagent【主要組成成份】8 / 8文檔可自由編輯打印1. 抗體包被板（Antibody Coated Microplate）1塊包被有鼠抗-HIV-1 p24單克隆抗體的聚苯乙烯微孔板，約200ng/孔。8孔×12條。鋁箔袋密封包裝，含干燥劑。

5、標(biāo)簽編號為R1。2. HIV-1 p24抗原校準(zhǔn)品（HIV-1 p24 Antigen Calibrator）1mL×1支重組HIV-1 p24抗原溶液，200IU/mL（約相當(dāng)于4,000pg/mL），稀釋液為校準(zhǔn)品稀釋液。用英國國家生物標(biāo)準(zhǔn)與檢定所(National Institute for Biological Standards and Control, NIBSC)提供的WHO標(biāo)準(zhǔn)品（HIV-1 p24 Antigen 90/636）校準(zhǔn)。綠色PP蓋子和無色PP塑料管。標(biāo)簽編號為R2。3. 校準(zhǔn)品稀釋液（Calibrator Diluent）20mL×1瓶磷酸鹽

6、緩沖液，含動物血清和鈣化的正常人血漿（經(jīng)ELISA檢測，HBsAg、抗-HCV和抗-HIV 1+2均為陰性），pH約7.3。防腐劑為NaN3（不超過0.1%）和EDTA。綠色PP蓋子和無色HPDE塑料瓶。標(biāo)簽編號為R3。4. 生物素標(biāo)記抗體（Biotinylated Antibody）5mL×1瓶生物素標(biāo)記的兔抗-HIV-1 p24多克隆抗體，約4µg/mL。緩沖液為Tris-HCl，含動物血清、穩(wěn)定劑、表面活性劑和綠色染料，pH約7.4。防腐劑為NaN3（不超過0.1%）。藍色PP蓋子和無色HPDE塑料瓶。標(biāo)簽編號為R4。5. HRP標(biāo)記鏈親和素（HRP Conjugat

7、ed Streptavidin）20mL×1瓶HRP標(biāo)記鏈親和素，約0.1µg/mL（25mU/mL HRP）。緩沖液為Tris-HCl，含動物血清、穩(wěn)定劑、表面活性劑和紅色染料，pH約7.4。防腐劑為ProClin®300（不超過1%）。紅色PP蓋子和棕色HPDE塑料瓶。標(biāo)簽編號為R5。6. 濃縮洗滌液（Concentrated Wash Buffer）50mL×1瓶含表面活性劑的磷酸鹽緩沖液，20倍濃縮。防腐劑為ProClin®300（不超過1%）。無色PP蓋子和無色HPDE塑料瓶。標(biāo)簽編號為R6。7. 底物緩沖液（Substrate Bu

8、ffer）10mL×1瓶含H2O2的乙酸鹽緩沖液，pH約5.0。無色PP蓋子和無色HPDE塑料瓶。標(biāo)簽編號為R7。8. 顯色劑（Chromogen Solution）10mL×1瓶含TMB的乙酸溶液，pH約3.0。白色PP蓋子和棕色HPDE塑料瓶。標(biāo)簽編號為R8。9. 終止液（Stop Solution）10mL×1瓶2mol/L H2SO4溶液。黃色PP蓋子和無色HPDE塑料瓶。標(biāo)簽編號為R9。10. 封板膜（Plate Sealer）6張用于溫育時微孔板的密封。11. 說明書（Instruction for Use）1份本產(chǎn)品使用說明。【儲存條件及有效期】試劑

9、盒置28保存，有效期為12個月?！具m用儀器】酶標(biāo)儀、洗板機、恒溫培養(yǎng)箱等?！緲颖疽蟆?. 樣本：人血清（或血漿）樣本，和細(xì)胞培養(yǎng)上清液等標(biāo)本。2. 存放：樣本于28可儲存2天；樣本長期儲存應(yīng)放置于-20或-20以下環(huán)境中，且不宜反復(fù)凍融5次以上?！緳z驗方法】1. 試劑配制方法A、 HIV-1 p24校準(zhǔn)品系列的配制：取6支離心管，編號A、B、C、D、E和F。管F中取900µL校準(zhǔn)品稀釋液，加入100µL HIV-1 p24校準(zhǔn)品（200IU/mL，4,000pg/mL），混勻，作1:10稀釋，配制成校準(zhǔn)品F（20IU/mL，400pg/mL）；管E中取500µL

10、校準(zhǔn)品稀釋液，加入500µL校準(zhǔn)品F，混勻，作1:2稀釋，配制成校準(zhǔn)品E（10IU/mL，200pg/mL） ；管D中取500µL校準(zhǔn)品稀釋液，加入500µL校準(zhǔn)品E，混勻，作1:2稀釋，配制成校準(zhǔn)品D（5IU/mL，100pg/mL）；管C中取500µL校準(zhǔn)品稀釋液，加入500µL校準(zhǔn)品D，混勻，作1:2稀釋，配制成校準(zhǔn)品C（2.5IU/mL，50pg/mL）；管B中取500µL校準(zhǔn)品稀釋液，加入500µL校準(zhǔn)品C，混勻，作1:2稀釋，配制成校準(zhǔn)品B（1.25IU/mL，25pg/mL）；以校準(zhǔn)品稀釋液作為校準(zhǔn)品A。共配制

11、成6個濃度的HIV-1 p24校準(zhǔn)品系列（A-F）：A 0、B 1.25IU/mL（25pg/mL）、C 2.5IU/mL（50pg/mL）、D 5IU/mL（100pg/mL）、E 10IU/mL（200pg/mL）和 F 20IU/mL（400pg/mL）。配制好的HIV-1 p24校準(zhǔn)品系列應(yīng)保存在28°C，于一月內(nèi)使用。校準(zhǔn)品濃度離心管編號校準(zhǔn)品稀釋液加入20IU/mL（400pg/mL）F900µL100µL R210IU/mL（200pg/mL）E500µL500µL 管 F5IU/mL（100pg/mL）D500µL50

12、0µL 管E2.5IU/mL（50pg/mL）C500µL500µL 管D1.25IU/mL（25pg/mL）B500µL500µL 管CB、 工作濃度洗滌液的配制：用純水（蒸餾水或去離子水）將濃縮洗滌液稀釋20倍，即為工作濃度洗滌液。工作濃度洗滌液應(yīng)保存在28，于一月內(nèi)使用。2. 標(biāo)準(zhǔn)操作方法A、 從鋁箔袋中取出所需數(shù)量的微孔板條，裝至微孔板架上。設(shè)空白對照1孔，HIV-1 p24校準(zhǔn)品A、B、C、D、E和F各2孔，其余各孔為待測樣品，建議每個待測樣品均設(shè)置2孔；編號標(biāo)記。向各孔內(nèi)分別加入25L的生物素標(biāo)記抗體（空白對照孔不加），然后再向各孔

13、內(nèi)分別加入75L的HIV-1 p24校準(zhǔn)品或待測樣品，輕輕振蕩微孔板，使內(nèi)容物充分混勻。B、 用封板膜將微孔板密封，置37溫育60分鐘。C、 棄去微孔板反應(yīng)孔內(nèi)液體，每孔（含空白對照孔）加入350L工作濃度洗滌液，然后將洗滌液棄去。重復(fù)洗板共5次，最后拍干。D、 每孔加 HRP標(biāo)記鏈親和素100L（空白對照孔不加），用封板膜將微孔板密封，置37溫育30分鐘。E、 棄去微孔板反應(yīng)孔內(nèi)液體，每孔（含空白對照孔）加入350L工作濃度洗滌液，然后將洗滌液棄去。重復(fù)洗板共5次，最后拍干。F、 每孔加底物緩沖液和顯色劑各50L（含空白對照孔），用封板膜將微孔板密封，置室溫（1830）避光溫育30分鐘。G、

14、 每孔加終止液50L（含空白對照孔），輕輕振蕩微孔板，使內(nèi)容物充分混勻。H、 終止反應(yīng)后1小時內(nèi)，用酶標(biāo)儀在450nm波長處，測定各孔吸光度值，參考波長選擇620-700nm。3. 數(shù)據(jù)處理A、 求出HIV-1 p24抗原校準(zhǔn)品的吸光度平均值。B、 以HIV-1 p24抗原校準(zhǔn)品的吸光度平均值為縱軸，以HIV-1 p24校準(zhǔn)品的濃度為橫軸，在雙對數(shù)坐標(biāo)圖上作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。C、 如果待測樣品試驗了2孔，求出待測樣品的吸光度平均值。D、 將測得的樣品的吸光度值（或吸光度平均值）在上述標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出樣品中的HIV-1 p24抗原的濃度。也可以通過軟件用最小二乘法擬合曲線，求出樣品中的HIV-1 p24

15、抗原的濃度?！緳z驗結(jié)果的解釋】 1. 質(zhì)量控制：空白對照校準(zhǔn)品吸光度值不高于0.050，A點（0pg/mL）吸光度值不高于0.100，F(xiàn)點（400pg/mL）吸光度值不低于1.000。2. 對于吸光度值超出校準(zhǔn)品F點的樣品，可用校準(zhǔn)品稀釋液稀釋適宜倍數(shù)后再行測定，樣本中HIV-1 p24抗原濃度值為稀釋后測定值×稀釋倍數(shù)?！緳z驗方法的局限性】1. 本品僅適用于研究用途，不用于臨床診斷。2. 本品僅適用于游離的HIV-1 p24抗原含量的檢測，不能用于總抗原含量的檢測。3. 樣本pH應(yīng)保證在5-10之間，過低或過高的pH可能會造成HIV-1 p24抗原的測量值異常?！井a(chǎn)品性能指標(biāo)】1.

16、 測定范圍：0400pg/mL。2. 分析靈敏度：最低檢測限不高于5pg/mL。3. 校準(zhǔn)品劑量-反應(yīng)曲線的線性：線性相關(guān)系數(shù)R>0.9900。典型校準(zhǔn)曲線如下圖4. 精密性：批內(nèi)變異系數(shù)（Within-Run CV）不高于10%，批間變異系數(shù)（Between-Run CV）不高于15%。5. 特異性：與HIV-1和HIV-2的env蛋白、pol蛋白和gag蛋白中的p17（1型）等無交叉反應(yīng)。6. 膽紅素（Bilirubin，20mg/dL）、血紅蛋白（Hemoglobin，500mg/dL）和血脂（Triolein， 3,000mg/dL）對HIV-1 p24抗原的測量值無明顯干擾。7

17、. 抗凝劑（肝素0.2mg/mL、檸檬酸鈉100mg/mL和EDTA 20mg/mL）對HIV-1 p24抗原的測量值無明顯干擾?！咀⒁馐马棥?. 本品僅適用于研究用途。2. 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出，應(yīng)平衡至室溫（1830）后再使用。未用完的微孔條用自封袋密封保存。3. 儲存和溫育時應(yīng)避光進行。4. 不得直接用手接觸終止液。若不慎接觸則應(yīng)立即用大量自來水沖洗。5. 操作應(yīng)迅速，加樣品時間過長、洗滌后放置太久均可能影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。6. 每次測定均應(yīng)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。7. 操作應(yīng)按說明書嚴(yán)格進行。嚴(yán)格控制反應(yīng)溫度和時間，并盡量使用移液器加樣，結(jié)果判定以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)。8. 不同批號試劑請勿混用，不

18、要使用過期試劑。9. 本品含有部分動物源性物質(zhì)，操作必須符合國家有關(guān)傳染性疾病檢測的實驗室管理及安全的規(guī)定，并按有關(guān)實驗室規(guī)程處理所使用組份及樣品?！緟⒖嘉墨I】1. Allain, J.P., Laurian, Y., Paul, D.A., Verroust, F., Leuther, M., Gazengel, C., Senn, D., Larrieu, M.J. and Bosser, C. Long-term evaluation of HIV antigen and antibodies to p24 and gp41 in patients with hemophilia. Po

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