實驗5血液葡萄糖的測定（谷風(fēng)課堂）

1、 實驗五實驗五 血液葡萄糖的測定血液葡萄糖的測定劉曼劉曼TEL-mail：manna_1聽雨書屋B光度測定法的原理及應(yīng)用光度測定法的原理及應(yīng)用 光度法光度法是利用某一物質(zhì)的溶液是利用某一物質(zhì)的溶液吸收某一波吸收某一波段光的程度段光的程度來測知該物質(zhì)在來測知該物質(zhì)在溶液中的濃度溶液中的濃度。2聽雨書屋B光度法的原理光度法的原理 1.1.蘭伯特蘭伯特比爾定律比爾定律蘭伯特蘭伯特(Lambert) (Lambert) 闡明了透過光線的強度闡明了透過光線的強度(I)(I)和吸收層厚度和吸收層厚度(L)(L)的關(guān)系。的關(guān)系。I=I010-KLI=I010-KC比爾比爾(Beer

2、)(Beer)又提出了又提出了透過光線的強度透過光線的強度(I)和吸收物濃度和吸收物濃度(C)(C)之間也具有類似的關(guān)系。之間也具有類似的關(guān)系。 二者的結(jié)合稱為蘭伯特二者的結(jié)合稱為蘭伯特比爾定律，其數(shù)學(xué)表達(dá)式為比爾定律，其數(shù)學(xué)表達(dá)式為： I=I010-KCL log（I0/I)= KCL L3聽雨書屋B蘭伯特蘭伯特比爾定律數(shù)學(xué)表達(dá)式比爾定律數(shù)學(xué)表達(dá)式 ODlg（I0/I)= KCL 式中式中OD：光密度；描述溶液對光的吸收程度；：光密度；描述溶液對光的吸收程度； L：液層厚度：液層厚度(光程長度光程長度)，通常以，通常以cm為單位；為單位； c：溶液的濃度，單位：溶液的濃度，單位gL K: 吸

3、光系數(shù)，單位吸光系數(shù)，單位Lgcm ； 或或: OD lg（I0/I)= CL L：液層厚度：液層厚度(光程長度光程長度)，為，為1cm； c：溶液的摩爾濃度，單位：溶液的摩爾濃度，單位molL； ：摩爾吸光系數(shù)，單位：摩爾吸光系數(shù)，單位Lmolcm K與與的關(guān)系為：的關(guān)系為： K =/M （M為摩爾質(zhì)量）為摩爾質(zhì)量） 4聽雨書屋B2.2.摩爾吸光系數(shù)摩爾吸光系數(shù)的討論的討論（1 1）在數(shù)值上等于濃度為在數(shù)值上等于濃度為1mol/L、液層厚度為、液層厚度為1cm時該溶時該溶液在某一波長下的吸光度。液在某一波長下的吸光度。（2 2）吸收物質(zhì)在一定波長和溶劑條件下的）吸收物質(zhì)在一定波長和溶劑條件下

4、的特征常數(shù)特征常數(shù)；不隨；不隨濃度濃度c c和光程長度和光程長度L L的改變而改變。在溫度和波長等條件一定的改變而改變。在溫度和波長等條件一定時，時，僅與吸收物質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)，與待測物濃度無關(guān)；僅與吸收物質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)，與待測物濃度無關(guān)；（3 3）可作為定性鑒定的參數(shù)；）可作為定性鑒定的參數(shù)；5聽雨書屋B光度法的計算光度法的計算 OD標(biāo)標(biāo)KC標(biāo)標(biāo)L OD測測 KC測測LOD標(biāo)標(biāo)KC標(biāo)標(biāo)LOD測測 KC測測L(1) 計算法（計算法（標(biāo)準(zhǔn)品法測定未知樣品含量標(biāo)準(zhǔn)品法測定未知樣品含量）（2) 標(biāo)準(zhǔn)曲線法標(biāo)準(zhǔn)曲線法C測=OD測OD標(biāo)C標(biāo)6聽雨書屋B0.575光源單色器吸收池檢測器顯示分光光度計的構(gòu)

5、造分光光度計的構(gòu)造7聽雨書屋B1 1）預(yù)熱儀器：預(yù)熱儀器：為使測定穩(wěn)定，為使測定穩(wěn)定，將電源開關(guān)打開，使儀器預(yù)熱將電源開關(guān)打開，使儀器預(yù)熱20min20min，為了防止光電管疲勞，不要連續(xù)光照。為了防止光電管疲勞，不要連續(xù)光照。預(yù)熱儀器時和預(yù)熱儀器時和在不測定時應(yīng)將比色皿在不測定時應(yīng)將比色皿暗箱蓋打開，使光路切斷。暗箱蓋打開，使光路切斷。2 2）選定波長：選定波長：根據(jù)實驗要求，轉(zhuǎn)動波長調(diào)節(jié)器，使指針指示根據(jù)實驗要求，轉(zhuǎn)動波長調(diào)節(jié)器，使指針指示所需要的單色光波長。所需要的單色光波長。3)3)加樣：比色杯中加入空白及待測樣品，并放入分光光度計中，加樣：比色杯中加入空白及待測樣品，并放入分光光度計

6、中，注意：加入樣品量不超過比色杯體積的注意：加入樣品量不超過比色杯體積的2/32/3。且比色杯放入儀。且比色杯放入儀器前，要將外壁擦干凈。器前，要將外壁擦干凈?？瞻讓φ展芸瞻讓φ展? 1，標(biāo)準(zhǔn)管，標(biāo)準(zhǔn)管2 2，測定管，測定管3 3分光光度計的使用分光光度計的使用8聽雨書屋B4 4）調(diào)模式為）調(diào)模式為“透射比透射比”：對空白對照進(jìn)行調(diào)：對空白對照進(jìn)行調(diào)“0”0”（開蓋）和（開蓋）和調(diào)調(diào)“100”100”（閉蓋）。（閉蓋）。5 5）調(diào)模式為）調(diào)模式為“吸光度吸光度”：將儀表上：將儀表上“透光率透光率T”T”調(diào)至調(diào)至“吸光率吸光率A”A”，輕輕拉動比色皿座架拉桿，使有色溶液進(jìn)入光路，此，輕輕拉動比色

7、皿座架拉桿，使有色溶液進(jìn)入光路，此時表頭指針?biāo)緸樵撚猩芤旱奈舛葧r表頭指針?biāo)緸樵撚猩芤旱奈舛萇DOD。讀數(shù)后，打開比。讀數(shù)后，打開比色皿暗箱蓋。色皿暗箱蓋。6 6）關(guān)機：實驗完畢，將比色皿取出洗凈，放在濾紙上涼干。）關(guān)機：實驗完畢，將比色皿取出洗凈，放在濾紙上涼干。關(guān)閉儀器。關(guān)閉儀器。9聽雨書屋B 注意事項注意事項1 1）為了防止光電管疲勞。為了防止光電管疲勞。不測定時必須將比色皿暗箱蓋不測定時必須將比色皿暗箱蓋打開打開，使光路切斷，以延長光電管使用壽命。，使光路切斷，以延長光電管使用壽命。2 2）比色皿的使用方法：）比色皿的使用方法：拿比色皿時，手指只能捏住比色皿的拿比色皿時，手指

8、只能捏住比色皿的毛玻璃面毛玻璃面，不要，不要碰比色皿的透光面，以免沾污碰比色皿的透光面，以免沾污。測定有色溶液吸光度時，一定要用有色溶液洗比色皿測定有色溶液吸光度時，一定要用有色溶液洗比色皿內(nèi)壁內(nèi)壁幾次幾次，以免改變有色溶液的濃度。另外，在測定一，以免改變有色溶液的濃度。另外，在測定一系列溶液的吸光度時，通常都按由稀到濃的順序測定，系列溶液的吸光度時，通常都按由稀到濃的順序測定，以減小測量誤差。以減小測量誤差。10聽雨書屋B比色皿外壁的水用擦鏡紙或細(xì)軟的吸水紙吸干，以保護比色皿外壁的水用擦鏡紙或細(xì)軟的吸水紙吸干，以保護透光面。透光面。每次做完實驗時，應(yīng)立即洗凈比色皿。每次做完實驗時，應(yīng)立即洗凈

9、比色皿。清洗比色皿時，一般先用水沖洗，再用蒸餾水洗凈。清洗比色皿時，一般先用水沖洗，再用蒸餾水洗凈。 不能用堿溶液或氧化性強的洗滌液洗比色皿，以免損壞。不能用堿溶液或氧化性強的洗滌液洗比色皿，以免損壞。也不能用毛刷清洗比色皿，以免損傷它的透光面。也不能用毛刷清洗比色皿，以免損傷它的透光面。11聽雨書屋B實驗原理實驗原理血糖：指血液中的單糖（葡萄糖）血糖：指血液中的單糖（葡萄糖） 葡萄糖是一種多羥基的醛類化合物。其醛基具有還原性，與堿性銅試劑混合加熱，葡萄糖中的醛基被氧化成羧基，而銅試劑中的二價銅，被還原成磚紅色氧化亞銅而沉淀。 氧化亞銅可使磷鉬酸還原生成鉬藍(lán)，使溶液呈藍(lán)色。其生成藍(lán)色的深度與血

10、濾液中葡萄糖濃度成正比。選用顏色深淺較接近于測定管的標(biāo)準(zhǔn)管一同比色，即可求出測定管中葡萄糖的含量。 福林-吳憲氏法測定血糖是在特制福林-吳憲血糖管（用前不需刷洗，要保持內(nèi)壁干燥）中進(jìn)行。該血糖管于4mL容量處，管頸縮小成一細(xì)管狀，這樣可以減少在煮沸時管內(nèi)液體與空氣的接觸，以避免產(chǎn)生的氧化亞銅再氧化。12聽雨書屋B葡萄糖葡萄糖Cu2+葡萄糖酸葡萄糖酸Cu2O磷鉬酸磷鉬酸鉬藍(lán)鉬藍(lán) Cu2+全血無蛋白濾液全血無蛋白濾液 葡萄糖葡萄糖 堿性銅試劑堿性銅試劑 Cu(OH) 2磷鉬酸試劑磷鉬酸試劑 磷鉬酸磷鉬酸13聽雨書屋B操作步驟操作步驟 （1）用鎢酸法制備）用鎢酸法制備1：10全血無蛋白濾液全血無蛋白

11、濾液 水水 1.4 ml 全血全血 0.2 ml 2/3N硫酸硫酸 0.2 ml（隨加隨搖）（隨加隨搖） 10%鎢酸鈉鎢酸鈉 0.2 ml（隨加隨搖）（隨加隨搖） 按順序加入按順序加入離心管離心管，混勻。靜置，混勻。靜置5min,2500rpm離心離心10min 。14聽雨書屋B （2）?。┤?支支血糖管血糖管操作操作空白管空白管低濃度標(biāo)準(zhǔn)管低濃度標(biāo)準(zhǔn)管測定管測定管無蛋白血濾液無蛋白血濾液 1.0蒸餾水蒸餾水2.01.01.0標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖應(yīng)用液用液1.0堿性銅試劑堿性銅試劑2.02.02.0混勻混勻，沸水浴沸水浴中煮中煮8分鐘分鐘，用流動自來水冷卻，用流動自來水冷卻3分鐘分鐘（勿搖動

12、血糖管）（勿搖動血糖管）磷鉬酸磷鉬酸試劑試劑2.02.02.0混勻混勻后放置后放置2分鐘分鐘1:4磷鉬酸磷鉬酸溶溶液加至液加至25252515聽雨書屋B 1:4磷鉬酸溶液加至磷鉬酸溶液加至25刻度處刻度處后，用塑料袋片后，用塑料袋片蓋住管口顛倒混勻，用空白管調(diào)蓋住管口顛倒混勻，用空白管調(diào)“0”，在，在620nm波長波長處進(jìn)行比色，讀取各管光密度值。處進(jìn)行比色，讀取各管光密度值。16聽雨書屋B （3）按以下公式計算葡萄糖含量：）按以下公式計算葡萄糖含量： 兔正常血糖含量為：兔正常血糖含量為：135+/-12mg/100ml 測定管光密度值測定管光密度值 標(biāo)準(zhǔn)管光密度值標(biāo)準(zhǔn)管光密度值0.1 100

13、 0.1= 測定管光密度值測定管光密度值 標(biāo)準(zhǔn)管光密度值標(biāo)準(zhǔn)管光密度值 100 = 葡萄糖葡萄糖 mg/100ml17聽雨書屋B注意事項注意事項 加硫酸、鎢酸鈉時，要邊加邊搖勻加硫酸、鎢酸鈉時，要邊加邊搖勻 血糖管使用前不要刷，保持內(nèi)壁干燥！血糖管使用前不要刷，保持內(nèi)壁干燥！ 一定要等水沸后，再放入血糖管。準(zhǔn)確加熱一定要等水沸后，再放入血糖管。準(zhǔn)確加熱8min,8min,時間過時間過久，呈色較深，反之則淺，均影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。久，呈色較深，反之則淺，均影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。 煮沸血糖管時及之后冷卻時，均不可搖動煮沸血糖管時及之后冷卻時，均不可搖動血糖管血糖管，避免空，避免空氣進(jìn)入，使銅離子再被氧化

14、，降低實驗結(jié)果。氣進(jìn)入，使銅離子再被氧化，降低實驗結(jié)果。 先加磷鉬酸先加磷鉬酸2.0ml2.0ml，再加，再加1 1：4 4磷鉬酸至磷鉬酸至25ml25ml，加樣時注意，加樣時注意不要加錯。不要加錯。加入磷鉬酸后顯色不穩(wěn)定，應(yīng)迅速進(jìn)行比色。加入磷鉬酸后顯色不穩(wěn)定，應(yīng)迅速進(jìn)行比色。 分光光度計使用時需預(yù)熱分光光度計使用時需預(yù)熱2020分鐘以上。實驗過程中不要調(diào)分鐘以上。實驗過程中不要調(diào)節(jié)波長，造成其它組測定時出現(xiàn)錯誤。節(jié)波長，造成其它組測定時出現(xiàn)錯誤。 血濾液內(nèi)除葡萄糖外尚含有其他還原性物質(zhì)（約占血濾液內(nèi)除葡萄糖外尚含有其他還原性物質(zhì)（約占1020%1020%）。用此法測得之血糖含量較實際葡萄糖含量稍高。）。用此法測得之血糖含量較實際葡萄糖含量稍高。18聽雨書屋B 無蛋白濾液中的葡萄糖和堿性硫酸銅溶液無蛋白濾液中的葡萄糖和堿性硫酸銅溶液共熱反應(yīng)，共熱反應(yīng)，Cu2+即被葡萄