乳腺癌端粒酶活性與PCNA表達關系

1、乳腺癌端粒酶活性與PCNA表達關系【關鍵詞】 乳腺癌；端粒酶；增殖細胞核抗原；多聚酶鏈式反應；免疫組織化學摘要： 目的 探討端粒酶活性與增殖細胞核抗原(PCNA)表達之間的關系及聯(lián)合檢測對乳腺癌術后治療方案制定和預測預后的意義。方法 采用端粒重復序列擴增聚合酶鏈反應-酶聯(lián)免疫吸附測定法(TRAP-PCR-ELISA)和免疫組織化學鏈霉素生物蛋白過氧化物酶(S-P)法對80例乳腺癌組織、36例乳腺癌相應癌旁組織和10例乳腺良性病變的端粒酶活性及增殖細胞核抗原進行檢測。結果 (1)80例乳腺癌患者癌組織標本、36例乳腺癌相應癌旁組織標本中端粒酶表達陽性率分別為650%和83%，差異有統(tǒng)計學意義(P

2、<001)；10例乳腺良性病變組織標本中未檢測出端粒酶活性；腋窩淋巴結有無轉移與端粒酶陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義(P>005)。(2)80例乳腺癌組織中PCNA的陽性表達率為6375%；乳腺癌有淋巴結轉移組PCNA陽性表達率顯著高于無淋巴結轉移組(P<001)，且呈正相關(P<001)，即淋巴結轉移程度越低，PCNA陽性表達率亦越低。(3)端粒酶活性與PCNA表達具有一致性(P<001)，且呈正相關(P<001)，一致率為8625%。結論 端粒酶活性與PCNA表達具有一致性，端粒酶活性與PCNA聯(lián)合檢測，可為乳

3、腺癌術后治療方案的制定和預測預后提供輔助依據(jù)。1 / 11關鍵詞： 乳腺癌；端粒酶；增殖細胞核抗原；多聚酶鏈式反應；免疫組織化學Relationship between telomerase activation and PCNA expression in breast cancer Abstract： Objective To approach the interrelation between telomerase activation and PCNA expression in breast cancer and evaluate the significance of combin

4、ed detection in formulating therapeutic regimen after breast cancer operation.Methods The level of telomerase activation and PCNA expression were detected in 80 cases of breast cancer,36 cases of side-cancer tissues and 10 cases of lacteal gland benign lesion using TRAP-PCR-ELISA and S-P immunohisto

5、chemistry technique.Results (1)The positive rate of telomerase in 80 breast cancer tissues and 36 side-cancer tissues were 65.0% and 8.3% respectively and the difference revealed statistical significance(P<001),the telomerase activation was not examinated in 10 cases of lacteal gland benign l

6、esion;It is no significance in statistic that the level of positive rate of telomerase and the extent of axillary nodes metastasis(P>005).(2)Among 80 cases ,the positive rate of PCNA in breast cancer tissues was 63.75% and the positive rate of PCNA in group with lymphatic metastasis was signi

7、ficantly higher than that in group without lymphatic metastasis(P<001) and there was positive relationship between lymphatic metastasis and positive expression of PCNA(P<001).(3)The telomerase activation was in accordance with PCNA expression(P<001) and there was positive relati

8、onship between telomerase activation and PCNA(P<001),the concordance rate was 86.25%.Conclusion The telomerase activation is in accordance with PCNA expression,associating telomerase activation with PCNA detection can provide the ancillary evidence to predict the prognosis and to formulate th

9、e treatment plan after breast cancer operation.Key words： breast cancer;telomerase;proliferating cell nuclear antigen(PCNA);polymerase chain reaction(PCR);immunohistochemistry 增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)是一種表達細胞增殖周期的36kd多肽，直接參與細胞增殖過程中DNA的復制，其表達程度能客觀反映腫瘤細胞的增殖活性，過度表達增加了瘤細胞轉移趨勢的危險性，

10、PCNA可作為判斷腫瘤預后的指標1。為探索乳腺癌組織端粒酶活性與增殖細胞核抗原表達的關系，對80例乳腺癌組織、36例乳腺癌相應癌旁組織和10例乳腺良性病變的端粒酶活性及增殖細胞核抗原進行檢測。1 對象與方法11 對象 收集我院19922002年女性乳腺癌根治標本病理檢查存檔資料80例，乳腺癌相應癌旁組織(距離腫瘤2cm以上)36例，年齡3272歲，平均年齡4846歲；乳腺良性病變10例，平均年齡3850歲。全部資料經(jīng)2位病理醫(yī)師審核，患者術前未做過放、化療。乳腺癌分類根據(jù)“中國常見惡性腫瘤診治規(guī)范”分為非浸潤性癌、早期浸潤性癌、浸潤性特殊癌、浸潤性非特殊癌4類。12 試劑與儀器 端粒多聚酶鏈反

11、應-酶聯(lián)免疫吸附(Telomerase PCR ELISA)試劑盒(德國Boehringer Mannhein公司)；陽性對照為腫瘤293細胞株(檢測試劑盒提供)；陰性對照為不含蛋白的裂解液；抗PCNApc10和鏈霉素生物蛋白過氧化物酶(S-P)試劑盒及過氧化物酶底物作用液二氨基聯(lián)苯氨(Diaminobenzidine,DAB)(北京中山生物技術有限公司)；用已知乳腺癌組織陽性切片(北京中山生物技術有限公司)為陽性對照，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)代替抗做陰性對照。酶標儀(SPECTRA)(美國Dynex公司)PCR(T-1 thermobloc

12、k)(德國Biometra公司)。13 端粒酶活性檢測 (1)端粒酶提?。好糠輼吮居貌±砬衅瑱C切1015m厚50片，加入預冷的端粒酶裂解液20l，放置冰上裂解30min，1600r/min 4離心20min，取175l上清液為提取液，放置于-80冰箱中保存?zhèn)溆谩?2)端粒酶活性檢測：端粒重復序列擴增-多聚酶鏈反應-酶聯(lián)免疫吸附(TRAP-PCR-ELISA)法2，3，取細胞提取液12l加入25l端粒重復序列擴增-多聚酶鏈反應(TRAP PCR)擴增液；無菌二乙基焦碳酸酯(diethyprocarbonate,DEPC)水補足至體積50l混勻；在PCR擴增儀上按以下步驟進行引物的延伸及擴增反應：

13、95 5min預變性，再以94 30s變性、50 30s退火、72 90s延伸，共循環(huán)30個周期，最后72延伸10min。取上述PCR產(chǎn)物5l加變性試劑20l混勻，置室溫10min；加入雜交液225l混勻后取出100l移至包被于抗地高辛的酶標板中室溫作用2h；加入抗地高辛過氧化物酶并與底物作用30min后終止反應。用酶標儀測其在波長450nm的吸光度(A)值。14 PCNA檢測 采用免疫組織化學S-P法染色，按試劑盒說明書操作：所有標本均經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋，4m連續(xù)切片。二甲苯脫蠟，梯度酒精至水化后高壓鍋熱處理58min，過氧化物酶阻斷血清封閉，加抗60min，PBS液洗3次，每次

14、2min；抗15min，PBS液洗3次。每次2min；抗同抗。DAB顯色510min，蘇木素復染510s，脫水，透明膠封片。15 結果判斷 端粒酶以吸收度(A)>020為陽性判斷標準。PCNA以細胞核內(nèi)出現(xiàn)清晰的棕色或棕黃色顆粒為陽性診斷標準，每例切片至少觀察5個高倍視野。16 統(tǒng)計分析 采用SPSS100軟件對各組端粒酶及PCNA陽性表達率進行2檢驗，F(xiàn)isher確切概率檢驗和Kendall等級相關分析。2 結果21 各部位端粒酶活性表達及與淋巴結轉移的關系 80例乳腺癌患者癌組織標本端粒酶表達陽性率為650%(52/80)；36例乳腺癌相應癌旁組織標本端粒酶表達陽性率為83%

15、(3/36)；10例乳腺良性病變組織標本中未檢測出端粒酶活性。各部位端粒酶陽性表達率總體差異有統(tǒng)計學意義(P<001)，但進一步分析，癌組織與癌旁相應組織、癌組織與良性病變組織端粒酶陽性表達率差異有統(tǒng)計學意義(2=31975，P0001；2=15395，P0001)，而癌旁相應組織與良性病變組織端粒酶陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義(P>005)；端粒酶陽性表達率與部位呈正相關(rs=055,P<0001)。端粒酶陽性表達率與腋窩淋巴結轉移之間差異無統(tǒng)計學意義(2=2473，P>005)。表1 PCNA陽性表達率與乳腺癌組織類型及淋巴結轉移的關

16、系（略）注：* P<005,* P<001；rs Kendall等級相關系數(shù)22 PCNA與乳腺癌組織類型及淋巴結轉移的關系(表1) 在80例乳腺癌標本中，PCNA的陽性表達率為6375%(51/80)。其中有淋巴結轉移且PCNA陽性表達的為39例，無淋巴結轉移且PCNA陽性表達的為12例；有淋巴結轉移組PCNA陽性表達率顯著高于無淋巴結轉移組(P<001)，且呈正相關(P<001)，即淋巴結轉移程度越低，PCNA陽性表達率亦越低。組織類型與PCNA陽性表達率呈正相關(P<005)，即腫瘤惡性程度越高，PCNA陽性表達率亦越

17、高，但各組間差異無統(tǒng)計學意義(P>005)。23 PCNA表達和端粒酶活性之間的關系(表2) 端粒酶活性與PCNA表達具有一致性(2=3926，P<001)，且呈正相關(rs=0643,P<001)，即端粒酶活性陽性表達率高，PCNA陽性表達率亦高。一致率為8625%(46+23)/80。表2 PCNA表達和端粒酶活性之間的關系（略）3 討論研究表明，幾乎所有的永生細胞和絕大部分惡性腫瘤組織均有明顯的端粒酶活性，而正常細胞、部分良性腫瘤組織和非永生細胞系中則無或僅有極低的端粒酶活性4。本研究結果顯示，乳腺癌患者癌組織標本端粒酶陽性表達率顯著高于乳腺癌相

18、應癌旁組織和乳腺良性病變組織，而乳腺良性病變組織中無端粒酶活性的表達。端粒酶陽性表達與腋窩淋巴結轉移無關。上述結果與俞喬5報道一致。有文獻報道6，瘤細胞增殖活性高者，PCNA高表達，易發(fā)生淋巴結轉移，說明PCNA過度表達增加了瘤細胞轉移的危險性。本研究結果顯示，PCNA陽性表達率在乳腺癌淋巴結有轉移組與淋巴結無轉移組分別為750%和4286%，差異有統(tǒng)計學意義(P<001)；且PCNA陽性表達率與淋巴結轉移情況呈正相關(P<001)。PCNA陽性表達率與乳腺癌組織類型間雖呈一定的正相關(P<005)，但各組間PCNA陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義(P>005)，可能與本次研究樣本量較少有關。另外，本結果顯示，端粒酶活性與PCNA表達具有一致性且呈正相關，說明端粒酶活性陽性表達率高，PCNA陽性表達率亦高，2者具有協(xié)表達的關系，臨