乳腺癌組織中BRMS1mRNA表達(dá)及意義

1、乳腺癌組織中BRMS1mRNA表達(dá)及意義 作者：張英蘭，魏 讓，劉秀英，閻建文，王麗霞，石紅梅【摘要】 目的探討B(tài)RMS1mRNA在乳腺癌中的表達(dá)及其與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系。方法 采用Trizol提取組織總RNA，將mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA，用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RFQ-PCR）技術(shù)檢測乳腺組織BRMS1mRNA表達(dá)，以BRMS1mRNA和GAPDHmRNA含量的比值表示BRMS1表達(dá)水平。結(jié)果 乳腺癌組織中BRMS1mRNA的表達(dá)水平明顯低于癌旁組織（P0.01），也明顯低于正常乳腺組織（P0.01），BRMR1mRNA低表達(dá)與臨床病理分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P0.05，P0.01），

2、而與患者年齡、癌腫大小、病理類型無關(guān)（P0.05）。結(jié)論 乳腺癌組織中BRMS1mRNA的低表達(dá)與乳腺癌的發(fā)展與轉(zhuǎn)移有關(guān)，可能成為判斷乳腺癌轉(zhuǎn)移的一個(gè)標(biāo)志物。 【關(guān)鍵詞】 乳腺腫瘤BRMS1mRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCRExpression of BRMS1mRNA in Breast Carcinoma and Its Clinical Significance Abstract: Purpose To investigate BRMS1 gene expression in breast cancer and its clinical significance. Methods Total R

3、NA was extracted with Trizol. mRNA was transcribed reversely into cDNA. BRMS1 was detected with RFQ-PCR. BRMS1 gene expression were presented as the ratios of BRMS1mRNA to GAPDHmRNA. Results BRMS1 expression in cancer tissue was significantly lower than that in para-cancerous tissue and in normal ti

4、ssue（P0.01).BRMS1 low expression was related to clinico-pathologic stage and lymph node metastases (P0.05,P0.01,respectively), but not related to age,tumor size and pathologic type (P0.05). Conclusion BRMS1 low expression is related to the progression and metastasis of breast cancer, it might be ser

5、ved as a marker for breast cancer metastasis.2 / 12 Key words: breast neoplasms; BRMS1mRNA; RFQ-PCR 乳腺癌是常見的惡性腫瘤之一，容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，判斷有無轉(zhuǎn)移對臨床治療、判斷預(yù)后有重要意義。乳腺癌轉(zhuǎn)移抑制基因(breast cancer metastasis suppressor1，BRMS1）是新近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)乳腺癌腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，定位于人染色體11q13.113.21。將其轉(zhuǎn)染到乳腺癌細(xì)胞株MDA?鄄MB?鄄435和MDA?鄄MB?鄄231中，可降低其轉(zhuǎn)移潛能2。目前有關(guān)BRMS1基因的研究仍停

6、留在體外研究水平上。我們采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對乳腺癌組織進(jìn)行BRMS1mRNA檢測，探討乳腺癌轉(zhuǎn)移的細(xì)胞特征及轉(zhuǎn)移檢測指標(biāo)的應(yīng)用價(jià)值。 1 材料與方法 1.1 一般資料 2003年3月2005年4月，我院收治的乳腺癌患者51例，年齡31歲62歲，平均年齡43.5歲，其中浸潤性導(dǎo)管癌23例，單純癌14例，腺癌4例，黏液腺癌2例，乳腺癌有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的35例，未轉(zhuǎn)移16例；乳腺良性疾病25例，年齡26歲55歲，平均39.2歲，其中纖維瘤18例，小葉增生病4例，導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤3例?；颊咝g(shù)前均未進(jìn)行放療及化療。 1.2 標(biāo)本收集 對每例乳腺癌手術(shù)患者均取癌組織及癌旁組織，并取25例乳腺良性疾病病變

7、組織周圍的正常組織作為對照，取材后立即用錫紙包裹并標(biāo)記好，放入液氮中保存?zhèn)溆谩?1.3 定量測定BRMS1mRNA 表達(dá) 1.3.1 主要儀器 ABI PRISM 7000熒光定量PCR分析儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司），核酸測定儀：Biophotometer (Eppendorf公司)。 1.3.2 主要試劑 Trizol RNA提取試劑盒，M?鄄MLVcDNA 合成試劑盒， PCR反應(yīng)試劑，RNase?鄄free試劑，以上試劑由上海生工提供，BRMS1及3?鄄磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）RT引物，熒光定量PCR引物，熒光探針及用來制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的人工合成BRMS1及GAPDH cDNA均購自上

8、海基康生物技術(shù)有限公司。 1.3.3 引物序列 BRMS1上游引物： 5?鄄GACCGCCAGAGCCTGGA?鄄3，下游引物：5?鄄CTGCCTCTGGCGTGCAGT?鄄3，熒光探針：5?鄄FAM?鄄CAGCTCTGAATGGTGG?鄄MGB?鄄3。GAPDH上游引物： 5?鄄CCATCAATGACCCCTTCATTG?鄄3，下游引物： 5?鄄CATGGGTGGAATCATATTGGAAC?鄄3，熒光探針：5?鄄VIC?鄄CCTCAACTACATGGTTTAC?鄄MGB?鄄3。 1.3.4 實(shí)驗(yàn)步驟 （1）RNA提取:Trizol法提取組織總RNA，核酸蛋白紫外分析儀檢測RNA質(zhì)量和濃度。

9、 （2）RT反應(yīng):用M?鄄MLVcDNA試劑盒進(jìn)行RT反應(yīng)，取總RNA 2g，加0.5g/l oligo?鄄dT引物 1l，用RNase?鄄free水定容12l,5×RT buffer 4l，20U/l RNase Inhibitor 1l ，10mmol/L dNTPs 2l， 20U/l M?鄄MLV 反轉(zhuǎn)錄酶1l，終體積20l。37 60min， 70 10min 反應(yīng)結(jié)束，-20保存。 （3）定量PCR: 20l反應(yīng)體系，內(nèi)含BRMS1或GAPDH cDNA模板2l（陰性對照以蒸餾水代替），10×buffer 2l，10mmol/L dNTPs 1l，25 mmol

10、/L MgCl2 2l，10mol/L BRMS1或GAPDH上下游引物各2.5l，5mol/L BRMS1或GAPDH熒光探針1l， Tag DNA 聚合酶（含UNG）1l，蒸餾水6l。反應(yīng)條件：50 2min 激活UNG，95 預(yù)變性2min，94 15s，60 60s，40個(gè)循環(huán)。 1.4 結(jié)果計(jì)算 根據(jù)熒光定量PCR的反應(yīng)曲線判斷標(biāo)本達(dá)到循環(huán)閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)（cycle of threshold，Ct），Ct與該標(biāo)本起始濃度的對數(shù)存在線性關(guān)系，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出BRMS1mRNA及 GPDAHmRNA含量，兩者比值即為BRMS1相對表達(dá)量。 1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS10.0軟件進(jìn)行

11、統(tǒng)計(jì)分析，組間比較用t檢驗(yàn)。 2 結(jié) 果 2.1 BRMS1mRNA在乳腺癌組織中的表達(dá) 乳腺癌組織為0.85±0.42，癌旁組織為1.23±0.36，正常組織為1.39±0.41，乳腺癌組織中BRMS1mRNA表達(dá)顯著低于正常乳腺組織（P0.01），也顯著低于癌旁組織（P0.01）。 2.2 BRMS1mRNA表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系 見表1。BRMS1mRNA的低表達(dá)與TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P0.05，P0.01），而與患者年齡、腫瘤大小、病理類型無關(guān)（P0.05）。 3 討 論 在腫瘤發(fā)生至轉(zhuǎn)移的演進(jìn)過程中存在大量遺傳學(xué)改變，這種細(xì)胞本身的DNA發(fā)生變化

12、構(gòu)成了腫瘤轉(zhuǎn)移的分子基礎(chǔ)，1996年，Phillips KK等發(fā)現(xiàn)將11號染色體導(dǎo)入乳腺癌細(xì)胞株MDA?鄄MB?鄄435，則此細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力顯著降低，而不影響其致瘤性3，說明有一個(gè)或多個(gè)腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因定位于人11號染色體上。2000年，Seraj MJ等1 用差異顯示反轉(zhuǎn)錄PCR及染色體定位技術(shù)將此基因克隆并定位于染色體 11q13.1q13.2，命名為 BRMS1。核酸序列分析證明BRMS1與其它基因無同源性，是一個(gè)新的基因，它編碼一個(gè)有246個(gè)氨基酸、分子量約28 500道爾頓的新的蛋白質(zhì)。研究表明具有高度轉(zhuǎn)移潛能的惡性腫瘤細(xì)胞，一般表現(xiàn)為BRMS1表達(dá)降低成缺失，將BRMS1轉(zhuǎn)染到這些

13、細(xì)胞中，可抑制其轉(zhuǎn)移潛能，Samant 等4將BRMS1cDNA轉(zhuǎn)染到乳腺癌細(xì)胞株MDA?鄄MB?鄄435和 MDA?鄄MB?鄄231后其生長和局部浸潤影響不大，但癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能明顯降低，再將此兩種細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染BRMS1的細(xì)胞分別注入小鼠乳腺組織中，兩組比較，轉(zhuǎn)染BRMS1的細(xì)胞可在局部生長形成腫瘤，但很少發(fā)生肺轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，說明BRMS1可以抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移。 以上結(jié)論均來自細(xì)胞株及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，BRMS1在乳腺組織中表達(dá)情況如何未見報(bào)道。本研究結(jié)果表明：在人乳腺癌組織中，BRMS1mRNA表達(dá)降低，BRMS1mRNA的低表達(dá)與患者年齡、腫瘤大小、病理類型無關(guān)，而與TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，

14、說明BRMS1基因在腫瘤轉(zhuǎn)移中起抑制作用，提示癌組織中BRMS1mRNA水平可作為監(jiān)測腫瘤轉(zhuǎn)移的一個(gè)指標(biāo)，為乳腺癌的綜合治療及預(yù)后判斷提供了依據(jù)。目前乳腺癌是否轉(zhuǎn)移一般由病理結(jié)果判斷，而淋巴結(jié)陰性乳腺癌患者中仍有約30%發(fā)生轉(zhuǎn)移，組織中BRMS1mRNA水平能否作為乳腺癌微轉(zhuǎn)移的標(biāo)志還有待于進(jìn)一步試驗(yàn)及對術(shù)后患者的觀察隨訪。 雖然BRMS1基因的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制作用被證實(shí)，但其作用機(jī)制仍不十分清楚， BRMS1抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制可能與細(xì)胞間縫隙連接、信號傳導(dǎo)有關(guān)。Saunders等5將BRMS1cDNA轉(zhuǎn)染到乳腺癌細(xì)胞系MDA?鄄MB?鄄435中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染BRMS1基因后恢復(fù)了縫隙連接蛋白亞基C

15、X43的表達(dá)，恢復(fù)的縫隙連接表型與正常乳腺細(xì)胞相似，說明BRMS1基因使CX43表達(dá)上調(diào)，恢復(fù)癌細(xì)胞與正常組織細(xì)胞間縫隙連接及信號傳導(dǎo)，抑制癌細(xì)胞脫離原發(fā)灶而發(fā)生轉(zhuǎn)移。免疫共沉淀和酵母雙雜交試驗(yàn)顯示，BRMS1能與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤結(jié)合蛋白1（RBP1）及mSin3組蛋白脫乙?；笍?fù)合體相互作用，抑制轉(zhuǎn)錄過程6。惡性腫瘤轉(zhuǎn)移過程中基因表達(dá)下調(diào)或缺失一般有幾個(gè)原因：基因突變、雜合性缺失、甲基化等，BRMS1基因表達(dá)下調(diào)或缺失是哪種原因引起，還有待進(jìn)一步研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Seraj MJ, Samant RS, Verderame MF, et al. Functional evidence f

16、or a novel human breast carcinoma metastasis suppressor, BRMS1, encoded at chromosome 11q13J. Cancer Res,2000, 60:2764-2769. 2 Samant RS,Debies MT, Shevde LA,et al. Identification and characterization of the murine ortholog(brms1) of breast cancer metastasis suppressor 1(BRMS1)J. Int J Cancer, 2002,

17、 97:15-20.3 Phillips KK, Welch DR, Miele ME, et al. Suppression of MDA?鄄MB?鄄435 breast carcinoma cell metastasis following the introduction of human chromosome 11J. Cancer Res,1996, 56:1222-1226.4 Samant RS,Seraj MJ,Saunder MM,et al. Analysis of mechanisms underlying BRMS1 suppression of metastasisJ. Clin Exp Metastasis, 2000,18:689-693.5 Saunders MM,Seraj MJ,Li Z,et al. Breast Cancer metastatic potential correlates with a breakdown in homospecific and heterospecific gap junctional intercellular communicationJ. C