單克隆抗體制備最新版本

1、編輯ppt單克隆抗體制備單克隆抗體制備Monoclonal antibody 單個單個B淋巴細胞克隆所產生的針對同一個淋巴細胞克隆所產生的針對同一個 抗抗原決定簇的抗體。分三個階段：原決定簇的抗體。分三個階段：（1）免疫）免疫Balb/c小鼠小鼠（2）建立篩選方法和程序）建立篩選方法和程序（3）雜交瘤的生成）雜交瘤的生成編輯ppt一、動物免疫一、動物免疫1 Balb/c小鼠小鼠6-8周齡，周齡，25g左右，雌性較佳左右，雌性較佳2 免疫方法免疫方法（1）首次腹腔免疫）首次腹腔免疫0.5 ml抗原與福氏完全佐劑抗原與福氏完全佐劑 1：1的混和液，一般的混和液，一般2-3只鼠只鼠（2）30天后加強

2、免疫，用福氏不完全佐劑天后加強免疫，用福氏不完全佐劑編輯ppt（3）15天后，尾靜脈注射天后，尾靜脈注射0.1mL水劑抗原，免疫水劑抗原，免疫 3天后，去脾臟融合天后，去脾臟融合 對于抗原性弱的抗原，可增加免疫次數，具體對于抗原性弱的抗原，可增加免疫次數，具體 程序依抗原性質而定。程序依抗原性質而定。編輯ppt可溶性蛋白（提取或表達的蛋白）可溶性蛋白（提取或表達的蛋白） 50-100g顆粒性蛋白（病毒）顆粒性蛋白（病毒） 50-100g細菌細菌 106CFU活細胞活細胞 （哺乳動物細胞）（哺乳動物細胞） 105-7CFU活癌源細胞活癌源細胞 104-6CFU糖類（多糖、糖蛋白）糖類（多糖、糖蛋

3、白） 100-200g核酸核酸 100-200g編輯ppt1 在液氮罐中取保存的在液氮罐中取保存的SP2/0細胞，以細胞，以 MEM培養(yǎng)基復蘇，培養(yǎng)基復蘇，37 CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 在對數生長期收獲在對數生長期收獲107-108CFU的的 SP2/0細胞細胞3 500 g離心離心5min，棄上清，棄上清4 輕輕振動離心管以松動細胞，重懸于輕輕振動離心管以松動細胞，重懸于20 mL MEM營養(yǎng)液中營養(yǎng)液中二、骨髓瘤細胞的培養(yǎng)二、骨髓瘤細胞的培養(yǎng)編輯ppt注意要點：注意要點：1 如細胞外觀不健康，或生長密度不好，應如細胞外觀不健康，或生長密度不好，應檢測是否檢測是否 有支原體污染有

4、支原體污染2 一次用一個凍存管里的細胞融合，應避免一次用一個凍存管里的細胞融合，應避免長期培養(yǎng)長期培養(yǎng)3 融合的細胞要處于對數生長期融合的細胞要處于對數生長期編輯ppt三、飼養(yǎng)細胞的制備三、飼養(yǎng)細胞的制備1 取清潔級取清潔級ICR小鼠小鼠2只，斷頸椎殺死小鼠，置只，斷頸椎殺死小鼠，置 70%酒精溶液中浸泡酒精溶液中浸泡10min2 將小鼠四肢固定，腹部朝上將小鼠四肢固定，腹部朝上3 在生物安全柜內，無菌打開小鼠腹部皮膚在生物安全柜內，無菌打開小鼠腹部皮膚4 用用20mL注射器吸取注射器吸取15mLMEM營養(yǎng)液，注入營養(yǎng)液，注入小鼠腹腔小鼠腹腔編輯ppt5 輕輕擠壓小鼠腹腔，并用注射器來回抽吸幾

5、輕輕擠壓小鼠腹腔，并用注射器來回抽吸幾 次，次， 將小鼠腹腔內的巨噬細胞吸出，置細胞將小鼠腹腔內的巨噬細胞吸出，置細胞 瓶內待用瓶內待用6 將飼養(yǎng)細胞轉至將飼養(yǎng)細胞轉至50mL離心管內，離心管內，500g離心離心 5min，以，以HAT培養(yǎng)基重懸細胞，轉至細胞培培養(yǎng)基重懸細胞，轉至細胞培 養(yǎng)瓶內待用養(yǎng)瓶內待用編輯ppt注意事項：注意事項：1 嚴禁用燃燒的棉球對小鼠消毒嚴禁用燃燒的棉球對小鼠消毒2 吸取腹腔飼養(yǎng)細胞時，不能將腸道刺破，否吸取腹腔飼養(yǎng)細胞時，不能將腸道刺破，否 則會造成污染則會造成污染3 如腹腔里的脂肪塊堵塞針頭，應調整針頭的如腹腔里的脂肪塊堵塞針頭，應調整針頭的 位置，重新吸取細

6、胞液位置，重新吸取細胞液編輯ppt四、脾細胞的制備四、脾細胞的制備1 取取Balb/c小鼠小鼠2只，斷頸椎殺死小鼠，置只，斷頸椎殺死小鼠，置 70%酒精溶液中浸泡酒精溶液中浸泡10min2 將小鼠四肢固定，腹部朝上將小鼠四肢固定，腹部朝上3 在生物安全柜內，無菌打開小鼠腹腔在生物安全柜內，無菌打開小鼠腹腔4 小心分離出脾臟，置含有小心分離出脾臟，置含有7mLMEM營養(yǎng)液的培營養(yǎng)液的培 養(yǎng)皿內養(yǎng)皿內編輯ppt5 用針頭刺破脾臟，并用彎針頭擠壓脾臟，將脾用針頭刺破脾臟，并用彎針頭擠壓脾臟，將脾 細胞分離出來細胞分離出來6 用吸管吹打細胞團塊，將細胞懸液吸置用吸管吹打細胞團塊，將細胞懸液吸置50mL

7、離離 心管中，沉降心管中，沉降5min7 將細胞懸液吸置另外一支離心管中，將細胞懸液吸置另外一支離心管中，500g離心離心 5min，棄上清，沉淀以，棄上清，沉淀以20mL MEM培養(yǎng)基重懸培養(yǎng)基重懸編輯ppt注意事項：注意事項：1 嚴禁用燃燒的棉球對小鼠消毒嚴禁用燃燒的棉球對小鼠消毒2 取脾臟時，如果脾臟被脂肪粘連，需小心，取脾臟時，如果脾臟被脂肪粘連，需小心， 不能撕裂或撕碎脾臟，更不能將腸道撕破不能撕裂或撕碎脾臟，更不能將腸道撕破3 如果脾臟沒用腫脹，表明免疫效果不好，如果脾臟沒用腫脹，表明免疫效果不好， 應選用備用小鼠的脾臟應選用備用小鼠的脾臟編輯ppt五、細胞融合及培養(yǎng)五、細胞融合及

8、培養(yǎng)1 以以2：1混合脾臟細胞和混合脾臟細胞和SP2/0細胞，加至細細胞，加至細 胞融合管中胞融合管中2 在室溫下在室溫下500g離心離心10min，棄上清，棄上清3輕輕振動離心管以松動和混合細胞，后置輕輕振動離心管以松動和混合細胞，后置 37水浴水浴4 在在60S內用巴氏吸管將內用巴氏吸管將0.8mL預熱至預熱至37 PEG1500緩慢加至細胞內，并輕輕抽吸兩次緩慢加至細胞內，并輕輕抽吸兩次編輯ppt5 在在90S內，用移液管輕輕將內，用移液管輕輕將30mL預熱至預熱至37的的MEM培養(yǎng)基加至融合管中培養(yǎng)基加至融合管中37水浴水浴5min室溫下室溫下500g離心離心10min，棄上清，棄上清

9、6 在融合管內加入在融合管內加入HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)基20mL，將沉，將沉淀懸浮，后移置淀懸浮，后移置250mL的玻璃瓶中，并加的玻璃瓶中，并加入入HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)基30mL，后加入，后加入10-15mL飼飼養(yǎng)細胞懸液養(yǎng)細胞懸液編輯ppt9 將細胞懸液加至將細胞懸液加至96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔孔細胞培養(yǎng)板中，每孔2- 3滴，約滴，約0.1-0.15mL10 將細胞培養(yǎng)板置將細胞培養(yǎng)板置37 飽和濕度的飽和濕度的CO2 培養(yǎng)培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)箱中培養(yǎng)11 培養(yǎng)培養(yǎng)3天后可取出細胞板在倒置顯微鏡下觀天后可取出細胞板在倒置顯微鏡下觀 察細胞融合情況察細胞融合情況編輯ppt12 培養(yǎng)置第培養(yǎng)置第5天時用天時用

10、HAT培養(yǎng)基換液，換培養(yǎng)基換液，換1/213 7-8天用天用HT培養(yǎng)基換液，全部換液培養(yǎng)基換液，全部換液14 10-14天后，雜交瘤細胞占孔底天后，雜交瘤細胞占孔底1/3以上，以上， 細胞上清變黃，可以檢測融合細胞上清里細胞上清變黃，可以檢測融合細胞上清里 的抗體。的抗體。編輯ppt注意事項：注意事項：1 脾臟細胞與脾臟細胞與SP2/0細胞的比例在細胞的比例在2：1 5：1最好最好2 細胞融合是關鍵步驟，避免用力吸打細胞融合是關鍵步驟，避免用力吸打3 細胞融合后細胞融合后3天要注意檢查是否污染，包括天要注意檢查是否污染，包括 細菌和真菌，一發(fā)現污染，要盡快棄去細菌和真菌，一發(fā)現污染，要盡快棄去

11、4 換液時不要影響孔底的雜交瘤細胞，不要吸換液時不要影響孔底的雜交瘤細胞，不要吸出或沖散出或沖散編輯ppt六、雜交瘤細胞的篩選六、雜交瘤細胞的篩選 大約有大約有10%的雜交瘤細胞能分泌抗體，而的雜交瘤細胞能分泌抗體，而分泌特異性抗體的雜交瘤細胞更少，故需要篩分泌特異性抗體的雜交瘤細胞更少，故需要篩選。篩選抗體分泌細胞有多種方法，如選。篩選抗體分泌細胞有多種方法，如HA-HI、IFA、ELISA等。其中間接等。其中間接ELISA應用最廣。應用最廣。編輯ppt注意事項：注意事項：1 因單抗是鼠源的，故酶標記抗抗體常用酶標因單抗是鼠源的，故酶標記抗抗體常用酶標羊抗鼠或兔抗鼠抗體，包括抗羊抗鼠或兔抗鼠

12、抗體，包括抗IgG、IgM的抗的抗體。如體。如 單用酶標記抗單用酶標記抗IgG抗體，則抗體，則IgM類單抗類單抗就不能被篩選出來。就不能被篩選出來。2 陽性克隆轉移到陽性克隆轉移到24孔細胞培養(yǎng)板中，細胞長孔細胞培養(yǎng)板中，細胞長滿后，上清再檢測一次滿后，上清再檢測一次3 篩選方法應在細胞融合前建立好，一部篩選篩選方法應在細胞融合前建立好，一部篩選特異單抗的方法最好特異單抗的方法最好編輯ppt七、雜交瘤細胞克隆七、雜交瘤細胞克隆 在分泌特異性單抗的雜交瘤細胞中，可能混在分泌特異性單抗的雜交瘤細胞中，可能混有不分泌單抗的細胞克隆；另外分泌單抗的克隆有不分泌單抗的細胞克?。涣硗夥置趩慰沟目寺≡诔醮?/p>

13、穩(wěn)定，有一部分細胞染色體常丟失，為在初代不穩(wěn)定，有一部分細胞染色體常丟失，為了防止不分泌抗體的細胞過度生長，在早期應對了防止不分泌抗體的細胞過度生長，在早期應對細胞進行克隆。常用有限稀釋法，一般來說，雜細胞進行克隆。常用有限稀釋法，一般來說，雜交瘤經過交瘤經過3-4次克隆后就穩(wěn)定了。次克隆后就穩(wěn)定了。編輯ppt1 在克隆的前一天，準備數塊含有在克隆的前一天，準備數塊含有0.1mL飼飼養(yǎng)細胞的養(yǎng)細胞的96孔板孔板2 將將24孔板里的待克隆細胞懸浮，取孔板里的待克隆細胞懸浮，取0.1mL細胞懸液加入細胞懸液加入0.9mL臺盼藍染色液，混勻臺盼藍染色液，混勻3 血液計數板計數血液計數板計數4 在在2

14、4孔培養(yǎng)板上，對待克隆細胞懸液進行孔培養(yǎng)板上，對待克隆細胞懸液進行10倍比稀釋倍比稀釋編輯ppt5 當稀釋至當稀釋至100CFU/mL時，取時，取1mL細胞懸液至細胞懸液至裝有裝有10mLHT培養(yǎng)基的瓶中，再分別加至培養(yǎng)基的瓶中，再分別加至96孔板孔板中（預先加有飼養(yǎng)細胞），中（預先加有飼養(yǎng)細胞），0.1mL/孔孔6將細胞培養(yǎng)板置將細胞培養(yǎng)板置37 飽和濕度的飽和濕度的CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)箱中培養(yǎng)培養(yǎng)10天左右，注意觀察天左右，注意觀察7 大約大約3-4天在倒置顯微鏡下可見細胞克隆，天在倒置顯微鏡下可見細胞克隆，5-7天換液一次，天換液一次，8 10天左右克隆長滿，可以檢測上清天左右克隆長滿，

15、可以檢測上清編輯ppt注意事項：注意事項：1 上清液要在上清液要在24 h內測定內測定2 細胞計數時只計活細胞（淡藍色），死細胞細胞計數時只計活細胞（淡藍色），死細胞為深藍色，且沒有光澤為深藍色，且沒有光澤3 如有高質量的如有高質量的FCS，可不用飼養(yǎng)細胞，可不用飼養(yǎng)細胞4 一個克隆需亞克隆一個克隆需亞克隆3-4次，才穩(wěn)定次，才穩(wěn)定5 如有孔污染，可向感染孔及臨近孔滴加如有孔污染，可向感染孔及臨近孔滴加1mol/mL的的Cu SO4溶液溶液編輯ppt七、實驗室規(guī)?？贵w制備七、實驗室規(guī)模抗體制備體外上清液培養(yǎng)體外上清液培養(yǎng)1 雜交瘤細胞先在雜交瘤細胞先在25mL 的細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)瓶中

16、培養(yǎng)2 細胞長滿瓶底后轉至細胞長滿瓶底后轉至50或或100mL的細胞培的細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)養(yǎng)瓶中培養(yǎng)3 當細胞液變黃后，收集上清液，再加新鮮的當細胞液變黃后，收集上清液，再加新鮮的培養(yǎng)液，并重復收集上清培養(yǎng)液，并重復收集上清2次次4讓細胞長至飽和狀態(tài)，直至死亡，并收集上讓細胞長至飽和狀態(tài)，直至死亡，并收集上清清編輯ppt體內生產腹水體內生產腹水1 正常培養(yǎng)雜交瘤細胞正常培養(yǎng)雜交瘤細胞2 飼養(yǎng)飼養(yǎng)Balb/c小鼠，注射細胞一周前通過腹腔小鼠，注射細胞一周前通過腹腔注射注射0.5mL降植烷降植烷3 在細胞對數生長期收獲細胞，并進行計數，在細胞對數生長期收獲細胞，并進行計數，將細胞數量以培養(yǎng)液調整至（將細胞數量以培養(yǎng)液調整至（2-10）107CFU4 小鼠腹腔注射小鼠腹腔注射0.5mL細胞懸液，細胞懸液，1-2周后發(fā)周后發(fā)展成癌性腹水展成癌性腹水編輯ppt5 用注射器收集腹水，用注射器收集腹水，3-4天收集一次，每只鼠天收集一次，每只鼠 可收集可收集2-3次次6 腹水腹水5000g離心離心10min，收集澄清的上清，收集澄清的上清， 除去油脂除去油脂7 加入加入0.05%的疊氮鈉，小量分裝保存。長期的疊氮鈉，小量分裝保存。長期