培養(yǎng)基的制備與滅菌實驗報告

1、陜西師范大學(xué)遠(yuǎn)程 教育學(xué)院生物學(xué)實驗報告報告題目 培養(yǎng)基的制備與滅菌姓名劉偉學(xué)號專業(yè)生物科學(xué)批次/ 層次指導(dǎo)教師學(xué)習(xí)中心培養(yǎng)基的制備與滅菌一、目的要求1. 掌握微生物實驗室常用玻璃器皿的清洗及包扎方法。2. 掌握培養(yǎng)基的配置原則和方法。3. 掌握高壓蒸汽滅菌的操作方法和注意事項。二、基本原理牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基： 是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基，有時又稱為普通培養(yǎng)基。由于這種培養(yǎng)基中含有一般細(xì)胞生長繁殖所需要的最基本的營養(yǎng)物質(zhì)，所以可供細(xì)菌生 長繁殖之用 高壓蒸汽滅菌：主要是通過升溫使蛋白質(zhì)變性從而達(dá)到殺死微生物的效果。將滅菌的物品放在 一個密閉和加壓的滅菌鍋內(nèi)，通過加熱，使滅菌鍋內(nèi)水

2、沸騰而產(chǎn)生蒸汽。待蒸汽將 鍋內(nèi)冷空氣從排氣閥中趨盡，關(guān)閉排氣閥繼續(xù)加熱。此時蒸汽不溢出，壓力增大， 沸點升高，獲得高于 100的溫度導(dǎo)致菌體蛋白凝固變性，而達(dá)到滅菌的目的。三、實驗材料1. 藥品：牛肉膏、蛋白胨、 NaCl、瓊脂、 1mol/L 的 NaOH和 HCl 溶液。2. 儀器及玻璃器皿：天平、高壓蒸汽滅菌鍋、移液管、試管、燒杯、量筒、三角 瓶、培養(yǎng)皿、玻璃漏斗等。3. 其他物品：藥匙、稱量紙、 pH 試紙、記號筆、棉花等。四、操作步驟（一）玻璃器皿的洗滌和包裝1玻璃器皿的洗滌 玻璃器皿在使用前必須洗刷干凈。將三角瓶、試管、培養(yǎng)皿、量筒等浸入含有 洗滌劑的水中用毛刷刷洗，然后用自來水及

3、蒸餾水沖凈。移液管先用含有洗滌劑 的水浸泡，再用自來水及蒸餾水沖洗。 洗刷干凈的玻璃器皿置于烘箱中烘干后備用。 2滅菌前玻璃器皿的包裝（ 1） 培養(yǎng)皿的包扎：培養(yǎng)皿由一蓋一底組成一套，可用報紙將幾套培養(yǎng)皿包成 一包，或者將幾套培養(yǎng)皿直接置于特制的鐵皮圓筒內(nèi)，加蓋滅菌。包裝后的培 養(yǎng)皿須經(jīng)滅菌之后才能使用。（2） 移液管的包扎：在移液管的上端塞入一小段棉花 （勿用脫脂棉 ） ，它的作用 是避免外界及口中雜菌進(jìn)入管內(nèi)，并防止菌液等吸入口中。塞入此小段棉花應(yīng) 距管口約左右，棉花自身長度約 1。塞棉花時可用一外圍拉直的曲別針、將 少許棉花塞入管口內(nèi)。棉花要塞得松緊適宜，吹時以能通氣而又不使棉花滑下 為

4、準(zhǔn)。先將報紙裁成寬約 5cm左右的長紙條，然后將已塞好棉花的移液管尖端放 在長條報紙的一端，約成 45角，折疊紙條包住尖端，用左手握住移液管身， 有手將移液管壓緊在桌面上向前搓轉(zhuǎn)，以螺旋式包扎起來。上端剩余紙條， 折疊打結(jié)，準(zhǔn)備滅菌。（二）液體及固體培養(yǎng)基的配制過程1液體培養(yǎng)基配制（1）稱量（假定配制 1000ml 培養(yǎng)基） 按培養(yǎng)基配方比例依次準(zhǔn)確地稱取牛肉膏、蛋白胨、放入燒杯（或 1000ml 刻 度搪瓷杯）中牛肉膏常用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶化后 倒入燒杯。（2）溶化 在上述燒杯中先加入少于所需要的水量（如約 700ml），用玻棒攪勻，然后， 在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解，

5、 將藥品完全溶解后， 補(bǔ)充水到所需的總體積 （ 1000ml）； 如果配制固體培養(yǎng)基時，將稱好的瓊脂放人已溶的藥品中，再加熱溶化，最后補(bǔ)足 所損失的水分。（3）調(diào) pH調(diào) pH：一般用 pH 試紙測定培養(yǎng)基的 pH。用剪刀剪出一小段 pH 試紙，然后用鑷子 夾取此段 pH 試紙，在培養(yǎng)基中蘸一下，觀看其 pH范圍，如培養(yǎng)基偏酸或偏堿時， 可用 1mol/LNaoH或 1mol/LHCl 溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)。 調(diào)節(jié) pH 時，應(yīng)逐滴加入 NaOH或 HCI 溶液，防止局部過酸或過堿，破壞培養(yǎng)基中成分。邊加邊攪拌，并不時用pH試紙測試，直至 pH達(dá)。反之，用 1molLHCl 進(jìn)行調(diào)節(jié)。2固體培養(yǎng)基的配

6、制 配制固體培養(yǎng)基時，應(yīng)將已配好的液體培養(yǎng)基加熱煮沸，再將稱好的瓊脂2） 加入，并用玻棒不斷攪拌，以免糊底燒焦。繼續(xù)加熱至瓊脂全部融化，最后補(bǔ)足因蒸 發(fā)而失去水分。（三）培養(yǎng)基的分裝根據(jù)不同需要，可將已配好培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶內(nèi)，分裝時注意不要使培養(yǎng) 基沾污管口或瓶口，造成污染。如操作不小心，培養(yǎng)基沾污管口或瓶口時，可用鑷 子夾一小塊脫脂棉，擦去管口或瓶口的培養(yǎng)基，并將脫脂棉棄去。1試管的分裝 取一個玻璃漏斗，裝在鐵架上，漏斗下連一根橡皮管，橡皮管下端再與另一玻 璃管相接，橡皮管的中部加一彈簧夾。分裝時，用左手拿住空試管中部，并將漏斗 下的玻璃管嘴插入試管內(nèi)，以右手拇指及食指開放彈簧夾，中

7、指及無名指夾佐玻璃 管嘴，使培養(yǎng)基直接流入試管內(nèi)。裝入試管培養(yǎng)基的量視試管大小及需要而定，若 所用試管大小為 15× 150mm時，液體培養(yǎng)基可分裝至試管高度 14 左有為宜；如 分裝固體或半固體培養(yǎng)基時，在瓊脂完全融化后，應(yīng)趁熱分裝于試管中。用于制作 斜面的固體培養(yǎng)基的分裝量為管高 15（約 34mI），半固體培養(yǎng)基分裝量為管高 的 1 3 為宜。2三角瓶的分裝用于振蕩培養(yǎng)微生物時，可在 250m1三角瓶中加入 50m1的圖 液8-2體培培養(yǎng)基養(yǎng)的基分；裝若用于制 作平板培養(yǎng)基用時，可在 250m1三角瓶中加入 150ml 培養(yǎng)基，然后再加入 3g 瓊脂粉 （按 2計算） ，滅菌時

8、瓶中瓊脂粉同時被融化。（四）棉塞的制作及試管、三角瓶的包扎 為了培養(yǎng)好氣性微生物，需提供優(yōu)良通氣條件，同時為防止雜菌污染，則必須對通 入試管或三角瓶內(nèi)空氣預(yù)先進(jìn)行過濾除菌。通常方法是在試管及三角瓶口加上棉花1試管棉塞的制作 制棉塞時，應(yīng)選用大小、厚薄適中的普通棉花一塊，鋪展于左手拇指和食指扣 成的團(tuán)孔上，用右手食指將棉花從中央壓入團(tuán)孔中制成棉塞然后直接壓入試管或 三角瓶口。也可借用玻璃棒塞入，也可用折疊卷塞法制作棉塞。制作的棉塞應(yīng)緊貼管壁，不留縫隙，以防外界微生物沿縫隙侵入，棉塞不宜過 緊或過松，塞好后以手提棉塞，試管不下落為準(zhǔn)。棉塞的23 在試管內(nèi)， 13 在試管外。目前也有采用硅膠塞代替棉

9、塞直接蓋在試管口上。將裝好培養(yǎng)基并塞好棉塞或硅膠塞的試管捆成一捆，外面包上一層牛皮紙。用 記號筆注明培養(yǎng)基名稱及配制日期，滅菌待用。2三角瓶棉塞制作 通常在棉塞外包上一層紗布，再塞在瓶口上。有時為了進(jìn)行液體振蕩培養(yǎng)加大 通氣量，則可用 8 層紗布代替棉塞包在瓶口上，目前也有采用硅膠塞直接蓋在瓶口 上。在裝好培養(yǎng)基并塞好棉塞或包扎八層紗布或蓋好硅膠塞的三角瓶口上，再包上 一層牛皮紙并用線繩捆好，滅菌待用。（五）培養(yǎng)基的滅菌將上述培 養(yǎng)基 以， l21 ， 20min 高壓蒸氣滅菌。滅菌過程：1. 加水：首先將內(nèi)層鍋取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，使水面沒過加熱蛇管， 與三角擱架相平為宜。切勿忘記

10、檢查水位，加水量過少，滅菌鍋會發(fā)生燒干引 起炸裂事故。2. 裝料：放回內(nèi)層鍋，并裝入待滅菌的物品。注意不要裝得太擠，以免妨礙蒸汽 流通而影響滅菌效果。裝有培養(yǎng)基的容器放置時要防止液體溢出，三角瓶與試 管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包扎的紙而透入棉塞。3. 加蓋：將蓋上與排氣孔相連的排氣軟管插入內(nèi)層鍋的排氣槽內(nèi)，擺正鍋蓋，對 齊螺口，然后以對稱方式同時旋緊相對的兩個螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏 氣，并打開排氣閥。4. 排氣：打開電源加熱滅菌鍋，將水煮沸，使鍋內(nèi)的冷空氣和水蒸汽一起從排氣 孔中排出。一般認(rèn)為當(dāng)排出的氣流很強(qiáng)并有噓聲時，表明鍋內(nèi)的空氣已排盡， 沸騰后約需 5 分鐘。5. 升壓

11、：冷空氣完全排盡后，關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，鍋內(nèi)壓力開始上升。6. 保壓：當(dāng)壓力表指針達(dá)到所需壓力時，控制電源，開始計時并維持壓力至所需 的時間。如本實驗中采用， 20 分鐘滅菌。 滅菌的主要因素是溫度而不是壓力，因此鍋內(nèi)的冷空氣必須完全排盡后，才能 關(guān)閉排氣閥，維持所需壓力。7. 降壓：達(dá)到滅菌所需的時間后，切斷電源，讓滅菌鍋溫度自然下降，當(dāng)壓力表 的壓力降至“0”后，方可打開排氣閥， 排盡余下的蒸汽， 旋松螺栓， 打開鍋蓋， 取出滅菌物品，倒掉鍋內(nèi)剩水。壓力一定要降到“ 0”后，才能打開排氣閥，開 蓋取物。否則就會因鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基或試劑由于內(nèi)外壓 力不平衡而沖出容器口，造成瓶口被污染，甚至灼傷操作者。（六）斜面和平板的制作1斜面的制作 將已滅菌裝有瓊脂培養(yǎng)基的試管，趁熱置于木棒或玻棒上，使成適當(dāng)斜度，凝固后即成斜面。斜面長度不超過試管長度 l 2 為宜。如制作半團(tuán)體或固體深層培 養(yǎng)基時，滅菌后則應(yīng)垂直放置至凝固。2平板的制作將裝在三角瓶或試管中已滅菌的瓊脂培養(yǎng)基融化后， 待冷至 50左右傾入無菌 培養(yǎng)皿中。溫度過高時，皿蓋上的冷凝水太多；溫度低于 50，培養(yǎng)基易于凝固而 無法制作平板。平板的制作應(yīng)在火旁進(jìn)行，左手拿培養(yǎng)皿，右手