PCR實(shí)驗(yàn)室檢查要點(diǎn)(2016年度)

1、/*聚合酶鏈反應(yīng)（ PCR）檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室檢查要點(diǎn)指南（ 2016 版）聚合酶鏈反應(yīng)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室是指通過基因擴(kuò)增的方式檢測特定的DNA或 RNA的檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室。聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase ChainReaction ，PCR）是一種在體外特異性擴(kuò)增靶 DNA序列的技術(shù)，其基 本過程為模板雙鏈 DNA的變性、引物與模板 DNA的退火和在 DNA 聚 合酶引導(dǎo)下的鏈延伸反應(yīng)三個(gè)階段的多次循環(huán)。 每一次循環(huán)后的擴(kuò)增 產(chǎn)物均可作為下一輪循環(huán)的模板， 理論上， 擴(kuò)增產(chǎn)物量呈指數(shù)形式上 升，即經(jīng)過 n 個(gè)循環(huán)后，產(chǎn)物量增加到 2n倍。 PCR試劑操作簡單，短 時(shí)間內(nèi)在體外可獲得數(shù)百萬個(gè)特異靶 DNA序列的

2、復(fù)制，為臨床疾病的 診斷、治療監(jiān)測和預(yù)后評估提供了一種極有幫助的實(shí)驗(yàn)室輔助手段。PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室是 PCR試劑生產(chǎn)企業(yè)在產(chǎn)品檢驗(yàn)過程中不可缺少 的工作環(huán)境，其環(huán)境控制水平和質(zhì)量管理水平直接影響著最終產(chǎn)品是 否合格，能否放行。由于該產(chǎn)品本身的特殊性， 醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量 管理規(guī)范附錄體外診斷試劑 、醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范體外診斷 試劑現(xiàn)場檢查指導(dǎo)原則 條款中，明確對 PCR試劑的生產(chǎn)和檢驗(yàn)環(huán)境 做出規(guī)定。此外現(xiàn)行衛(wèi)生行業(yè)的法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)以及相關(guān)文獻(xiàn)中對于 PCR 檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室均作出規(guī)定，主要涉及全國臨床檢驗(yàn)規(guī)程 （第三版）、 醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增管理辦法 （衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā) 2010194 號）、 醫(yī)療機(jī)構(gòu)

3、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作導(dǎo)則 及臨床診斷中聚合 酶鏈反應(yīng)（ PCR）技術(shù)的應(yīng)用（ WS/T 230-2002）等行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān) 要求。本檢查指南旨在幫助北京市醫(yī)療器械監(jiān)管人員增強(qiáng)對PCR檢驗(yàn)相關(guān)過程的認(rèn)知和把握， 指導(dǎo)全市醫(yī)療器械監(jiān)管人員對 PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn) 室設(shè)計(jì)建設(shè)與質(zhì)量控制的監(jiān)督檢查工作。 同時(shí)，為 PCR試劑生產(chǎn)企業(yè) 在 PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)建造和管理要求提供參考。當(dāng)國家相關(guān)法規(guī)、 標(biāo)準(zhǔn)、檢查要求發(fā)生變化時(shí)， 應(yīng)當(dāng)重新討論以 確保本檢查指南持續(xù)符合要求。一、適用范圍 本檢查指南可作為北京市食品藥品監(jiān)督管理局組織、 實(shí)施的體外 診斷試劑產(chǎn)品注冊質(zhì)量管理體系現(xiàn)場核查、 醫(yī)療器械生產(chǎn)許可證

4、 現(xiàn)場核查、醫(yī)療器械生產(chǎn)監(jiān)督檢查等各項(xiàng)涉及 PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室檢查的 參考資料?；驕y序檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室等涉及 PCR試劑的相關(guān)部分應(yīng)當(dāng)參照本檢 查指南執(zhí)行。二、檢查要點(diǎn)（一）現(xiàn)場查看生產(chǎn)企業(yè) PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室布局 生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)當(dāng)提供 PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)方案和 / 或平面設(shè)計(jì)圖 （應(yīng)當(dāng)標(biāo)明風(fēng)向或壓差梯度） 。1. PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室與 PCR試劑生產(chǎn)區(qū)域應(yīng)當(dāng)在各自獨(dú)立的建筑物 或空間內(nèi)， 保證空氣不直接聯(lián)通， 防止擴(kuò)增時(shí)形成的氣溶膠造成交叉 污染。2. 原則上 PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)設(shè)置以下區(qū)域： 試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)、 標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。根據(jù)使用儀器的功能，區(qū)域 可適當(dāng)合并。若使用實(shí)時(shí)熒光

5、定量 PCR儀且不需要進(jìn)行后續(xù)產(chǎn)物分析工作，擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)可合并。若使用樣本處理、核酸提取 及擴(kuò)增檢測為一體的自動(dòng)化分析儀，則標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn) 物分析區(qū)可合并。3. 各區(qū)域在物理空間上應(yīng)當(dāng)完全相互獨(dú)立， 各區(qū)域無論是在空間 上還是在使用中， 應(yīng)當(dāng)始終處于完全的分隔狀態(tài)。 不應(yīng)當(dāng)只是形式上 的分區(qū)，不應(yīng)當(dāng)是一個(gè)區(qū)域嵌套一個(gè)區(qū)域。4. 各區(qū)域不應(yīng)當(dāng)有空氣的直接相通。 擴(kuò)增區(qū)與擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)各 區(qū)域宜采用獨(dú)立直排方式出風(fēng)。采用空調(diào)機(jī)組方式的， PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn) 室應(yīng)當(dāng)具備獨(dú)立空調(diào)機(jī)組； 同時(shí)應(yīng)當(dāng)考慮停機(jī)后各房間空氣連通的可 能性，采取必要的控制措施。5. 按照試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)標(biāo)本制備

6、區(qū)擴(kuò)增區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物分 析區(qū)方向空氣壓力應(yīng)當(dāng)以遞減的方式進(jìn)行， 使得 PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的空 氣流向應(yīng)當(dāng)按照試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)擴(kuò)增區(qū)擴(kuò)增產(chǎn) 物分析區(qū)方向進(jìn)行， 防止擴(kuò)增產(chǎn)物順空氣氣流進(jìn)入擴(kuò)增前的區(qū)域。 空 氣流向應(yīng)當(dāng)為單向，禁止下游污染上游。應(yīng)當(dāng)設(shè)置合理的壓差梯度， 并安裝壓差監(jiān)測裝置， 以有效證明空氣流向， 壓差梯度不宜低于 5帕。6. 設(shè)置緩沖間的， 緩沖間內(nèi)通向內(nèi)實(shí)驗(yàn)室和走廊的門應(yīng)當(dāng)安裝連 鎖裝置或采取相應(yīng)措施，避免出現(xiàn)兩個(gè)門同時(shí)打開的情況。7. 各區(qū)間若設(shè)置傳遞窗，應(yīng)當(dāng)為雙側(cè)開門，要求密封嚴(yán)實(shí)，并且 兩側(cè)的門應(yīng)當(dāng)為互鎖裝置或采取相應(yīng)措施保證兩側(cè)門不會(huì)同時(shí)開啟。（二）現(xiàn)場查看儀器設(shè)施配

7、置1. 試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)的功能： 貯存試劑的制備、 試劑的分裝和擴(kuò) 增反應(yīng)混合液的準(zhǔn)備，以及離心管、吸頭等消耗品的貯存和準(zhǔn)備。 配套用品一般應(yīng)當(dāng)包括：（1）溫度調(diào)控范圍為 2 8和（或） -20 以下冰箱；（2）混勻器；（3）微量加樣器；（4）紫外消毒設(shè)備；（5）消耗品：一次性手套、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭；（6）專用工作服和工作鞋 （套） ；（7）專用辦公用品。2. 標(biāo)本制備區(qū)的功能：核酸（ RNA、DNA）提取、貯存及加樣。 配套用品一般應(yīng)當(dāng)包括：（1）溫度調(diào)控范圍為 2 8和（或） -20 以下冰箱；（2）高速離心機(jī)；（3）混勻器；（4）水浴箱或加熱模塊；（5）微量加樣器；（6）紫

8、外消毒設(shè)備；（7）生物安全柜；（8）消耗品：一次性手套、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭 （帶 濾芯）；（9）專用工作服和工作鞋 （套） ；（10）專用辦公用品；（11）如需處理大分子 DNA，應(yīng)當(dāng)具有超聲波儀。3. 擴(kuò)增區(qū)的功能： cDNA合成、 DNA擴(kuò)增及檢測。配套用品一般應(yīng) 當(dāng)包括：（1）核酸擴(kuò)增儀；（2）微量加樣器；（3）紫外消毒設(shè)備；（4）消耗品：一次性手套、一次性帽子、耐高壓處理的離心管和 加樣器吸頭（帶濾芯） ；（5）專用工作服和工作鞋；（6）專用辦公用品。4. 擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)的功能：擴(kuò)增片段的進(jìn)一步分析測定。視檢驗(yàn) 方法不同而定，基本配置如下：（1）微量加樣器；（2）紫外消毒設(shè)

9、備；（3）消耗品：一次性手套、一次性帽子、 加樣器吸頭（帶濾芯）；（4）專用工作服和工作鞋；（5）專用辦公用品。5. 設(shè)備的維護(hù)保養(yǎng) 應(yīng)當(dāng)建立設(shè)備維護(hù)保養(yǎng)規(guī)程， 計(jì)量設(shè)備應(yīng)當(dāng)定期檢定。 例如核酸 擴(kuò)增儀、微量加樣器、生物安全柜、離心機(jī)應(yīng)當(dāng)每年進(jìn)行檢定或校準(zhǔn) 工作（三）現(xiàn)場檢查工作流程及注意事項(xiàng)1. 進(jìn)入各工作區(qū)域應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格按照單一方向進(jìn)行， 即試劑儲存和準(zhǔn) 備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)擴(kuò)增區(qū) 擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。2. 各工作區(qū)域必須有明確的標(biāo)記， 不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、 物品 不得混用。3. 不同工作區(qū)域的工作服應(yīng)當(dāng)加以區(qū)分， 不得混用 （例如可以采 用不同顏色）。4. 實(shí)驗(yàn)室的清潔應(yīng)當(dāng)按照試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)標(biāo)本制

10、備區(qū)擴(kuò) 增區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)的方向進(jìn)行。 不同的實(shí)驗(yàn)區(qū)域應(yīng)當(dāng)有其各自的 清潔用具并防止交叉污染。 實(shí)驗(yàn)垃圾屬于醫(yī)療廢物的應(yīng)當(dāng)按照 醫(yī)療 廢物管理?xiàng)l例相關(guān)規(guī)定進(jìn)行處理。5. 工作結(jié)束后，應(yīng)當(dāng)立即對工作區(qū)進(jìn)行清潔及消毒。6. 貯存試劑和用于標(biāo)本制備的消耗品等材料應(yīng)當(dāng)直接運(yùn)送至試 劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)，不能經(jīng)過擴(kuò)增檢測區(qū)。應(yīng)當(dāng)對加樣吸頭、 PCR反應(yīng) 管等消耗品處理， 防止污染。 試劑盒中的陽性對照品及質(zhì)控品應(yīng)當(dāng)保 存在標(biāo)本處理區(qū)。 試劑應(yīng)當(dāng)使用分子生物學(xué)級別試劑， 使用的純化水 應(yīng)當(dāng)高壓滅菌。質(zhì)檢用于原輔料、半成品、成品檢驗(yàn)用的 PCR反應(yīng)試 劑應(yīng)當(dāng)有相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及操作程序。7. 為避免樣本間的交叉污染

11、， 加入待測核酸后， 應(yīng)當(dāng)蓋好含反應(yīng) 混合液的反應(yīng)管。 應(yīng)當(dāng)注意 PCR反應(yīng)液加樣的順序， 應(yīng)當(dāng)為空白樣品 陰性對照樣品陽性對照。 對具有潛在傳染危險(xiǎn)性的材料， 應(yīng)當(dāng) 在生物安全柜內(nèi)開蓋，并有明確的樣本處理和滅活程序。8. 應(yīng)當(dāng)避免氣溶膠所致的污染，盡量減少在擴(kuò)增區(qū)內(nèi)的走動(dòng)， 擴(kuò)增反應(yīng)管不得在擴(kuò)增區(qū)打開。9. 擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)有可能存在某些可致基因突變和有毒物質(zhì)如 溴化乙錠、丙烯酰胺、甲醛或放射性核素等，應(yīng)當(dāng)注意實(shí)驗(yàn)人員的安 全防護(hù)。（四）現(xiàn)場檢查人員培訓(xùn)情況參與 PCR檢驗(yàn)的工作人員應(yīng)當(dāng)具備相應(yīng)的專業(yè)知識和技能， 包括 能熟練操作相關(guān)設(shè)備 , 明確整個(gè)工作的流程 ,掌握出現(xiàn)污染情況的處 理方法

12、以及實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制方法和檢測結(jié)果的解釋。檢查人員可以通過詢問或要求人員實(shí)際操作對其進(jìn)行評價(jià)， 也可 以通過查閱人員培訓(xùn)記錄，對其進(jìn)行評價(jià)。（五）現(xiàn)場檢查文件情況 在檢查過程中應(yīng)當(dāng)特別注意現(xiàn)場查看、 詢問、記錄的實(shí)際情況與 生產(chǎn)企業(yè)的文件規(guī)定、記錄的符合性。附件：圖 A 緩沖間為負(fù)壓的理想 PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)置模式圖 B 緩沖間為正壓的理想 PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)置模式圖 A和圖 B 所給出的 PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)置圖是較為理想的設(shè)置模 式，建議企業(yè)參照此種模式設(shè)計(jì)并建立實(shí)驗(yàn)室。參考資料：1. 關(guān)于發(fā)布醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范的公告 （國家食品藥 品監(jiān)督管理總局公告 2014年第 64號）2. 關(guān)于發(fā)布醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范附錄體外診斷試劑的公 告（國家食品藥品監(jiān)督管理總局公告 2015年第 103 號）3. 關(guān)于印發(fā)醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范現(xiàn)場檢查指導(dǎo)原則等 4 個(gè)指導(dǎo)原則的通知（食藥監(jiān)械監(jiān) 2015218 號）4. 生物安全實(shí)驗(yàn)室建筑技術(shù)規(guī)范 （ GB50346-2004）5. 實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求 （ GB19489-2008）6. 臨床診斷中聚合酶鏈反應(yīng) （ PCR）技術(shù)的應(yīng)用（WS/T203-2002）7. 全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程 第 3版 ，中華人民共和國衛(wèi)生部醫(yī)政 司，2006年11月 2日8.Setting Up a PCR L