揚(yáng)州大學(xué)基因工程期末試題復(fù)習(xí)要點(diǎn)整理

1、基因工程期末試題 復(fù)習(xí)要點(diǎn)整理基因工程是 70 年代出現(xiàn)的一門(mén)科學(xué)，是生物學(xué)最具生命力和最引人注目的前沿 科學(xué)之一，是現(xiàn)代生物技術(shù)的代表，是生命科學(xué)類(lèi)專(zhuān)業(yè)中的一門(mén)重要的專(zhuān)業(yè)課。 本課程主要介紹基因工程概述、 重組DNA基本技術(shù)及原理、基因克隆、基因的分 離及鑒定、基因工程的表達(dá)系統(tǒng)、基因工程的應(yīng)用等。通過(guò)本課程的學(xué)習(xí)，使學(xué) 生掌握基因工程技術(shù)的基本原理和了解該技術(shù)在動(dòng)物、 植物和微生物等方面的應(yīng) 用，為今后從事生物學(xué)教學(xué)、 生物技術(shù)研究和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)， 或進(jìn)一步的研究生學(xué)習(xí) 科研打下堅(jiān)實(shí)的理論及專(zhuān)業(yè)基礎(chǔ)。 揚(yáng)州大學(xué)試題紙一、名詞解釋?zhuān)汗?10題，每題 2 分，共 20分。1基因：是DNA分子中含有

2、特定遺傳信息的一段核苷酸序列，是遺傳物質(zhì)的最 小功能單位。2. 定位克隆 ： 獲取基因在染色體上的位置信息，然后采用各種方法對(duì)該基因進(jìn) 行定位和克隆3. 融合基因：是指應(yīng)用DNA體外重組技術(shù)構(gòu)建的一類(lèi)具有來(lái)自兩個(gè)或兩個(gè)以上 的不同基因核苷酸序列的新型基因。4. 轉(zhuǎn)化子：導(dǎo)入外源DNA后獲得了新遺傳標(biāo)志的細(xì)菌細(xì)胞或其他受體細(xì)胞，又 稱重組體。5. 人工接頭：是人工合成的具有一個(gè)或數(shù)個(gè)特定限制性內(nèi)切酶識(shí)別和切割序列 的雙股平端DNA短序列。6. RT-PCR:是指以mRN在反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA第一鏈為模板進(jìn)行的PCR7. ORF :起始于AUG止于UAA UGA UAG勺連續(xù)的密碼子區(qū)域，是

3、潛在的編 碼區(qū)。8. MCS： 指載體上人工合成的含有緊密排列的多種限制核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)的DNA片段。9. gene targeting :基因工程中利用活細(xì)胞染色體 DNA可與外源DNA的同源性DNA序列發(fā)生重組的性質(zhì)，來(lái)進(jìn)行定點(diǎn)修飾改造染色體上某一目的基因的技術(shù)10. 5 ' RACE:是一種通過(guò)PCR進(jìn)行cDNA末端快速克隆的技術(shù)，是以 mRN的模 板反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈后用PCR技術(shù)擴(kuò)增出某個(gè)特異位點(diǎn)到5'端之間未知序 列的方法。四、簡(jiǎn)答題：共 4 題，共 20 分。1簡(jiǎn)述獲得目的基因常用的幾種方法。（ 5分）答：（1）直接從染色體DNA中分離：（1分） 僅適用于

4、原核生物、葉綠體和線粒體基因的分離，較少采用。（ 2）人工合成：（ 1 分）根據(jù)已知多肽鏈的氨基酸順序， 利用遺傳密碼表推定其核苷酸順序再進(jìn)行人工合 成。適應(yīng)于編碼小分子多肽的基因。（3）從 mRN合成 cDNA （1 分）采用一定的方法釣取特定基因的 mRNA再通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成其互補(bǔ) DNA（cDNA，除去RNA鏈后，再用DNA聚合酶合成其互補(bǔ)DNAg，從而得到雙鏈 DNA這一方法通常可得到可表達(dá)的完整基因。（4）利用PCF合成：（1分） 如已知目的基因兩端的序列，則可采用聚合酶鏈反應(yīng) （polymerase chain reaction,PCR） 技術(shù)，在體外合成目的基因。（5）從基因

5、文庫(kù)中篩選：（ 1 分）首先建立基因組或cDNA文庫(kù)，利用探針從文庫(kù)中篩選目的克隆。2. 分子克隆載體應(yīng)具備哪些特點(diǎn)？（ 4分）答：（1）在宿主細(xì)胞內(nèi)必須能夠自主復(fù)制（ 1 分）必須具備合適的酶切位點(diǎn)，供外源DNA片段插入，同時(shí)不影響其復(fù)制（1 分）（3）有一定的選擇標(biāo)記，用于篩選（ 1 分）（4）具有較高的拷貝數(shù)，便于載體的制備（ 1 分）3. cDNA文庫(kù)和基因組文庫(kù)的主要差別有哪些？ （5分）答：（1）基因組文庫(kù)克隆的是任何基因，包括未知功能的 DNA序列；cDNA文庫(kù)克隆 的是具有蛋白質(zhì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)基因，包括調(diào)節(jié)基因。（ 2分）(2) 基因組文庫(kù)克隆的是全部遺傳信息，不受時(shí)空影響；cDN

6、A文庫(kù)克隆的是不 完全的編碼DNA序列，因它受發(fā)育和調(diào)控因子的影響。(1分)(3) 基因組文庫(kù)中的編碼基因是真實(shí)基因，含有內(nèi)含子和外顯子，而cDNA文庫(kù) 克隆的是不含內(nèi)含子的功能基因。( 2分)4. 某一質(zhì)粒載體具有Tetr和Kanr的表型，在Kan抗性基因內(nèi)有一 Bgl I的切 點(diǎn)?，F(xiàn)用 Bgl I 切割該載體進(jìn)行基因克隆，問(wèn)： (1) 轉(zhuǎn)化后涂皿時(shí)應(yīng)加什么樣的 抗生素? (2) 培養(yǎng)后長(zhǎng)出的菌落具有什么樣的抗性基因型 ? (3) 如何利用抗性變化 篩選到含有插入片段的重組體 ? (6 分)答：加四環(huán)素；TetrKans和TetrKanr ；重新點(diǎn)種在含Tet、Kan和只加Tet 的平板上，

7、選擇只在 Tet 平板上生長(zhǎng)的菌落，即為所需的重組體。五分析題 10 分 科學(xué)家將人的生長(zhǎng)素基因與大腸桿菌的 DNA分子進(jìn)行重組，并成功地在大腸桿菌中得以表達(dá)。過(guò)程如右圖所示，據(jù)圖回答：(1) 人的基因之所以能與大腸桿菌的 DNA分子進(jìn)行重組，原因是什么？(2) 過(guò)程表示的是采取什么的方法來(lái)獲取目的基因？(3) 檢測(cè)大腸桿菌B是否導(dǎo)入了質(zhì)?；蛑亟M質(zhì)粒，可采用的方法和理由？(4) 如果把已經(jīng)導(dǎo)入了普通質(zhì)粒 A或重組質(zhì)粒的大腸桿菌，放在含有四環(huán)素的培 養(yǎng)基上培養(yǎng)，發(fā)生什么現(xiàn)象？分析原因？答：(1)人的基因與大腸桿菌DNA勺組成成分相同，結(jié)構(gòu)相同(2分)(2) 反轉(zhuǎn)錄法(逆轉(zhuǎn)錄法) (2 分)(3)

8、 將得到的大腸桿菌B涂布在一個(gè)含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上，能夠生長(zhǎng)的，說(shuō)明已導(dǎo)入了質(zhì)粒A或重組質(zhì)粒，反之則沒(méi)有導(dǎo)入。因?yàn)槠胀ㄙ|(zhì)粒A和重組質(zhì)粒上都有抗氨芐青霉素基因 (2 分)有的能生長(zhǎng)，有的不能生長(zhǎng)導(dǎo)入普通質(zhì)粒A的細(xì)菌能生長(zhǎng)，因?yàn)槠胀ㄙ|(zhì)粒 A 上有四環(huán)素抗性基因； 導(dǎo)入重組質(zhì)粒的細(xì)菌不能生長(zhǎng)， 因?yàn)槟康幕蛘逶谒沫h(huán) 素抗性基因中，破壞了其結(jié)構(gòu)和功能。 (4 分)六、論述題：共 1題，15 分1在基因工程操作過(guò)程中，使用的克隆載體需要具備哪些條件？選擇受體細(xì)胞 時(shí)需要具備哪些基本原則？答：克隆載體需要具備條件：（ 7 分） 載體都能攜帶外源DNA片段（基因）進(jìn)入受體細(xì)胞，或停留在細(xì)胞質(zhì)中自我復(fù)

9、制，或整合到染色體DNA上，隨著染色體DNA勺復(fù)制而同步復(fù)制。（1分） 載體都具有合適的篩選遺傳標(biāo)記。（1 分） 載體都具有供外源基因插入的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)，即多克隆位點(diǎn)。（1分） 載體都必須是安全勺， 不應(yīng)含有對(duì)受體細(xì)胞有害勺基因， 并且不會(huì)任意轉(zhuǎn)入除 受體細(xì)胞以外的其他生物細(xì)胞，尤其是人的細(xì)胞。 （1 分） 載體本身的分子量都比較小，可容納較大的外源基因片段。（1分） 載體在細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)要高，方便外源基因在細(xì)胞內(nèi)大量擴(kuò)增。（1分） 載體在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性要高，保證重組體穩(wěn)定傳代而不易丟失。（0.5分） 載體的特征都是充分掌握的，包括它的全部核苷酸序列。（0.5分）受體細(xì)胞的選擇應(yīng)具備的基

10、本原則：（ 8 分） 便于重組DNA分子的導(dǎo)入。（1分） 便于重組體的篩選。 根據(jù)所用的表達(dá)載體所含的選擇性標(biāo)記與受體細(xì)胞基因是 否相匹配，從而易于對(duì)重組體進(jìn)行篩選。 （1 分） 遺傳穩(wěn)定性高， 易于進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)或易于進(jìn)行高密度發(fā)酵而不影響外源基因的 表達(dá)效率。 對(duì)動(dòng)物細(xì)胞而言， 所選用的受體細(xì)胞具有對(duì)培養(yǎng)的適應(yīng)性強(qiáng)， 可以進(jìn) 行貼壁或懸浮培養(yǎng)，可以在無(wú)血清培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。 （1 分） 受體細(xì)胞內(nèi)內(nèi)源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低，利于外源蛋白表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)積累，可促進(jìn)外源基因高效分泌表達(dá)。 （1 分） 安全性高， 無(wú)致病性， 不會(huì)對(duì)外界環(huán)境造成生物污染。 一般選用致病缺陷型的 細(xì)胞或營(yíng)

11、養(yǎng)缺陷型細(xì)胞作為受體細(xì)胞。 （1 分） 能使重組DNA分子穩(wěn)定存在于細(xì)胞中。從受體細(xì)胞的角度出發(fā)，通常的做法是 是對(duì)其作適當(dāng)?shù)男揎椄脑欤?如選用某些限制性核酸內(nèi)切酶缺陷型的受體細(xì)胞就可 以避免其對(duì)重組DNA分子的降解破壞作用。（1分） 受體細(xì)胞在遺傳密碼子的應(yīng)用上無(wú)明顯偏倚性。 （1 分） 具有較好的轉(zhuǎn)譯后加工機(jī)制等，便于真核目的基因的高效表達(dá)。（0.5分） 在理論研究和生產(chǎn)實(shí)踐上有較高的應(yīng)用價(jià)值。（0.5 分）基因工程原理復(fù)習(xí)題思考題基因工程緒論1、基因工程的定義與特征。定義：在體外把核酸分子（DNA的分離、合成）插入載體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的 新組合（重組DNA，引入原先沒(méi)有這類(lèi)分子的受體細(xì)

12、胞內(nèi)，穩(wěn)定地復(fù)制表達(dá)繁 殖，培育符合人們需要的新品種（品系），生產(chǎn)人類(lèi)急需的藥品、食品、工業(yè)品 等。特征： 1、具跨越天然物種屏障的能力。2、強(qiáng)調(diào)了確定的DNA片段在新寄主細(xì)胞中的擴(kuò)增。2、試述基因工程的主要研究?jī)?nèi)容。1）、目的基因的分離2）、DNA勺體外重組（載體、受體系統(tǒng)等）3）、重組DNA分子轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞及其篩選4）、基因在受體細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增、表達(dá)、檢測(cè)及其分析。3、基因工程在食品工業(yè)上有何應(yīng)用發(fā)展？主要是通過(guò)基因重組， 使各種轉(zhuǎn)基因生物提高生產(chǎn)谷氨酸、 調(diào)味劑、 酒類(lèi)和油類(lèi) 等有機(jī)物的產(chǎn)率；或者改良這些有機(jī)物組成成分，提高利用價(jià)值。4、轉(zhuǎn)基因是一把雙刃劍，請(qǐng)客觀談?wù)剬?duì)轉(zhuǎn)基因及轉(zhuǎn)基因食品

13、安全性的認(rèn)識(shí)。轉(zhuǎn)基因技術(shù)所帶來(lái)的好處是顯而易見(jiàn)的， 在人類(lèi)歷史進(jìn)步和發(fā)展中起到了積極作 用。首先，通過(guò)該項(xiàng)技術(shù)可以提供人們所需要的特性，改良培育新品種； 第二，延長(zhǎng)食品保存時(shí)間或增加營(yíng)養(yǎng)成分； 第三，將抗蟲(chóng)防菌基因轉(zhuǎn)入到作物中，使作物本身產(chǎn)生抵抗病蟲(chóng)害侵襲的能力， 減少了農(nóng)藥的使用量，有利于環(huán)境保護(hù)；第四，轉(zhuǎn)基因技術(shù)及基因食物在醫(yī)學(xué)方面得到廣泛研究和應(yīng)用。人們對(duì)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的主要擔(dān)憂在于環(huán)境方面。 外源基因的導(dǎo)入可能會(huì)造就某種強(qiáng) 勢(shì)生物，產(chǎn)生新物種或超級(jí)雜草、 損害非目標(biāo)生物、 破壞原有生物種群的動(dòng)態(tài)平 衡和生物多樣性，也即轉(zhuǎn)基因生物存在潛在的環(huán)境安全問(wèn)題。轉(zhuǎn)基因作物的大面積種植已有數(shù)年，食用轉(zhuǎn)

14、基因食品的人群至少有 10 億之多， 但至今仍未有轉(zhuǎn)基因食品對(duì)生命造成危害的實(shí)例； 更何況目前每一種基因工程食 品在上市前， 都要經(jīng)過(guò)國(guó)家法律認(rèn)可， 食品衛(wèi)生部門(mén)和環(huán)境部門(mén)的嚴(yán)格檢測(cè)。 只 有測(cè)試合格了， 才能投放市場(chǎng)。 因此公眾完全可以安全地消費(fèi)、 大膽地食用轉(zhuǎn)基 因食品。第一章DNA的分子特性與利用1、原核生物和真核生物的基因表達(dá)調(diào)控有何差別？1）原核基因表達(dá)調(diào)控的三個(gè)水平：轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、翻譯水平調(diào)控、蛋白質(zhì)加工 水平的調(diào)控原核基因表達(dá)調(diào)控主要是在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控。2）真核生物基因表達(dá)的特點(diǎn)：I 1 基因組DNA存在的形式與原核生物不同；l 2 真核生物中轉(zhuǎn)錄和翻譯分開(kāi)進(jìn)行；I 3 基因表

15、達(dá)具有細(xì)胞特異性或組織特異性；I 4真核基因表達(dá)的調(diào)控在多個(gè)水平上進(jìn)行： DNA水平的調(diào)控、轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、 轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控、翻譯水平調(diào)控、蛋白質(zhì)加工水平的調(diào)控；2、什么是基因？根據(jù)基因的產(chǎn)物，基因可分為哪三類(lèi)？ 基因是具有生物學(xué)功能的、 在染色體上占據(jù)一定位置的一段核苷酸序列， 是分子 遺傳的功能單位。根據(jù)基因的產(chǎn)物，基因可分為三類(lèi)：I 轉(zhuǎn)錄并翻譯編碼蛋白質(zhì)的基因 包括結(jié)構(gòu)蛋白基因、編碼酶的基因、調(diào)節(jié)基因l 轉(zhuǎn)錄但不翻譯產(chǎn)物的基因 包括 tRNA、rRNAl不轉(zhuǎn)錄但有功能的DNA區(qū)段：如啟動(dòng)子、操縱基因3、引起核酸變性的因素主要有哪些？核酸變性后性質(zhì)有何變化？引起核酸變性的因素： - 溫度、酸

16、、堿、甲醛和尿素等。DNA變性后，它的一系列性質(zhì)發(fā)生變化，如紫外吸收（260 nm）值升高（增色效應(yīng)） 粘度降低等，如DNA增加25- 40%. RNA約增加1.1%。4、DNA復(fù)性及其影響因素。變性DNA在適當(dāng)?shù)臈l件下，兩條彼此分開(kāi)的單鏈可以重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)， 這一過(guò)程稱為復(fù)性。DNA復(fù)性的程度、速率與復(fù)性過(guò)程的條件有關(guān)，也與它本身的組成和結(jié)構(gòu)有關(guān)： 分子量越大復(fù)性越難。濃度越大，復(fù)性越容易。（附加：注意：將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫時(shí)，DNA不可能復(fù)性。但是將變 性的DNA緩慢冷卻時(shí)，可以復(fù)性。復(fù)性的應(yīng)用：核酸的雜交，分子擴(kuò)增）第二章 基因工程操作的基本技術(shù)1. DNA 凝膠電泳中

17、核酸分子分離的機(jī)理。在堿性環(huán)境下， 核酸分子帶負(fù)電荷， 在外加電場(chǎng)的作用下， 分子在凝膠多孔性剛 性濾孔中從負(fù)極向正極泳動(dòng)， 其中主要由于分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)達(dá)到分離不同 大小核酸分子的目的。2. DNA 凝膠電泳中影響電泳遷移率的因素主要有哪些？1）分子本身的影響? 分子的大?。盒t快? 帶電荷數(shù)：多則快? 分子構(gòu)型：超螺旋 解螺旋2) 電場(chǎng)：直流電場(chǎng) ? 電壓高則快? 電壓太高則結(jié)果不準(zhǔn)確常用 35V/CM3) 支持物介質(zhì)? 種類(lèi)：瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠?凝膠濃度 : 濃度大，篩孔小，適合小分子電泳；濃度小，篩孔大，適合大分子 電泳4) 電泳緩沖液u pH值：偏堿性，帶負(fù)電荷u離子濃度

18、：離子濃度高_(dá)電流大_發(fā)熱快_膠溶解u種類(lèi)：TAE TBE TPE TNE3. PCR的原理和主要反應(yīng)過(guò)程，并分析影響 PCRT增的影響因素。PCF原理：變性溫度下，DNA雙鏈變性雙螺旋解開(kāi)成單鏈 DNA在退火溫度中人 工合成的特異引物根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與單鏈DNA特異結(jié)合，然后在DNA聚合酶的作用下，在延伸溫度下不同的脫氧核苷酸按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則在引物的引 導(dǎo)下合成與模板DNA互補(bǔ)的新鏈，實(shí)現(xiàn)DNA勺擴(kuò)增。影響PCR擴(kuò)增的影響因素：§Taq酶：常用1U/25Z3濃度低，擴(kuò)增產(chǎn)物不夠；3濃度高，非特異性擴(kuò)增增加；3酶的活性；§ (2)dNTP的濃度：常用100-200卩

19、mol/L，不能低于20卩mol/L，特異性、保真性；§ (3) 模板：主要考慮純度及使用量，對(duì)純度要求不高，但含有酚、氯仿等雜質(zhì) 則難以成功。使用量從幾個(gè)ng到100ng.§引物濃度：0.1- 0.5卩mol/L之間，過(guò)多則非特異擴(kuò)增增加，形成引物二聚 體；§ (5)Mg2 濃度：常用 0.5-2.5mmol/L ；影響：酶的活性、引物 -模板退火、特異性§ (6)PCR反應(yīng)程序設(shè)定：變性溫度和時(shí)間、引物退火溫度Tm與時(shí)間、引物延伸溫度與時(shí)間和循環(huán)數(shù)4. PCR引物設(shè)計(jì)的原則，若給一指定 DNA序列并需要通過(guò)PCF擴(kuò)增此序列，如 何設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物？(關(guān)于

20、如何設(shè)計(jì)這個(gè)問(wèn)題，靠自己了)引物設(shè)計(jì)原則：1 、 G C 含量 45-55%；2、Tm值高于55;3、引物特異性；4、引物擴(kuò)增跨度;5、是否形成引物二聚體5. 定量PCR的原理？ Ct值的含義。原理：通過(guò)實(shí)時(shí)檢測(cè)PCF每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)，來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)起始 模板進(jìn)行定量及定性的分析。初始模板量X0的對(duì)數(shù)值與C(T)值之間呈線性關(guān)系：log X0= - log(1 Ex) *Ctlog N6. 分子雜交的類(lèi)型主要有哪些？探針的標(biāo)記方法與標(biāo)記類(lèi)型？常用的雙鏈 DNA 的標(biāo)記方法是哪兩種？探針的標(biāo)記方法：切口平移法、隨機(jī)引物合成法，末端標(biāo)記法，PCF標(biāo)記法，體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記法。探針按核酸分子分

21、：DNA探針和RNA探針；按標(biāo)記物的不同：放射性標(biāo)記探針和非放射性標(biāo)記探針。標(biāo)記類(lèi)型：按核酸分子的不同：可分為 DNA探針和RNA探針根據(jù)標(biāo)記物的不同：可分放射性標(biāo)記探針和非放射性標(biāo)記探針；雙鏈DNA探針標(biāo)記主要方法：切口平移法、隨機(jī)引物合成法;7. Southern 雜交一般過(guò)程及影響雜交因素。Southern 雜交操作步驟 :（1）用限制性內(nèi)切酶酶切 DNA, 經(jīng)凝膠電泳分離各酶切片段;（2）轉(zhuǎn)膜：將DNA片段轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上；（3）預(yù)雜交：封阻濾膜上非特異性位點(diǎn);（4）雜交：讓探針與同源DNA片段特異性結(jié)合；（5）洗脫：去除非特異性結(jié)合的探針；（6）自顯影檢查目的DNA所在

22、的位置。Southern 雜交影響因子1）、目的DNA在總DNA中所占的比例2）、探針的大小和標(biāo)記效率3）、轉(zhuǎn)移到濾膜上的DNA量4）、探針與靶DNA的同源性8. 基因組文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程？如何確定文庫(kù)的大??？基因組文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程：1）從生物體提取大片斷的基因組 DNA；2）用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶（常為 4堿基識(shí)別位點(diǎn)）進(jìn)行部分酶切或超聲波打斷 基因組 DNA；3） 在瓊脂凝膠電泳上或蔗糖梯度離心篩選適當(dāng)長(zhǎng)度的DNA片斷（根據(jù)載體的要 求）；4）載體的酶切、回收；5）將處理好的基因組DNA片斷與載體連接；6）將重組子導(dǎo)入宿主細(xì)胞7）文庫(kù)的鑒定、收集、保存;確定文庫(kù)大小的方法：以在構(gòu)建的基因組文庫(kù)中任

23、一基因存在的概率來(lái)衡量文庫(kù)的質(zhì)量或完備性，它與基因文庫(kù)最低所含克隆數(shù)N （即文庫(kù)大?。┲g的關(guān)系可用下式表示：N = In （ 1- P ）/ln （ 1- f ）其中：N:文庫(kù)所需的總克隆數(shù)；P:任一基因被克?。ɑ虼嬖谟诨蛭膸?kù)中）的概率；f :克隆片段的平均大小/生物基因組的大小。9. 基因文庫(kù)的類(lèi)型包括哪兩種？各有什么特點(diǎn)？10. 一般質(zhì)粒DNA的構(gòu)型有哪幾種？在瓊脂糖凝膠電泳中的有何特點(diǎn)？超螺旋質(zhì)粒DNA開(kāi)環(huán)質(zhì)粒DNA線狀質(zhì)粒DNA在瓊脂糖凝膠電泳的特點(diǎn)是：電泳的泳動(dòng)速度由大到小分別是：超螺旋質(zhì)粒DNA線狀質(zhì)粒DNA開(kāi)環(huán)質(zhì)粒DNA11. 堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的原理，分析影響試驗(yàn)結(jié)果的

24、各種可能因素。堿裂解法原理：在堿性條件下，雙連 DNA氫鍵斷裂，結(jié)構(gòu)破壞變性，環(huán)狀超螺旋 質(zhì)粒不充分變性。在中性條件下變性質(zhì)?；謴?fù)原來(lái)構(gòu)型，而線性大分子細(xì)菌DNA不能復(fù)性呈不溶物而經(jīng)離心除去。（各種可能因素是上一屆的，具體其實(shí)大家可以根據(jù)那天師兄說(shuō)的去寫(xiě)）提取失?。?）洗去雙鏈時(shí)，將質(zhì)粒DNA洗去；2）破壁失敗，質(zhì)粒沒(méi)析出；3）加劑問(wèn)題電泳失?。?）電壓太高2 ）沒(méi)加染色劑3）膠穿孔4 ）電泳時(shí)間過(guò)長(zhǎng)12. 電泳緩沖液使用一定時(shí)間后出現(xiàn) DNA在凝膠中跑不動(dòng)現(xiàn)象的原因，有何解 決辦法？原因：電泳緩沖液的離子的富集作用；解決方法：1.更換成新配置的電泳緩沖液；2. 把電泳槽中的緩沖液倒出混勻后再

25、重新使用13. 電泳的指示劑和染色劑有何區(qū)別，各自的作用是什么？指示劑一定要在電泳前加入，指示劑一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成載樣緩 沖液；（一般為：溴酚蘭，二甲苯青）作用：預(yù)知電泳的速率及方向；使樣品呈現(xiàn)顏色，便于加樣；一些高濃度蔗糖或其它物質(zhì)增加 DNA勺密度，可以防止DNA勺擴(kuò)散染色劑即可以在電泳前加入樣液，又可以電泳后再對(duì)凝膠染色；（溴化已錠EB、 硝酸銀、Goldview染料）作用：呈現(xiàn)出核酸電泳后的帶型。第三章 基因克隆的酶學(xué)基礎(chǔ)1、 限制性核酸內(nèi)切酶的類(lèi)型，基因工程常用的是哪種限制性核酸內(nèi)切酶？（常 用II型）2、什么是星活性，產(chǎn)生星活性的因素可能有哪些？在非最適合的條件下酶

26、的識(shí)別特異性降低，產(chǎn)生非特異性帶，這種活性稱星活性。產(chǎn)生Star活性的因素：（書(shū)上P46-P47答案）高濃度甘油，堿性pH,存在Mn2,低離子強(qiáng)度，低鹽濃度，低 pH3、結(jié)合已做的實(shí)驗(yàn)，分析影響酶切的因素。（這個(gè)答案是上屆的，僅供參考）1）DNA勺純度：DNA中的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、 SDS EDTA等都會(huì)影 響酶的活性。2） DNA勺甲基化程度：dam甲基化酶（修飾 GATC中的A）； dcm甲基化酶（修 飾 CCA/TGG勺 C）。3） 溫度：不同的限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同。大多數(shù)是37 °C,少數(shù)要 求40-65 °C。4）緩沖液（Buffer）:是影

27、響限制酶活性的重要因素。MgC2、NaCI/KCI :提供Mg和離子強(qiáng)度；Tris-HCI :維持pH;二硫蘇糖醇（DTT :保持酶穩(wěn)定性；牛血清白蛋白BSA等:有助于酶的穩(wěn)定；B巰基乙醇：保持酶的穩(wěn)定性，防止酶失活4、限制性核酸內(nèi)切酶命名規(guī)則及各字母代表的含義。（例子和圖幫助大家理 解而已）命名規(guī)則：寄主菌屬名的第1個(gè)字母+種名的前兩個(gè)字母+菌株或菌型代號(hào) （大 寫(xiě)）+空白+發(fā)現(xiàn)序列（羅馬數(shù)字）例子：EcoRI（E:屬名；co：種名；R:株；I:發(fā)現(xiàn)次序）5、簡(jiǎn)單敘述同尾酶和同裂酶的差別。同尾酶：來(lái)源不同，識(shí)別的序列不同，但能切出相同的粘性末端，連接后不能被 相關(guān)的酶同時(shí)切割。同裂酶：識(shí)別序

28、列相同，切割位點(diǎn)有些相同，有些不同。分完全同裂酶和不完全 同裂酶（PS:完全同裂酶：識(shí)別位點(diǎn)和切點(diǎn)完全相同。不完全同裂酶：識(shí)別位點(diǎn)相同，但切點(diǎn)不同。）6 連接酶主要有哪些類(lèi)型？有何異同點(diǎn)？影響連接酶連接效果的因素主要有類(lèi)型：DNA連接酶和RNA連接酶異同點(diǎn)：相同點(diǎn)：都能以DNA為模板，從5'向3'進(jìn)行核苷酸或脫氧核苷酸的聚合反應(yīng)。不同點(diǎn)：DNA聚合酶識(shí)別脫氧核糖核苷酸，在 DNA復(fù)制中起作用；而RNA聚合酶 聚合的是核糖核苷酸，在轉(zhuǎn)錄中起作用。影響因素：（影響因素就四個(gè)，后面分析覺(jué)得煩的話大家自己看著辦啦）1）連接所用的目的片段的狀態(tài)：1效率：粘性末端 平端（100倍）； 1

29、5，突出3,突出;1 平端:HaeHI>Alul>HinCII>Smal2）連接溫度1連接效果最好在37 C,但形成的互補(bǔ)不穩(wěn)定；1最佳連接溫度：12-16 C,較好的連接效果，互補(bǔ)又較穩(wěn)定；3）反應(yīng)液中的成分：1 ATP反復(fù)凍熔，ATP活性降低，ATP溶解度不高，連接緩沖液宜分裝；1單價(jià)離子：150-200mM NaC（提高連接效果；1 PEG 5%以下可以提高連接效率4）插入片段與載體的濃度比例1載體DNA與外源DNA的分子摩爾比通常為1 : 3左右，甚至1 : 10或更高1目的或作用：增加插入片段與載體的接觸機(jī)會(huì)，減少載體自我連接的現(xiàn)象。7、試分析提高平端DNA連接效率

30、的可能方法。（傳說(shuō)中的網(wǎng)上答案）1、低溫下長(zhǎng)時(shí)間的連接效率比室溫下短時(shí)間連接的好。2、在體系中加一點(diǎn)切載體的酶，只要連接后原來(lái)的酶切位點(diǎn)消失。這樣可避免 載體自連，應(yīng)該可以大大提高平端連接的效率。3、 足夠多的載體和插入片段是最重要的 。4、平端的連接對(duì)于離子濃度很敏感5、盡可能縮小連接反應(yīng)的體積&建議放在四度冰箱連接兩天效率更高比 14度好8、基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些？1）大腸桿菌DNA聚合酶2）Klenow fragment3）T7 DNA聚合酶4）T4 DNA聚合酶5）修飾過(guò)的T7 DNA聚合酶 6）逆轉(zhuǎn)錄酶7) Taq DNA聚合酶第四章基因克隆的載體系統(tǒng)1、作為

31、基因工程載體，其應(yīng)具備哪些條件？!具有針對(duì)受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）；!具有合適的篩選標(biāo)記；!具有較高的外源DNA勺載裝能力；!具有多克隆位點(diǎn)（MC$;!具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn)。2、質(zhì)粒的不相容性及其分子機(jī)理。定義：任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時(shí)存在于一個(gè)細(xì)胞 中，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性。分子機(jī)理：兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制同時(shí)受到同一種拷 貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同，其中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在 以后的細(xì)胞分裂周期中更具優(yōu)勢(shì)。3、載體的類(lèi)型主要有哪些？在基因工程操作中如何選擇載體？基因工程中常用的載體（vecto

32、r）主要包括質(zhì)粒（plasmid）、噬菌體（phage）和病毒 （virus）三大類(lèi)。這些載體均需經(jīng)人工構(gòu)建，除去致病基因，并賦予一些新的功 能，如有利于進(jìn)行篩選的標(biāo)志基因、單一的限制酶切點(diǎn)等。4、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原理，影響轉(zhuǎn)化率的因素有哪些？A、化學(xué)法（CaCI2法）轉(zhuǎn)化原理：是Ca2與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié) 構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙，質(zhì)?；駾NA重組分子便可 進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)（感受態(tài)細(xì)胞）。B、 電穿孔轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化原理：將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒或 DNA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化儀 的樣品池中，兩極施加高壓電場(chǎng)，在強(qiáng)大電場(chǎng)的作用下，細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn) 生縫隙，質(zhì)粒或DNA重組分子便可進(jìn)入

33、細(xì)胞內(nèi)。影響轉(zhuǎn)化率的主要影響因素：1）載體本身的性質(zhì)及其空間構(gòu)象：超螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)化率最高；2）插入片段的大?。翰迦肫卧酱螅D(zhuǎn)化效率越低；3）受體細(xì)胞的類(lèi)型及預(yù)處理； 4）轉(zhuǎn)化方法：電擊法高于化學(xué)法。5、重組體分子的選擇方法主要有哪些？并簡(jiǎn)單闡述其原理。從總體上看，重組體分子的選擇與鑒定方法基本上可以分為如下幾個(gè)類(lèi)型：（1）基于載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)法在構(gòu)建基因工程載體系統(tǒng)時(shí)，載體DNA分子上通常攜帶了一定的選擇性遺傳標(biāo)記 基因，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后可以使后者呈現(xiàn)出特殊的表型或遺傳學(xué)特性， 據(jù)此 可進(jìn)行轉(zhuǎn)化子或重組子的初步篩選。（2）基于克隆DNA序列檢測(cè)法Southern印跡雜交：根據(jù)毛細(xì)管作用的原

34、理，使在電泳凝膠中分離的 DNA片段 轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過(guò)與已標(biāo)記的單鏈 DNA探針的雜交作用以檢 測(cè)這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段。（3）基于外源基因產(chǎn)物檢測(cè)法如果目的基因產(chǎn)物能降解某些藥物使菌株呈現(xiàn)出抗性標(biāo)記， 或者基因產(chǎn)物與某些 藥物作用是顯顏色反應(yīng)，則可根據(jù)抗性或顏色直接篩選含目的基因的克隆子。6、用已學(xué)過(guò)的重組體分子的選擇與鑒定技術(shù)，試設(shè)計(jì)一個(gè)試驗(yàn)方案，假如一特 異PCF擴(kuò)出的基因或基因片斷重組進(jìn) T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，如何鑒定并獲得 真實(shí)轉(zhuǎn)化子？ （ 自理）第五章 基因的克隆一般方法1、基因的克隆方法主要有哪些？并闡述其克隆原理（至少 3種，都是書(shū)上找的，自選哈，建議必選DD

35、 RT-PCRO SSH原因請(qǐng)看下題）？1）差減雜交（ SH）通過(guò)DNA復(fù)性動(dòng)力學(xué)原理富集目的基因序列，并以此構(gòu)建減數(shù)文庫(kù)的方式來(lái)進(jìn)行 目的基因分離克隆的。2）抑制性差減雜交（ SSH）SSH的核心技術(shù)是抑制性PCR它是一種將檢測(cè)子cDNA單鏈標(biāo)準(zhǔn)化步驟和消減雜 交步驟結(jié)合為一體的技術(shù)。其中標(biāo)準(zhǔn)化步驟均等了檢測(cè)子中的 cDNA單鏈豐度， 而消減雜交步驟去除了檢測(cè)子和驅(qū)趕子之間的共同序列， 使檢測(cè)子和驅(qū)趕子之間 不同的序列得到擴(kuò)增。3）差異顯示 PCR（DD RT-PCR）利用真核生物mRN結(jié)尾處有POL（A）結(jié)構(gòu)，在其3'端設(shè)計(jì)象5'-T11GA樣引物， 該引物可與mRN總數(shù)的

36、十二分之一結(jié)合，從而使這部分基因得到逆轉(zhuǎn)錄，同時(shí) 結(jié)合 5' 端的隨機(jī)引物（ 20條 10-mer） ，可以使不同長(zhǎng)度的基因得到擴(kuò)增。4）DNA弋表性差異分析（DNA RDA代表性差別分析是通過(guò)突變型（驅(qū)趕 DNA driver DNA ）與野生型（檢測(cè)DNA tester DNA ）基因組之間的差異來(lái)分離和鑒定突變基因的方法。5）擴(kuò)增限制性片段長(zhǎng)度多樣性（ AFLP）基因組DNA經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶消化后，產(chǎn)生粘性末端。使用人工合成的短的雙鏈 接頭，該接頭一端具有同樣的內(nèi)切酶識(shí)別粘性末端，互補(bǔ)連接后成為 dnA模板。 接頭和與接頭相鄰的酶切片斷的幾個(gè)堿基序列作為引物的結(jié)合位點(diǎn)。參考文獻(xiàn)：

37、關(guān)德軍.AFLP技術(shù)原理及其在植物研究中的應(yīng)用.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006， 34（ 15）： 3625-3628） 6）cDNA微陣列建立一套統(tǒng)一且具有高質(zhì)量、高代表性的cDNA列陣膜，在這一列陣膜上每個(gè)cDNA 克隆都有固定的位置和編號(hào)， 這樣大大方便了數(shù)據(jù)的綜合比較分析， 并可對(duì)每個(gè) cDNA克隆子進(jìn)行定量分析。在列陣雜交的基礎(chǔ)上，還可以進(jìn)行雜交測(cè)序，從而 測(cè)定每個(gè)cDNA克隆子的序列。2、簡(jiǎn)單闡述差異顯示PCR克隆基因的原理及其優(yōu)缺點(diǎn)，有何應(yīng)用？主要原理：利用真核生物mRN結(jié)尾處有POLYA）結(jié)構(gòu)，在其3'端設(shè)計(jì)象5'-T11GA 樣引物，該引物可與mRNA、數(shù)的十二分之一

38、結(jié)合，從而使這部分基因得到逆轉(zhuǎn) 錄，同時(shí)結(jié)合5'端的隨機(jī)引物（20條10-mer），可以使不同長(zhǎng)度的基因得到擴(kuò) 增。優(yōu)點(diǎn)：l簡(jiǎn)便、靈敏、高效、省時(shí)，能快速顯示 mRNA勺組成。I所需的mRNAl少。I各樣本mRNA勺差異可同時(shí)進(jìn)行比較。I擴(kuò)出的cDNA可直接用于測(cè)序、文庫(kù)篩選等。缺點(diǎn)：l 假陽(yáng)性條帶多，對(duì)低豐度的基因表達(dá)不容易檢測(cè)。l 工作量大。l 無(wú)法定量研究。l擴(kuò)出的條帶往往是3'端比較短的UTF區(qū)的一段序列，提供的信息較少。利用該技術(shù)， 目前已有越來(lái)越多的差別表達(dá)基因得以分離和鑒定， 在分子生物學(xué) 和基因工程研究領(lǐng)域發(fā)揮了極大的作用。( P221)3、抑制性差減雜交的原理

39、與應(yīng)用。原理：SSH的核心技術(shù)是抑制性PCR它是一種將檢測(cè)子cDNA單鏈標(biāo)準(zhǔn)化步驟和 消減雜交步驟結(jié)合為一體的技術(shù)。其中標(biāo)準(zhǔn)化步驟均等了檢測(cè)子中的 cDNA單鏈 豐度，而消減雜交步驟去除了檢測(cè)子和驅(qū)趕子之間的共同序列， 使檢測(cè)子和驅(qū)趕 子之間不同的序列得到擴(kuò)增。應(yīng)用：l 基因突變體的研究：如基因的表達(dá)與不表達(dá)；l 基因時(shí)空表達(dá)的研究：如根、莖、葉；l 不同處理?xiàng)l件下的基因表達(dá)差異：如施肥與不施肥、光照與不光照。4、酵母雙雜交技術(shù)、噬菌體表面展示技術(shù)的原理。A. 酵母雙雜交技術(shù)原理：大部分真核生物的位點(diǎn)特異轉(zhuǎn)錄激活因子通常具有兩個(gè)可分隔開(kāi)的結(jié)構(gòu)域，一個(gè)是 DNA特異結(jié)合域(DNA-binging

40、 domain,BD )， 個(gè)是轉(zhuǎn)錄激活域(transcriptionalactivation domain,AD)。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域各具功能，互不影響， 但一個(gè)完整的、 具有激活特定基因表達(dá)的激活因子必須同時(shí)含有這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，否則無(wú)法完成其激活功能。不同來(lái)源的激活因子的BD區(qū)與AD區(qū)結(jié)合后則能特異地激活BD結(jié)合基因的表達(dá)。B. 噬菌體表面展示技術(shù)原理：當(dāng)外源 DNA片段插入絲狀噬菌體基因組的一個(gè)外 被蛋白基因中時(shí)，如果兩者讀碼框結(jié)構(gòu)保持一致，這個(gè)外源DNA片段所編碼的產(chǎn) 物可與此外被蛋白一起以融合蛋白的形式表達(dá)， 并顯示在噬菌體的表面。 利用抗 此外源基因編碼產(chǎn)物(多肽或蛋白)的抗體，通過(guò)親和純

41、化，就能從大量的噬菌 體中富集、分離出含有所要的基因的融合噬菌體。然后，通過(guò)基因擴(kuò)增，得到大 量所要的目的基因。5、T-DNA標(biāo)簽法克隆基因的一般技術(shù)路線。? 農(nóng)桿菌侵染植物得到轉(zhuǎn)化苗，篩選出表現(xiàn)某種突變性狀的個(gè)體。? 建立突變體基因組文庫(kù)及野生型基因組文庫(kù)?用T-DNA片段做probe篩選突變體文庫(kù)，獲得陽(yáng)性克隆。? 用獲得的陽(yáng)性克隆篩選野生型基因組文庫(kù)，獲得野生型的陽(yáng)性克隆。? 把陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化突變體進(jìn)行功能互補(bǔ)及進(jìn)行測(cè)序分析。第七章 克隆基因的表達(dá)1、通過(guò)比較，分析大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和酵母表達(dá)系統(tǒng)各有何優(yōu)缺點(diǎn)。 大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢(shì)：b全基因組測(cè)序，共有4405個(gè)開(kāi)放型閱讀框架；b基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟、完善；b繁殖迅速、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、操作方便、遺傳穩(wěn)定；b被FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物。大腸桿菌表達(dá)外源基因的劣勢(shì)：b缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能；b缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)；b內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白；b周質(zhì)內(nèi)含有種類(lèi)繁多的內(nèi)毒素。甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)：u具有強(qiáng)的受?chē)?yán)格調(diào)控的A0X1啟動(dòng)子u表達(dá)蛋白的翻譯后的加工和修飾u 營(yíng)養(yǎng)要求低，工業(yè)化生產(chǎn)成本低u 可高密度發(fā)酵u 表達(dá)蛋白可存在于胞內(nèi)和胞外酵母表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)： 酵母表達(dá)蛋白有時(shí)會(huì)出現(xiàn)蛋白切割問(wèn)題 （這個(gè)找不到， 百 度的）2、如何提高