低氧誘導(dǎo)因子1α在大鼠腦缺血耐受中的表達(dá)

1、低氧誘導(dǎo)因子1在大鼠腦缺血耐受中的表達(dá)【摘要】 目的 探討腦缺血耐受中低氧誘導(dǎo)因子1（HIFl）的表達(dá)。方法 84只Wistar大鼠隨機(jī)分成對照組 （SS+SS組，4只），假手術(shù)組（SS+MCAO組，40只）和缺血預(yù)處理組（IP+MCAO組，40只）。線栓法阻塞大腦中動脈建立缺血預(yù)處理模型，分別于預(yù)缺血后1、3、7、14、21 d再缺血2 h，然后取腦經(jīng)蘇木精伊紅染色后光鏡下進(jìn)行病理觀察，免疫組化方法檢測腦組織HIF1蛋白的表達(dá)。結(jié)果 IP+MCAO組中1、3、7 d的HIF1蛋白表達(dá)水平與SS+MCAO組中相應(yīng)時間點(diǎn)比較，差異具有顯著性（t=2.4499.898，P0.05）。結(jié)論 HIF1

2、在腦缺血耐受中表達(dá)上調(diào)，可能是導(dǎo)致腦缺血耐受的分子機(jī)制之一。 【關(guān)鍵詞】 低氧誘導(dǎo)因子1 缺血預(yù)處理 缺血低氧 腦 大鼠 ABSTRACTObjectiveTo investigate the expression of hypoxia inducible factor1 (HIF1) in the brain ischemic model of rats.MethodsHealthy Wistar rats (n=84) were randomly divided into three groups, the shamsurgery group (SS+SS，n=4），the sham an

3、d middle cerebral artery occlusion (MCAO) group (SS+MCAO,n=40) and the ischemic preconditioning and MCAO group (IP+MCAO,n=40). A rat model of focal ischemic preconditioning was established via occlusion of middle cerebral artery. At day 1, 3, 7, 4, and 21 after the preconditioning, another two hours

4、 of ischemia were given to each experimental animal. The pathology was evaluated by HE staining. The volumes of infarct area were measured, and the expression of the HIF2 / 161 detected via immunohistochemical technique.ResultsThe levels of HIF1 expression in rats of IP+MCAO group at day 1, 3, and 7

5、 after the preconditioning were significantly higher than those of the SS+MCAO groups (t=2.449-9.898，P<0.05）.ConclusionThe expression of HIF1 is upregulated, which may be one of the molecular mechanisms in the brain ischemic tolerance. KEY WORDShypoxia inducible factor 1; ischemic preconditio

6、ning; hypoxiaischemia, brain; rats 近年研究顯示，短暫性腦缺血對神經(jīng)細(xì)胞起保護(hù)作用，可抵御其后發(fā)生的嚴(yán)重腦缺血，即誘發(fā)了腦缺血耐受（IT）1，對其作用機(jī)制的探索已成為近年腦血管病研究的熱點(diǎn)問題。本實(shí)驗(yàn)采用線栓法制備腦缺血耐受模型，通過神經(jīng)功能評分、蘇木精伊紅（HE）染色觀察病理學(xué)改變等對模型進(jìn)行評估，并通過免疫組化方法檢測腦缺血耐受過程中低氧誘導(dǎo)因子1（HIFl）的表達(dá)，探討其在腦缺血耐受機(jī)制中的作用。 1 材料和方法 1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 健康雄性Wistar大鼠84只，體質(zhì)量250300 g。隨機(jī)分成3組。缺血預(yù)處理組（IPMCAO組，40只）：預(yù)缺血1

7、0 min后按再灌注不同時間（1、3、7、14、21 d）分為5個亞組；假手術(shù)組（SS+MCAO組，40只）：分按前述時間點(diǎn)5個亞組；對照組（SS+SS組，4只）。 1.2 模型的制備 缺血預(yù)處理參照文獻(xiàn)2,3方法進(jìn)行。再缺血的處理按再灌注的不同時間在規(guī)定時間點(diǎn)再次麻醉大鼠，將埋在皮下的線栓推進(jìn)（18.5±2.0）mm ，再次阻斷大腦中動脈造成MCAO，重新結(jié)扎ECA近心端，縫合皮膚，2 h后將留在皮外的線栓退出至ECA，形成第2次再灌注，完成再缺血處理。 1.3 實(shí)驗(yàn)方法 IPMCAO組預(yù)缺血10 min后，分別于再灌注1、3、7、14、21 d后阻塞大腦中動脈2 h，再灌注22

8、h 后處死；SS+MCAO組假手術(shù)代替預(yù)缺血，在假手術(shù)后按前述不同時間點(diǎn)阻塞大腦中動脈2 h, 再灌注22 h后處死；SS+SS組兩次均為假手術(shù)。 1.4 神經(jīng)功能缺損評分 參照BEDERSON 等45分制法進(jìn)行評分。評分累積1分以上認(rèn)定為造模成功。 1.5 腦組織病理觀察 每組隨機(jī)選取4只大鼠，心臟灌注生理鹽水、40 g/L 多聚甲醛各約200 mL，斷頭取腦，取前囟后36 mm部位組織，40 g/L 多聚甲醛后固定,脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，片厚5 m。HE染色后鏡下觀察組織病理學(xué)變化。 1.6 HIF1蛋白檢測 采用SABC法。SABC試劑盒、兔抗鼠HIF1單克隆抗體（一抗）購自武漢

9、博士德生物工程有限公司。大鼠水合氯醛麻醉后，心臟依次灌注生理鹽水、40 g/L多聚甲醛各約200 mL，斷頭取腦，取前囟后36 mm部位組織，多聚甲醛后固定4 h，脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，片厚5 m。每只動物取3張切片，常規(guī)脫蠟至水。體積分?jǐn)?shù)0.03的H2O2滅活內(nèi)源性酶，抗原熱修復(fù)，滴加1200工作濃度的HIF1單克隆抗體。4 過夜后，依次滴加生物素化二抗、試劑SABC，37 各孵育30 min，DAB顯色，鏡下控制反應(yīng)時間。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片。參照文獻(xiàn)5的方法進(jìn)行觀察。 1.7 圖像分析 采用Simple PCI顯微圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，測量免疫組化染色的平均吸光度（

10、A）值。 1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.5軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，檢測結(jié)果以±s表示。各組同一時間點(diǎn)之間比較采用t檢驗(yàn)，組內(nèi)不同時間點(diǎn)比較采用方差分析。 2 結(jié) 果 2.1 神經(jīng)功能缺損評分 SS+SS組神經(jīng)功能評分為0。IP+MCAO組3、7 d神經(jīng)功能評分均低于SS+MCAO組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.025、2.683，P0.05）。 SS+MCAO組中各時間點(diǎn)間比較差異無顯著性；IP+MCAO組中3 d與其他時間比較，差異具有顯著性（F=3.55,P0.05）。見表1。表1 各組動物不同時間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評分比較 2.2 病理學(xué)觀察 2.2.1 大體改變 缺血側(cè)大

11、腦表面呈不同程度的飽滿、蒼白等腦水腫征象。 2.2.2 光鏡觀察 SS+SS組神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量及形態(tài)分布正常。SS+MCAO組與IP+MCAO組海馬區(qū)均表現(xiàn)不同程度的損傷改變，如細(xì)胞數(shù)減少、形態(tài)腫脹，細(xì)胞排列紊亂。梗死灶中心區(qū)組織明顯稀疏，神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)脫失及變形，胞核固縮、溶解，失去完整結(jié)構(gòu)。梗死灶周邊區(qū)神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞腫脹，甚至胞核固縮、濃染，并可見膠質(zhì)細(xì)胞浸潤。IPMCAO組梗死灶中心區(qū)較SS+MCAO組明顯減小，周圍區(qū)結(jié)構(gòu)完整的神經(jīng)細(xì)胞明顯增多，組織水腫程度減輕；海馬區(qū)細(xì)胞數(shù)量減少不明顯，排列相對規(guī)整（圖1、2）。 2.3 HIF1的檢測 光鏡下HIF1陽性細(xì)胞為胞核或胞漿呈棕褐色或棕

12、黃色。SS+SS組偶爾見少量HIF1蛋白表達(dá)。 IP+MCAO組與SS+MCAO組可見較多的HIF1陽性表達(dá)細(xì)胞，主要分布于皮質(zhì)、海馬、紋狀體及室管膜細(xì)胞等，神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞均有表達(dá)（圖3、4）。IP+MCAO組1、3、7 d的HIF1蛋白表達(dá)水平與SS+MCAO組相應(yīng)時間點(diǎn)比較，差異具有顯著性（t=2.4499.898，P0.05）。見表2。 表2 各組HIF1蛋白的表達(dá) 3 討 論 腦缺血耐受是指給予短暫的亞致死性缺血后誘導(dǎo)腦的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制,從而對后續(xù)長時間缺血損傷產(chǎn)生耐受及自身保護(hù)作用1。HIF1是近年發(fā)現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)錄因子，由、兩個亞基組成 ，既是調(diào)節(jié)亞基，又是活性亞基，O2對 HIF1

13、 活性調(diào)節(jié)主要通過對該亞基的影響實(shí)現(xiàn)。低氧時 HIF1 兩個亞基形成二聚體，可與許多靶基因的低氧反應(yīng)元件結(jié)合，介導(dǎo)機(jī)體的低氧反應(yīng)，在低氧誘導(dǎo)的基因表達(dá)中起到關(guān)鍵作用69。近年許多研究表明，HIF1與腦缺血關(guān)系密切，在缺血低氧性腦損傷中發(fā)揮重要作用。SHARP等10研究結(jié)果顯示,局灶性腦缺血發(fā)生 7.5 h 后,mRNA編碼的HIF1、GT1及一些糖酵解酶在梗死周邊區(qū)開始誘導(dǎo)出現(xiàn),19及24 h時其表達(dá)被進(jìn)一步上調(diào)。BERGERON等11研究也認(rèn)為,在急性局灶性腦缺血時HIF1及相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)促進(jìn)了梗死灶周邊血管網(wǎng)的重塑和糖酵解,有助于缺血腦組織的存活。 本研究采用文獻(xiàn)2,3方法，先后兩次線栓

14、堵塞大腦中動脈，建立缺血再灌注模型，通過大鼠神經(jīng)功能評分、腦組織病理學(xué)變化來證實(shí)腦缺血耐受的產(chǎn) 生。本文結(jié)果顯示，預(yù)缺血后37 d時間內(nèi)，IP+MCAO組大鼠神經(jīng)功能缺損評分明顯低于SS+MCAO組，同時蘇木精伊紅染色顯示，IP+MCAO組大鼠腦組織的缺血程度、范圍及腦水腫程度均較SS+MCAO組輕。因此， 10 min的預(yù)缺血可以誘導(dǎo)腦缺血耐受，具有神經(jīng)保護(hù)作用。 目前，對預(yù)缺血誘導(dǎo)產(chǎn)生腦缺血耐受的最佳時間窗尚無定論，CHEN等12的研究顯示，分3次給予每次10 min的局灶性預(yù)缺血所誘導(dǎo)的腦缺血耐受最早出現(xiàn)于再灌注2 d以后,并可持續(xù)57 d。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過預(yù)缺血10 min，能產(chǎn)生

15、較明顯的缺血耐受，這與BARONE等13的觀察結(jié)果基本一致。同時，IP+MCAO組HIF1表達(dá)自3 d開始上調(diào)，持續(xù)到7 d，后逐漸降低，本文結(jié)果與前述腦缺血耐受產(chǎn)生的時間窗基本吻合，提示HIF1可能在腦缺血耐受的產(chǎn)生過程中發(fā)揮重要作用。 從表達(dá)分布上看，HIF1主要表達(dá)于梗死周邊區(qū)缺血半暗帶的神經(jīng)細(xì)胞及部分血管內(nèi)皮細(xì)胞管壁。由于半暗帶腦血流量的減少降低了該區(qū)域氧的供應(yīng)，從而誘導(dǎo)HIF1的轉(zhuǎn)錄激活及相關(guān)靶基因的表達(dá)。SHARP等14研究結(jié)果顯示，在局灶性腦缺血中HIF1表達(dá)區(qū)均出現(xiàn)血流量下降現(xiàn)象，提示腦缺血后HIF1表達(dá)區(qū)域即是梗塞周圍慢性低氧的區(qū)域。 總之，本實(shí)驗(yàn)表明 HIF1表達(dá)與腦缺血耐

16、受形成密切相關(guān)。局灶性缺血預(yù)處理后再次嚴(yán)重缺血可使HIF1表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)其靶基因的轉(zhuǎn)錄，對機(jī)體形成一定的保護(hù)作用。HIF1的表達(dá)上調(diào)可能是腦缺血耐受形成的重要分子機(jī)制之一。 【參考文獻(xiàn)】 1KITAGAWA K, MATSUMOTO M,TAGAYA M, et al. “Ischemic tolerance” phenomenon found in the brainJ. Brain Res, 1990,528(1):2126. 2LONGA E Z, WEINSTEIN P R, CARLSON S, et al. Reversible middle cerebral artery occ

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