蛋白質(zhì)高效液相色譜技術(shù)

1、編輯ppt高效液相色譜法在蛋白質(zhì)高效液相色譜法在蛋白質(zhì)分離中的應(yīng)用分離中的應(yīng)用陳陳 檬檬 S S10306241030624張雙張雙健健 S S10306211030621郭傳龍郭傳龍 S S10306221030622石晨陽石晨陽 S S10306231030623汪菊芬汪菊芬 S S10306251030625編輯ppt高效液相色譜技術(shù)特點概述1HPLC系統(tǒng)各組分介紹；2流動相的要求及準(zhǔn)備過程354HPLC色譜技術(shù)與其他技術(shù)聯(lián)用5HPLC 應(yīng)用舉例6現(xiàn)狀與展望6編輯ppt應(yīng)用應(yīng)用范圍廣范圍廣高靈高靈敏度敏度高效高效高壓高壓分析速分析速度快度快編輯ppt根據(jù)分離機理蛋白質(zhì)HPLC又可分為12

2、43高效凝膠過濾色譜高效凝膠過濾色譜(HPSEC)高效離子交換色譜（高效離子交換色譜（HPIEC）高效親和色譜（高效親和色譜（HPAFC）反向高效液相色譜（反向高效液相色譜（RP-HPLC）編輯ppt高效液相色譜儀編輯ppt常用的HPLC儀 Waters公司 Agilent公司 島津公司等編輯ppt一一 進樣系統(tǒng)進樣系統(tǒng)進樣方式隔膜進樣 *閥進樣 自動進樣 停流進樣 編輯ppt六通閥進樣六通閥進樣 高效液相色譜系統(tǒng)中最理想的進樣器，它是由圓形密封墊(轉(zhuǎn)子)和固定底座(定子)組成。美國Rheodyne公司的六通閥進樣器最為通用，各大HPLC儀器制造商均以此產(chǎn)品作為儀器的進樣器。 上上樣樣分分析析

3、編輯ppt 廢液廢液樣品樣品 淋洗液淋洗液 至分離柱至分離柱進樣閥進樣閥 樣品樣品 廢液廢液 淋洗液淋洗液至分離柱至分離柱 （）（）（）（） 樣品環(huán)樣品環(huán)編輯ppt進樣方式進樣方式 部分裝液法部分裝液法 進樣量應(yīng)不大于定量環(huán)體積的50%（最多75），并要求每次進樣體積準(zhǔn)確、相同 。 缺點是易產(chǎn)生由進樣引起的峰展寬 完全裝液法完全裝液法 進樣量應(yīng)不小于定量環(huán)體積的510倍（最少3倍），這樣才能完全置換定量環(huán)內(nèi)的流動相，消除管壁效應(yīng)，確保進樣的準(zhǔn)確度及重復(fù)性 編輯ppt二二 輸液系統(tǒng)輸液系統(tǒng)在線脫氣裝置梯度儀高壓輸液泵輸液系統(tǒng)編輯ppt高壓輸液泵高壓輸液泵 輸液泵是HPLC系統(tǒng)中最重要的部件之一。

4、其作用是將流動相以穩(wěn)定的流速或壓力輸入到色譜系統(tǒng)。泵的性能好壞直接影響到整個系統(tǒng)的質(zhì)量和分析結(jié)果的可靠性 。流量穩(wěn)定 流量范圍寬 輸出壓力高 液缸容積小 密封性能好，耐腐蝕 編輯ppt 柱塞往復(fù)柱塞往復(fù)泵泵流量不受柱阻影響流量不受柱阻影響泵壓可達泵壓可達400kg/400kg/cm2輸出的脈沖性較大，現(xiàn)多采用雙泵輸出的脈沖性較大，現(xiàn)多采用雙泵系統(tǒng)來克服系統(tǒng)來克服液缸容積小，可至液缸容積小，可至0.1ml0.1ml，因此易于，因此易于清洗更換流動相，特別適合再循環(huán)和清洗更換流動相，特別適合再循環(huán)和梯度洗脫梯度洗脫編輯ppt三三 分離系統(tǒng)分離系統(tǒng)分離系統(tǒng)*色譜柱連接管恒溫器 編輯ppt色譜柱 柱效

5、高 選擇性好 分析速度快編輯ppt進入色譜柱樣品的處理編輯ppt柱的使用和維護注意事項柱的使用和維護注意事項 色譜柱的正確使用和維護十分重要，稍有不慎就色譜柱的正確使用和維護十分重要，稍有不慎就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。 避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。 應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成 。 一般說來色譜柱不能反沖 ，會迅速降低柱效。 編輯ppt 選擇使用適宜的流動相（尤其是pH），以避免固定相被破壞。 需要對樣品進行預(yù)處理或者在進樣器和色譜柱之間連接一保護柱。 經(jīng)常用強溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。 柱的使用和維護注意事項柱的使用和維護注意事項編

6、輯ppt四四 檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng)編輯ppt要求要求靈敏度高靈敏度高 噪音低噪音低 適用范適用范圍廣圍廣重復(fù)重復(fù)性好性好 編輯pptUV 檢測器檢測器編輯ppt數(shù)據(jù)處理和計算機控制系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理和計算機控制系統(tǒng)恒溫裝置恒溫裝置 在在HPLCHPLC儀中色譜柱及某些檢測器都要求能準(zhǔn)儀中色譜柱及某些檢測器都要求能準(zhǔn)確地控制工作環(huán)境溫度，柱子的恒溫精度要求在確地控制工作環(huán)境溫度，柱子的恒溫精度要求在0.10.50.10.5之間，檢測器的恒溫要求則更高。之間，檢測器的恒溫要求則更高。采集采集處理處理分析分析數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)控制控制儀器儀器色譜色譜系統(tǒng)系統(tǒng)優(yōu)化優(yōu)化編輯ppt流動相的要求流動相的要求反相色譜流動相以水作

7、為基礎(chǔ)溶劑，再加入反相色譜流動相以水作為基礎(chǔ)溶劑，再加入一定量的能與水互溶的非極性調(diào)整劑，常用一定量的能與水互溶的非極性調(diào)整劑，常用的是甲醇和乙腈。一般情況下甲醇的是甲醇和乙腈。一般情況下甲醇-水已經(jīng)能水已經(jīng)能夠滿足多種樣品的分離，粘度小，價格低。夠滿足多種樣品的分離，粘度小，價格低。但推薦乙腈但推薦乙腈-水做初始實驗，與甲醇比，乙腈水做初始實驗，與甲醇比，乙腈的溶劑強度高粘度小，并可滿足的溶劑強度高粘度小，并可滿足185-205nm處檢測的要求。處檢測的要求。與檢測器與檢測器相適應(yīng)相適應(yīng)溶劑的溶劑的純度純度 粘度小粘度小 沸點低固體沸點低固體殘留物少殘留物少 與色譜系與色譜系統(tǒng)相適應(yīng)統(tǒng)相適應(yīng)

8、編輯ppt流動相的準(zhǔn)備調(diào)整PH根據(jù)所分離蛋白質(zhì)及色譜柱決定流動相脫氣濾膜過濾目前實驗室主要用的是超聲15min左右溶劑使用前都必須經(jīng)0.45m濾膜過濾，以除去雜質(zhì)微粒。分清有機相濾膜和水相濾膜，對于混合流動相，在混合前過濾編輯ppt合適的合適的波長波長合適的合適的柱溫柱溫蛋白樣品蛋白樣品的性質(zhì)的性質(zhì)編輯pptCEMSUF CECEMSHPLC編輯ppt高效液相色譜高效液相色譜質(zhì)譜質(zhì)譜 蛋白質(zhì)組學(xué)和蛋白質(zhì)酶譜研究的重要手段，通過質(zhì)譜可以實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的自動分離檢測。高效液相色譜高效液相色譜毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳 當(dāng)毛細(xì)管電泳與HPLC聯(lián)用時，兩者各自優(yōu)勢都得以發(fā)揮。HPLCCE聯(lián)用技術(shù)特別適合細(xì)胞或組織中蛋白質(zhì)的分離 編輯ppt反相高效液相色譜法對血清中胰島素的測定色譜柱流動相梯度洗脫其他C5 柱(100 mm*4.6mm5m，Ph-enomenex公司，美國A 相: 10mmol/L Tris緩沖液(pH 8.5) ; B相:乙腈;流速: 1mL/min B相體積分?jǐn)?shù)變化為:015 min, 15%25.5% ; 1521 min, 25.5%。進樣量20L柱溫25 編輯ppt編輯ppt高效液相色