丙型肝炎病毒核心抗原的轉(zhuǎn)位表達(dá)與肝癌細(xì)胞凋亡的關(guān)系

1、丙型肝炎病毒核心抗原的轉(zhuǎn)位表達(dá)與肝（癌）細(xì)胞凋亡的關(guān)系 【關(guān)鍵詞】 ,C型肝炎病毒屬 關(guān)鍵詞: C型肝炎病毒屬;癌，肝細(xì)胞;蛋白表達(dá) 摘 要:目的 探討丙型肝炎病毒核心抗原的轉(zhuǎn)位表達(dá)與肝（癌）細(xì)胞凋亡的關(guān)系及其意義. 方法 采用免疫組織化學(xué)方法檢測HCV核心區(qū)抗原和NS3區(qū)抗原在肝硬變（LC）和肝細(xì)胞肝癌（HCC）組織中的分布，同時(shí)對(duì)連續(xù)切片進(jìn)行原位凋亡檢測并計(jì)算凋亡指數(shù). 結(jié)果 HCV核心區(qū)抗原定位于肝細(xì)胞或肝癌細(xì)胞的胞質(zhì)或胞核中，在LC組織中，核心抗原呈彌漫或灶狀分布于肝細(xì)胞胞質(zhì)，偶見胞核陽性的肝細(xì)胞，陽性率為60.7%;核心抗原在癌組織中以核陽性分布為主，陽性率為37.6%，癌旁肝組織以

2、胞質(zhì)陽性為多見.HCC中HCV核心抗原的核陽性率（75.0%，15例/20例）明顯高于其在LC（17.7%，6例/34例）及癌旁肝組織（11.8%，2例/17例）中的陽性率（P<0.05）;在HCC中，HCV核心抗原核轉(zhuǎn)位表達(dá)的癌組織的AI值（0.174±0.093）顯著低于胞質(zhì)陽性的癌組織（0.512±0.113，P<0.01）.HCV NS3區(qū)抗原定位于肝細(xì)胞或肝癌細(xì)胞的胞質(zhì)中，在LC和HCC組織中的陽性率分別為53.6%和39.6%.未發(fā)現(xiàn)HCV NS3區(qū)抗原的表達(dá)與肝（癌）細(xì)胞凋亡的相關(guān)性. 結(jié)論 HCV感染與我國LC，HCC的發(fā)生關(guān)系密

3、切，HCV核心抗原在肝癌組織中常發(fā)生核轉(zhuǎn)位表達(dá)，這種核轉(zhuǎn)位表達(dá)抑制了腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而促進(jìn)腫瘤組織的進(jìn)一步惡化. 1 / 13 Keywords:hepatitis C-like virus;carcinoma，hepatocellular;protein expression Abstract:AIM To analyse expression of HCV core protein and apoptosis in formalin-fixed paraffin-embedded tissues of liver cirrhosis and hepatocellular carcino

4、ma.METHODS Immunohistochemistry method was used to show the dis-tributive pattern of HCV core and NS3antigen.Modified in situ end labeling（ISEL）was conducted on the serial sections.RESULTS Immunohistochemistry showed expression of HCV core protein in the liver cirrhosis of34/56cases and HCC of20/53c

5、ases.In liver cirrhosis and pericancerous tis-sues，the signals were mainly localized in the cytoplasm of hepatocytes.ISEL showed that only cells expressing core protein might initiated apoptosis.In cancerous tissues，translocated expression of HCV core protein was observed in the nuclei of tumor cell

6、s.According to ISEL on serial sec-tions，all these positive tumor cells hardly exhibited apoptosis（AI for nuclear positive，0.174vs AI for cytoplasmic posi-tive，0.152，P<0.01）.HCV NS3antigen was mainly dis-tributed in the cytoplasm of hepatocytes.We could hardly found the relationship between th

7、e expression of NS3and apoptosis in hepatocellular carcinoma.CONCLUSION HCV core protein may express in the nuclei of tumor cell.Translo-cated expression of HCV core protein may inhibit apoptosis in the tissue of hepatocellular carcinoma. 0 引言 自1989年Choo等克隆出丙型肝炎病毒（HCV）以來，各國學(xué)者從分子病理和免疫病理的角度尋找HCV與宿主相互作

8、用的關(guān)系，進(jìn)行HCV特異性抗原的表達(dá)與HCV相關(guān)性肝疾病之間關(guān)系的研究，證實(shí)HCV感染是肝硬變（LC）、肝細(xì)胞肝癌（HCC）發(fā)生的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素1 .肝（癌）細(xì)胞的凋亡與HCC的發(fā)生和發(fā)展有著密切的聯(lián)系.研究表明HCV的感染與肝（癌）細(xì)胞的凋亡有關(guān)2 .HCV核心區(qū)和NS3區(qū)基因編碼的蛋白具有較高的保守性.我們采用ABC法，對(duì)HCV核心區(qū)和NS3區(qū)抗原在LC，HCC組織中進(jìn)行定位研究，進(jìn)一步探討HCV與HCC發(fā)生的關(guān)系. 1 材料和方法 1.1 材料 均為我院1994/1996年外科手術(shù)切除標(biāo)本，其中LC56例，HCC53例，45例帶有癌旁肝組織.所有標(biāo)本經(jīng)100mL・

9、L-1 福爾馬林固定、脫水，常規(guī)石蠟包埋，制備5m厚連續(xù)切片，APES膠（Sigma，USA）對(duì)玻片進(jìn)行處理以防脫片.HCV核心區(qū)抗原2B株單克隆抗體由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所惠贈(zèng).HCV NS3區(qū)抗原單克隆抗體由北京醫(yī)科大學(xué)人民醫(yī)院肝病研究所惠贈(zèng). 1.2 方法 采用Vector Lab公司生產(chǎn)的ABC試劑盒對(duì)石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水后，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，根據(jù)操作手冊進(jìn)行，并做對(duì)照實(shí)驗(yàn).連續(xù)切片進(jìn)行HE染色.原位凋亡檢測技術(shù)采用武漢博士德公司生產(chǎn)的原位末端標(biāo)記試劑盒，根據(jù)操作手冊和已有文獻(xiàn)3進(jìn)行，顯微鏡觀察，對(duì)福爾馬林固定石蠟包埋的組織片采用蛋白酶K（20mg・L-1 ，

10、15min，RT）消化和微波預(yù)處理.陰性對(duì)照為省去末端標(biāo)記反應(yīng)液，陽性對(duì)照用0.5g・L-1 DNA酶I（Sigma，USA）預(yù)先處理組織.結(jié)果判定是以核陽性為判定標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)凋亡細(xì)胞的典型表現(xiàn):染色質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)顯著濃縮，染色質(zhì)聚集呈環(huán)狀或新月體狀，細(xì)胞質(zhì)的碎片合并有或沒有染色質(zhì)的濃縮，細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外染色質(zhì)碎片. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:隨機(jī)移動(dòng)組織片，選擇相鄰的幾個(gè)視野，計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞數(shù)作為凋亡指數(shù)（AI）.采用2 檢驗(yàn)和t檢驗(yàn). 2 結(jié)果 2.1 HCV NS3區(qū)抗原的分布特點(diǎn)和檢出率 應(yīng)用HCV NS3區(qū)抗原單克隆抗體檢測LC和HCC中的相應(yīng)抗原發(fā)現(xiàn):陽性信號(hào)見于肝

11、細(xì)胞和癌旁肝細(xì)胞的胞質(zhì)中，呈細(xì)顆粒狀均勻分布，而在HCC細(xì)胞中少有表達(dá).在LC及HCC組織中HCV的NS3區(qū)抗原的陽性率分別為53.6%（30例/56例）和39.6%（21例/53例）. 2.2 HCV核心抗原的分布特點(diǎn)和檢出率 應(yīng)用HCV核心區(qū)抗原2B株單克隆抗體檢測LC和HCC中的相應(yīng)抗原發(fā)現(xiàn):陽性信號(hào)見于肝細(xì)胞、HCC細(xì)胞的胞核或胞質(zhì)中，呈細(xì)顆粒狀均勻分布.在LC中，核心抗原以胞質(zhì)陽性為主，偶見胞核陽性細(xì)胞，分布多呈灶狀，匯管區(qū)小膽管上皮細(xì)胞偶可見陽性（Fig1）.在癌組織中，核心抗原以彌漫或灶狀核陽性分布 為多見，亦可見胞質(zhì)陽性的HCC細(xì)胞（Fig2）.癌旁組織為彌漫或灶狀分布的胞質(zhì)陽

12、性，分布類似于硬化組織（Fig3）.在LC及HCC組織中HCV核心抗原的陽性率分別為60.7%（34例/56例）和37.6%（20例/53例）.與NS3區(qū)抗原相比，核心抗原在HCC的癌組織中陽性率顯著增加（37.7%vs7.5%，P<0.05），而在癌旁肝組織和肝硬化組織中的陽性率無顯著性差異（Tab1）.2 檢驗(yàn)表明，HCC組織中的核心抗原的核陽性率（75.0%，15例/20例）明顯高于其在LC（17.7%，6例/34例）及癌旁肝組織（11.8%，2例/17例）中的陽性率（P<0.05）. 表1 HCV核心抗原和NS3區(qū)抗原在LC，HCC中表達(dá)的陽性率略 2.3

13、LC和HCC中凋亡細(xì)胞的特征及AI 結(jié)果顯示，陽性信號(hào)為藍(lán)紫色顆粒，位于胞核，呈小圓形或環(huán)行.有些陽性細(xì)胞見于肝竇中，大約10m左右的小圓形顆粒，其形態(tài)難與淋巴細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞區(qū)分.在LC中，陽性細(xì)胞在小葉內(nèi)多為散在分布于小葉周邊，靠近匯管區(qū)居多（Fig4）.而在癌組織中，既有散在分布的又有成簇分布的陽性細(xì)胞（Fig5）.在癌旁肝組織中陽性信號(hào)較前者少見.連續(xù)切片染色發(fā)現(xiàn)，在LC中，HCV核心抗原陽性的細(xì)胞部分發(fā)生了凋亡，并且AI明顯高于HCV陰性者（0.973±0.210vs0.439±0.172，P<0.05）.比較HCV核心抗原陽性的HCC及其癌

14、旁肝組織的凋亡指數(shù)，t檢驗(yàn)顯示，HCV核心抗原核心核轉(zhuǎn)位表達(dá)的癌組織的AI值（0.174±0.093）顯著低于胞質(zhì)陽性的癌組織（0.512±0.113，P<0.01），而癌旁組織的AI無顯著差異（0.418±0.191vs0.506±0.113，P>0.05），提示HCV核心抗原的核轉(zhuǎn)位表達(dá)抑制了腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)一步惡化.HCV NS3區(qū)抗原的表達(dá)與AI之間未發(fā)現(xiàn)顯著的相關(guān)性. 3 討論 大量的流行病學(xué)研究表明，HCV與LC，HCC的關(guān)系非常密切，至少50%的感染者發(fā)展為慢性肝炎，約10%20%最終發(fā)展為LC

15、，甚至HCC4 .應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法對(duì)HCV相關(guān)抗原進(jìn)行檢測，可為其提供直接的證據(jù).我們用HCV核心抗原和NS3區(qū)抗原的抗體檢測HCV RNA表達(dá)產(chǎn)物的分布情況，發(fā)現(xiàn)HCV感染與LC，HCC的發(fā)生關(guān)系密切，有較高的檢出率，分別為LC為60.7%和53.6%，HCC為37.6%和39.6%.結(jié)果顯示，HCV核心抗原有胞質(zhì)表達(dá)陽性，也有胞核陽性，且在癌細(xì)胞中的胞核陽性率明顯高于其在LC與癌旁組織中的核陽性率.目前逐漸有關(guān)于核心抗原核表達(dá)陽性的報(bào)道.Suzuki等5 認(rèn)為HCV核心抗原的核表達(dá)與HCV核心剪切蛋白的形成有關(guān).他提出假說即表達(dá)全長cDNA的HCV的核心蛋白（Mr2200）定位于胞質(zhì)是

16、由于在C末端功能域中存在錨著序列，它可使HCV核心蛋白錨著在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，而當(dāng)C末端功能域受到細(xì)胞或病毒蛋白酶的編輯處理后，核心蛋白會(huì)轉(zhuǎn)位到核內(nèi).并且發(fā)現(xiàn)PRRGPR（3843殘基）的序列作為核定位信號(hào)起著重要的作用，這一序列在各種HCV株中都非常保守6 .另有研究表明HCV核心蛋白可能是一種基因調(diào)節(jié)蛋白5 .HCV可能通過其表達(dá)的蛋白產(chǎn)物間接致癌.認(rèn)為HCV通過表達(dá)某種調(diào)節(jié)蛋白來影響肝細(xì)胞基因組的表達(dá)調(diào)控，從而向惡性發(fā)展. 圖1 圖5 略 目前，HCV核心抗原在HCC細(xì)胞中的核轉(zhuǎn)位表達(dá)，越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的重視，推測它可能在HCC的發(fā)病機(jī)制中起一定的作用.有研究表明，HCV核心蛋白可在轉(zhuǎn)錄水

17、平調(diào)節(jié)多種原癌基因及病毒基因的表達(dá).針對(duì)HCV核心蛋白與Fas系統(tǒng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的關(guān)系的研究，提示在慢性肝炎和LC中，HCV核心蛋白可能在肝細(xì)胞凋亡中起著重要的促進(jìn)作用7 .而最近有文獻(xiàn)報(bào)道，HCV核心蛋白能夠抑制某些細(xì)胞發(fā)生凋亡8 ，并可與ras協(xié)同作用促進(jìn)大鼠胚胎纖維母細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化9 .我們的研究結(jié)果顯示，在硬變肝組織中HCV核心蛋白的表達(dá)與肝細(xì)胞的凋亡有關(guān).而在癌組織中出現(xiàn)的核心蛋白的轉(zhuǎn)位表達(dá)，又抑制了陽性細(xì)胞發(fā)生凋亡.HCV核心蛋白在細(xì)胞凋亡中表現(xiàn)的這種不一致性使我們推測HCV在慢性肝炎的進(jìn)展過程中為了阻礙宿主細(xì)胞的防御功能，逐漸具備了擾亂宿主細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制的能力，即由誘導(dǎo)轉(zhuǎn)位抑制細(xì)

18、胞發(fā)生凋亡，并促進(jìn)宿主細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致HCC的發(fā)生.因此研究HCV核心蛋白對(duì)多種凋亡相關(guān)基因的調(diào)控作用就顯得十分重要.HCV與細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制的研究目前尚屬少見.因此，以HCV核心蛋白為研究的突破口，探索其在HCV致病和致癌機(jī)制中的確切作用，并進(jìn)而為研究針對(duì)HCC的防止措施提供重要的理論和臨床依據(jù). 參考文獻(xiàn): 1Urdea MS，Wuestehube LJ，Laurenson PM，Wilber JC.Hep- atitis C diagnosis and monitoring J.Clin Chem，1997;43（8）:1507-1511. 2Higaki K，Yao H，Koj

19、iro M.Fas antigen expression and its re-lationship with apoptosis in human hepatocellular carcinoma and non cancerous tissues J.Am J Pathol，1996;149（2）:429-437. 3Li J，Wang WL，Li YS，Liu B.TUNEL assay of apoptosis in human hepatocellular carcinoma under laser confocal microscope J.Di-si Junyi Daxue Xu

20、ebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（2）:102-105. 4Hino K，Higashi T，Nouso K，Nakatsukasa H，Tsuji T.Apop-tosis and proliferation of human hepatocellular carcinoma J.Liver，1996;16（1）:123-129. 5Suzuki T，Matsura Y，Harada T，Ando A，Chiba J，Harada S，Saito I，Miymura T.Nuclear localization of the truncated hep-atitis C virus core protein with its hydrophobic C-terminus delet-