細(xì)胞化學(xué)術(shù)PPT學(xué)習(xí)教案

1、會計(jì)學(xué)120世紀(jì)世紀(jì)50年代，電子顯微鏡的問世，觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)年代，電子顯微鏡的問世，觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。到。到80年代末，發(fā)展與完善了年代末，發(fā)展與完善了電鏡細(xì)胞化學(xué)電鏡細(xì)胞化學(xué)。70年代由于年代由于細(xì)胞顯微分光光度法和熒光顯微光度法的建立，使細(xì)胞化細(xì)胞顯微分光光度法和熒光顯微光度法的建立，使細(xì)胞化學(xué)的成分得以定量、形成學(xué)的成分得以定量、形成定量細(xì)胞化學(xué)定量細(xì)胞化學(xué)。80-90年代，流年代，流式細(xì)胞儀可對單細(xì)胞化學(xué)成分定量分析的新技術(shù)（每秒可式細(xì)胞儀可對單細(xì)胞化學(xué)成分定量分析的新技術(shù)（每秒可測上萬個信息）。測上萬個信息）。80年代后期，創(chuàng)立了激光掃描共聚焦顯年代后期，創(chuàng)立了激光掃描共聚焦

2、顯微技術(shù)，對單個細(xì)胞進(jìn)行微技術(shù)，對單個細(xì)胞進(jìn)行CT分析，通過計(jì)算機(jī)進(jìn)行三微分析，通過計(jì)算機(jī)進(jìn)行三微立體旋轉(zhuǎn)，從各角度分析細(xì)胞深層和細(xì)胞表面的各種結(jié)構(gòu)立體旋轉(zhuǎn)，從各角度分析細(xì)胞深層和細(xì)胞表面的各種結(jié)構(gòu)?？裳芯炕罴?xì)胞和定量分析細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)?？裳芯炕罴?xì)胞和定量分析細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)DNA、RNA、細(xì)胞器、酶的含量等。、細(xì)胞器、酶的含量等。第1頁/共34頁基本原理：基本原理：細(xì)胞中的某種化學(xué)成分和其相應(yīng)的底物呈現(xiàn)一系列的化學(xué)反應(yīng)，形成在顯微鏡下可見到的反應(yīng)產(chǎn)物。對細(xì)胞內(nèi)的各種成分進(jìn)行細(xì)胞中的某種化學(xué)成分和其相應(yīng)的底物呈現(xiàn)一系列的化學(xué)反應(yīng)，形成在顯微鏡下可見到的反應(yīng)產(chǎn)物。對細(xì)胞內(nèi)的各種成分進(jìn)行定性、定

3、位、定量定性、定位、定量研究。（特異性）研究。（特異性）常用方法及原理：常用方法及原理：一一金屬金屬-金屬鹽沉淀法金屬鹽沉淀法原理原理利用金、銀、銅、鐵、鈷等金屬化合物與細(xì)胞化學(xué)成分反應(yīng)過程中生成有色沉淀。利用金、銀、銅、鐵、鈷等金屬化合物與細(xì)胞化學(xué)成分反應(yīng)過程中生成有色沉淀。二二偶氮偶聯(lián)法偶氮偶聯(lián)法原理原理用人工的酶底物，在酶的作用下產(chǎn)生分解產(chǎn)物，后者與重氮鹽結(jié)合，引起偶氮偶聯(lián)法反應(yīng)，形成不溶性偶氮色素。用人工的酶底物，在酶的作用下產(chǎn)生分解產(chǎn)物，后者與重氮鹽結(jié)合，引起偶氮偶聯(lián)法反應(yīng)，形成不溶性偶氮色素。三三過碘酸過碘酸Schiff氏劑反應(yīng)氏劑反應(yīng)原理原理四四多糖（糖原）多糖（糖原）+過碘酸過

4、碘酸醛基醛基+Schiff氏劑氏劑紫紅色化合物紫紅色化合物顯示細(xì)胞內(nèi)糖類為顯示細(xì)胞內(nèi)糖類為PAS反應(yīng)反應(yīng)顯示細(xì)胞核內(nèi)為顯示細(xì)胞核內(nèi)為Feulgen反應(yīng)反應(yīng)第2頁/共34頁五五色素形成法顯示酶定位的方法色素形成法顯示酶定位的方法某化學(xué)物質(zhì)在酶作用下在細(xì)胞局部形成色素沉淀，包括四唑鹽法、某化學(xué)物質(zhì)在酶作用下在細(xì)胞局部形成色素沉淀，包括四唑鹽法、聯(lián)苯胺色素法、黑色素形成法等。其中四唑鹽法用于定性各種氧聯(lián)苯胺色素法、黑色素形成法等。其中四唑鹽法用于定性各種氧化還原酶、多種脫氫酶、轉(zhuǎn)移酶等?；€原酶、多種脫氫酶、轉(zhuǎn)移酶等。還有脫氫酶顯示法、底物標(biāo)記法、熒光染色與免疫熒光法、酶標(biāo)抗還有脫氫酶顯示法、底物標(biāo)

5、記法、熒光染色與免疫熒光法、酶標(biāo)抗體法等。體法等。具體幾項(xiàng)細(xì)胞化學(xué)技術(shù)簡介：具體幾項(xiàng)細(xì)胞化學(xué)技術(shù)簡介：（一）。（一）。孚孚爾更反應(yīng)顯示爾更反應(yīng)顯示DNA方法方法(Feulgen)用弱酸（用弱酸（!NHCL）水解析飽和中）水解析飽和中DNA，打開嘌呤鹼基和脫氧核糖，打開嘌呤鹼基和脫氧核糖核酸連接的雙鏈，釋放出核酸連接的雙鏈，釋放出醛基醛基，與，與Schiff試劑試劑結(jié)合結(jié)合紫紅色化合物紫紅色化合物。用顯微分光光度計(jì)定量分析。用顯微分光光度計(jì)定量分析。（二）。（二）。甲綠甲綠派郎寧顯示派郎寧顯示DNA和和RNA甲綠染甲綠染DNA，派郎寧染，派郎寧染RNA，它們并不是化學(xué)作用，而是與兩種，它們并不是

6、化學(xué)作用，而是與兩種核酸的聚合程度有關(guān)。核酸的聚合程度有關(guān)。結(jié)果結(jié)果細(xì)胞核的細(xì)胞核的DNA綠色綠色蘭綠色蘭綠色，核仁和胞質(zhì)的，核仁和胞質(zhì)的RNA呈紅色呈紅色。（三）。（三）。丫叮橙（丫叮橙（AO）熒光染色顯示）熒光染色顯示DNA和和RNAAO熒光染料與熒光染料與多聚體的多聚體的DNA和和RNA具有親和力。結(jié)果具有親和力。結(jié)果細(xì)胞核的細(xì)胞核的DNA亮綠色亮綠色黃綠黃綠色熒光色熒光，核仁和胞質(zhì)的，核仁和胞質(zhì)的RNA呈紅色熒光呈紅色熒光。第3頁/共34頁（四）。（四）。多糖的顯示法多糖的顯示法過碘酸雪夫（過碘酸雪夫（Schiff）氏劑反應(yīng)氏劑反應(yīng)多糖（糖原）多糖（糖原）+過碘酸過碘酸醛基醛基+Sch

7、iff氏劑氏劑紫紅紫紅色化合物色化合物（五）。（五）。酶的顯示酶的顯示1堿性磷酸酶堿性磷酸酶的顯示（鈣的顯示（鈣-鈷法）鈷法）用磷酸脂為底物，被堿性磷酸酶水解后釋放出磷用磷酸脂為底物，被堿性磷酸酶水解后釋放出磷酸基，在酸基，在pH9。29。8條件下，磷酸基與鈣形條件下，磷酸基與鈣形成磷酸鈣（無色）成磷酸鈣（無色）+硝酸鈷硝酸鈷磷酸鈷（無色）磷酸鈷（無色）+黃黃色硫化胺色硫化胺硫化胺鈷（黑色）硫化胺鈷（黑色）結(jié)果結(jié)果堿性磷酸酶成淺灰、灰黃、灰黑色堿性磷酸酶成淺灰、灰黃、灰黑色。色深者。色深者表示酶多。對照組無反應(yīng)。表示酶多。對照組無反應(yīng)。第4頁/共34頁2三磷酸腺苷酶（三磷酸腺苷酶（ATPase

8、）ATP酶使酶使ATPADP,釋放磷酸基釋放磷酸基+硝酸鉛硝酸鉛磷酸鉛（黑色）磷酸鉛（黑色）結(jié)果結(jié)果ATP酶呈棕黑色酶呈棕黑色沉淀，色深者表示酶多。沉淀，色深者表示酶多。對照組無反應(yīng)。對照組無反應(yīng)。3葡萄糖葡萄糖-6-磷酸酶顯示法（磷酸酶顯示法（G-6-Pase）葡萄糖葡萄糖-6-磷酸酶作用葡萄糖磷酸酶作用葡萄糖-6-磷酸酶鈉（鉀）磷酸酶鈉（鉀）釋放磷酸基釋放磷酸基+硝酸鉛硝酸鉛磷酸鉛（黑色）磷酸鉛（黑色）結(jié)果結(jié)果G-6-P酶呈棕黑色酶呈棕黑色沉淀，色深者表示酶多。沉淀，色深者表示酶多。對照組無反應(yīng)。對照組無反應(yīng)。第5頁/共34頁ATPase第6頁/共34頁ATPase第7頁/共34頁ATPa

9、se第8頁/共34頁G-6-Pase第9頁/共34頁G-6-Pase第10頁/共34頁G-6-Pase第11頁/共34頁G-6-Pase第12頁/共34頁45-核苷酸酶的顯示法核苷酸酶的顯示法（5-Nucleoyidase）此酶作用于此酶作用于5-核苷酸、水解嘌呤核苷酸或嘧啶核苷酸第五位碳原子的磷酸分子，釋放磷酸基核苷酸、水解嘌呤核苷酸或嘧啶核苷酸第五位碳原子的磷酸分子，釋放磷酸基+硝酸鉛硝酸鉛磷酸鉛（黑色）。磷酸鉛（黑色）。結(jié)果結(jié)果5-核苷酸酶呈棕黑色核苷酸酶呈棕黑色沉淀，色深者表示酶多。對照組無反應(yīng)。沉淀，色深者表示酶多。對照組無反應(yīng)。免疫細(xì)胞化學(xué)術(shù)免疫細(xì)胞化學(xué)術(shù)應(yīng)用抗原與抗體結(jié)合的免疫學(xué)

10、原理，檢測細(xì)胞內(nèi)的多肽、蛋白質(zhì)及膜抗原和受體等大分子物質(zhì)的存在與分布。應(yīng)用抗原與抗體結(jié)合的免疫學(xué)原理，檢測細(xì)胞內(nèi)的多肽、蛋白質(zhì)及膜抗原和受體等大分子物質(zhì)的存在與分布。其特點(diǎn)是特異性強(qiáng)、敏感性高、進(jìn)展迅速，應(yīng)用廣泛。其特點(diǎn)是特異性強(qiáng)、敏感性高、進(jìn)展迅速，應(yīng)用廣泛。程程序：序：1抗原（提取動物某些肽類或蛋白質(zhì)）抗原（提取動物某些肽類或蛋白質(zhì)）注入另一動物體內(nèi)注入另一動物體內(nèi)產(chǎn)生抗體（產(chǎn)生抗體（Ig）血清分離提取抗體血清分離提取抗體2抗體標(biāo)記抗體標(biāo)記抗體抗體+熒光素（異硫氰酸熒光素）熒光素（異硫氰酸熒光素）與相應(yīng)抗原結(jié)合呈與相應(yīng)抗原結(jié)合呈黃綠色熒光黃綠色熒光抗體抗體+辣根過氧化物酶（辣根過氧化物酶（

11、HRP）與相應(yīng)抗原結(jié)合呈與相應(yīng)抗原結(jié)合呈棕紅色熒光棕紅色熒光第13頁/共34頁方方法：法：（1）直接法直接法抗原抗原抗體直接結(jié)合抗體直接結(jié)合簡便、迅速，簡便、迅速，但是敏感性較低。但是敏感性較低。（2）間接法間接法一抗體（作為抗原）一抗體（作為抗原）注入物體內(nèi)注入物體內(nèi)產(chǎn)生第二產(chǎn)生第二抗體抗體常用過氧化物酶常用過氧化物酶抗過氧化物酶復(fù)合物法（抗過氧化物酶復(fù)合物法（PAP法）。法）。較復(fù)雜，敏感性高較復(fù)雜，敏感性高（3）新進(jìn)展新進(jìn)展親合素（卵白素）親合素（卵白素）生物素法（生物素法（LAB法）法）橋連親合素（卵白素）橋連親合素（卵白素）生物素法（生物素法（BAB法）法）親合素親合素生物素生物素過

12、氧化物酶復(fù)合物法（過氧化物酶復(fù)合物法（ABC法）法）(市場市場商品商品)第14頁/共34頁第15頁/共34頁第16頁/共34頁組織培養(yǎng)術(shù)組織培養(yǎng)術(shù):體外研究活細(xì)胞或組織的有價(jià)值的手段體外研究活細(xì)胞或組織的有價(jià)值的手段無菌條件下，取活組織、活細(xì)胞（或傳代培養(yǎng)的細(xì)胞無菌條件下，取活組織、活細(xì)胞（或傳代培養(yǎng)的細(xì)胞株）株）培養(yǎng)液（天然或人工合成），在一定溫度、培養(yǎng)液（天然或人工合成），在一定溫度、O2、CO2、Ph培養(yǎng)（加某種受試因素）培養(yǎng)（加某種受試因素）倒倒置顯微鏡下觀察：細(xì)胞活組織的增殖、分化、運(yùn)動、置顯微鏡下觀察：細(xì)胞活組織的增殖、分化、運(yùn)動、吞噬等?？蛇B續(xù)錄像觀察。吞噬等?？蛇B續(xù)錄像觀察。第

13、17頁/共34頁 正常培養(yǎng)細(xì)胞正常培養(yǎng)細(xì)胞 第18頁/共34頁中藥組細(xì)胞中藥組細(xì)胞 第19頁/共34頁西藥組細(xì)胞西藥組細(xì)胞第20頁/共34頁對照組細(xì)胞對照組細(xì)胞第21頁/共34頁中藥組細(xì)胞中藥組細(xì)胞第22頁/共34頁原位雜交術(shù)原位雜交術(shù):即核酸分子雜交組織化學(xué)術(shù)。即核酸分子雜交組織化學(xué)術(shù)?；驹恚簝蓷l核苷酸單鏈片段，在適宜的條件下，通過基本原理：兩條核苷酸單鏈片段，在適宜的條件下，通過氫鍵結(jié)合，形成氫鍵結(jié)合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或或RNA-RNA雙鏈分雙鏈分子的特點(diǎn)，應(yīng)用帶有標(biāo)記的（有放射性同位素，如子的特點(diǎn)，應(yīng)用帶有標(biāo)記的（有放射性同位素，如3H、35S、32P、熒光素、生物

14、素、地高辛等放射性物質(zhì)）、熒光素、生物素、地高辛等放射性物質(zhì)）DNA或或RNA片段作為片段作為核酸探針核酸探針，與組織切片或細(xì)胞內(nèi)待測核酸（，與組織切片或細(xì)胞內(nèi)待測核酸（RNA或或DNA）片段進(jìn)行雜交片段進(jìn)行雜交，然后可用放射自顯影等方法予以顯示。，然后可用放射自顯影等方法予以顯示。在光鏡或電鏡下觀察目的在光鏡或電鏡下觀察目的mRNA或或DNA的存在與定位。用此的存在與定位。用此技術(shù)可在原位研究細(xì)胞合成某種多肽或蛋白質(zhì)的基因表達(dá)。技術(shù)可在原位研究細(xì)胞合成某種多肽或蛋白質(zhì)的基因表達(dá)。此方法有極高的敏感性和特異性，可進(jìn)一步從分子水平探討此方法有極高的敏感性和特異性，可進(jìn)一步從分子水平探討細(xì)胞的功能

15、表達(dá)及其調(diào)控機(jī)制，已成為當(dāng)今細(xì)胞生物學(xué)、分細(xì)胞的功能表達(dá)及其調(diào)控機(jī)制，已成為當(dāng)今細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)研究的重要手段。子生物學(xué)研究的重要手段。第23頁/共34頁放射自顯影術(shù)放射自顯影術(shù): 是通過活細(xì)胞對放射性物質(zhì)的特異性攝入，以顯示該細(xì)胞的是通過活細(xì)胞對放射性物質(zhì)的特異性攝入，以顯示該細(xì)胞的功能狀態(tài)、或該物質(zhì)在組織或細(xì)胞內(nèi)的代謝過程。將放射性功能狀態(tài)、或該物質(zhì)在組織或細(xì)胞內(nèi)的代謝過程。將放射性同位素或放射性同位素標(biāo)記的物質(zhì)注入體內(nèi)，間隔一定時間同位素或放射性同位素標(biāo)記的物質(zhì)注入體內(nèi)，間隔一定時間后取材、制備切片，并在其上面涂以感光材料（感光乳膠或后取材、制備切片，并在其上面涂以感光材料（感光乳

16、膠或貼以照相底片），置暗處暴光，再顯影、定影。結(jié)果，在放貼以照相底片），置暗處暴光，再顯影、定影。結(jié)果，在放射性同位素或其標(biāo)記物存在的部位，溴化銀被還原為黑色的射性同位素或其標(biāo)記物存在的部位，溴化銀被還原為黑色的微細(xì)顆粒，可在光鏡或電鏡下觀察，從而獲知被檢物質(zhì)在組微細(xì)顆粒，可在光鏡或電鏡下觀察，從而獲知被檢物質(zhì)在組織或細(xì)胞內(nèi)的分布及相對含量。在注入同位素標(biāo)記物后，如織或細(xì)胞內(nèi)的分布及相對含量。在注入同位素標(biāo)記物后，如果有規(guī)律地在若干時間段取材，則可以觀察到被檢物質(zhì)的動果有規(guī)律地在若干時間段取材，則可以觀察到被檢物質(zhì)的動態(tài)分布及變化過程，如將態(tài)分布及變化過程，如將131I注入體內(nèi)可以觀察碘在甲狀

17、腺注入體內(nèi)可以觀察碘在甲狀腺濾泡內(nèi)的代謝情況；將濾泡內(nèi)的代謝情況；將3H標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷注入體內(nèi)，就標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷注入體內(nèi)，就能研究蛋白質(zhì)或核酸在組織、細(xì)胞內(nèi)的代謝過程。能研究蛋白質(zhì)或核酸在組織、細(xì)胞內(nèi)的代謝過程。第24頁/共34頁組織工程組織工程:是用細(xì)胞培養(yǎng)術(shù)在體外模擬構(gòu)建機(jī)體組織或器官的技術(shù)。是用細(xì)胞培養(yǎng)術(shù)在體外模擬構(gòu)建機(jī)體組織或器官的技術(shù)。組織工程主要包括以下四方面：組織工程主要包括以下四方面：獲取生長旺盛的細(xì)胞獲取生長旺盛的細(xì)胞,即種子細(xì)胞。準(zhǔn)備細(xì)胞外基質(zhì)，即種子細(xì)胞。準(zhǔn)備細(xì)胞外基質(zhì)，包括生物材料包括生物材料(如牛膠原如牛膠原)及無毒、可被機(jī)體吸收的人工及無毒、可被機(jī)體吸收的人

18、工合成高分子材料。構(gòu)建組織或器官，即有目的地把種合成高分子材料。構(gòu)建組織或器官，即有目的地把種子細(xì)胞置于細(xì)胞外基質(zhì)中進(jìn)行三維培養(yǎng)，并形成所需要子細(xì)胞置于細(xì)胞外基質(zhì)中進(jìn)行三維培養(yǎng)，并形成所需要的形狀。將構(gòu)建物移植機(jī)體。目前正在研究構(gòu)建的組的形狀。將構(gòu)建物移植機(jī)體。目前正在研究構(gòu)建的組織器官主要有皮膚、軟骨、骨、肌腱、骨骼肌、血管及織器官主要有皮膚、軟骨、骨、肌腱、骨骼肌、血管及角膜等；其中以組織工程皮膚較為成功并已應(yīng)用于臨角膜等；其中以組織工程皮膚較為成功并已應(yīng)用于臨床治療燒傷、皮膚靜脈性潰瘍等疾病。床治療燒傷、皮膚靜脈性潰瘍等疾病。第25頁/共34頁軟骨組織工程研究進(jìn)展軟骨組織工程研究進(jìn)展實(shí)驗(yàn)

19、中的組織工程實(shí)驗(yàn)中的組織工程“耳耳” CaoYL，etal:Transplantationofchondrocytesutilizingapolymer-cellconstructtoproducetissueengineeredcartilageintheshapeofahumanear PlasticReconstrSurg,1977,100:297 第26頁/共34頁第27頁/共34頁實(shí)驗(yàn)中的組織工程實(shí)驗(yàn)中的組織工程“耳耳”制備程序制備程序。第28頁/共34頁5形態(tài)計(jì)量術(shù)形態(tài)計(jì)量術(shù)形態(tài)計(jì)量術(shù)形態(tài)計(jì)量術(shù)是研究組織和細(xì)胞內(nèi)各種有形成分的數(shù)量、是研究組織和細(xì)胞內(nèi)各種有形成分的數(shù)量、體積、表面積

20、等項(xiàng)的絕對或相對值的方法。研究機(jī)體某體積、表面積等項(xiàng)的絕對或相對值的方法。研究機(jī)體某些結(jié)構(gòu)的立體數(shù)值的科學(xué)，稱為些結(jié)構(gòu)的立體數(shù)值的科學(xué)，稱為體視學(xué)體視學(xué)數(shù)值以數(shù)值以“量量”的的概念進(jìn)一步闡述了結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系及其病理狀態(tài)下發(fā)生概念進(jìn)一步闡述了結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系及其病理狀態(tài)下發(fā)生的變化。目前常用的精密定量方法有以下幾種：的變化。目前常用的精密定量方法有以下幾種：（1）顯微分光光度術(shù)顯微分光光度術(shù)顯微分光光度術(shù)是顯微鏡技術(shù)與分光光度技術(shù)的結(jié)合，顯微分光光度術(shù)是顯微鏡技術(shù)與分光光度技術(shù)的結(jié)合，可測出細(xì)胞內(nèi)各種化學(xué)成分的含量，如測定蛋白質(zhì)、酶可測出細(xì)胞內(nèi)各種化學(xué)成分的含量，如測定蛋白質(zhì)、酶、脂類、糖及、脂類、糖及DNA與與RNA等含量。等含量。第29頁/共34頁（2）顯微熒光光度術(shù)顯微熒光光度術(shù)顯微熒光光度術(shù)顯微熒光光度術(shù)是利用對細(xì)胞內(nèi)原有發(fā)熒光的物質(zhì)，是利用對細(xì)胞內(nèi)原有發(fā)熒光的物質(zhì)，或?qū)?xì)胞內(nèi)各種化學(xué)成分用不同熒光素標(biāo)記