DNA甲基化檢測(cè)技術(shù)

1、 DNA甲基化檢測(cè)之甲基化檢測(cè)之甲基化特異性甲基化特異性HRM檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)技術(shù)（ Methylation-sensitive high resolution melting）內(nèi)容提示內(nèi)容提示 DNA甲基化的定義及生物學(xué)意義 MS-HRM檢測(cè)的原理 MS-HRM檢測(cè)的方法及步驟 MS-HRM檢測(cè)結(jié)果分析DNADNA甲基化的定義甲基化的定義在甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，DNA的CG兩個(gè)核苷酸的胞嘧啶被選擇性地添加甲基基團(tuán)的化學(xué)修飾現(xiàn)象。DNADNA甲基化的形式：甲基化的形式：DNA甲基化主要形成5-mC和少量的N6-甲基嘌呤（N6-mA）及7-甲基鳥嘌呤（7-mG） CpG CpG 島（島（CpG Isl

2、andCpG Island） 在基因組的某些區(qū)域中，通常是基因的啟動(dòng)子區(qū)域，5端非翻譯區(qū)和第一個(gè)外顯子區(qū)，CpG序列密度非常高，超過(guò)均值5倍以上，成為鳥嘌呤和胞嘧啶的富集區(qū)，稱之為CpG島(CpG Islands, CGIs)。u 正常結(jié)構(gòu)基因組中70% 90% 的獨(dú)立CpG 都被甲基化, 未甲基化的CpG 成簇地聚集形成CpG 島u 主要位于結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子和第一外顯子區(qū)域，約有60以上基因的啟動(dòng)子含有CpG島。 u 是結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子的核心序列和轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn) CpG island的功能：通過(guò)甲基化與去甲基化，調(diào)控下游基因的表達(dá) 基因表達(dá)的調(diào)控開(kāi)關(guān)DNA甲基化的生物學(xué)意義甲基化的生物學(xué)意義l 1

3、、轉(zhuǎn)錄抑制 基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化可影響轉(zhuǎn)錄激活因子和其識(shí)別序列 的結(jié)合.DNA甲基化的生物學(xué)意義甲基化的生物學(xué)意義l 2、影響基因表達(dá) 直接抑制基因表達(dá) 或甲基化的 CpG雙核苷酸序列可被甲基結(jié)合蛋 白家族 識(shí)別,而后者可通過(guò)吸引補(bǔ)充組蛋白去乙酞化酶 和組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶 等組蛋 白修飾蛋白質(zhì)來(lái)改變?nèi)旧|(zhì)的活性 ,以間接方式影響基因表達(dá).l 3、損傷與修復(fù) 一方面參與凋亡和修復(fù)的基因受DNA 甲基化調(diào)控,另一方面異常甲基化往往會(huì)導(dǎo)致DNA 的多種損傷。此外 ,甲基化還可能直接參與DNA損傷的識(shí)別和修復(fù)過(guò)程.l 4、其他 ： 甲基化還參與DNA 的復(fù)制和包裝及 DNA片段的轉(zhuǎn)座等?；蚪M甲基化的

4、特點(diǎn)：基因組甲基化的特點(diǎn)：u可逆性許多甲基化位點(diǎn)可以根據(jù)細(xì)胞活性的要求重新甲基化或去甲基化；u組織特異性不同的組織細(xì)胞具有不同的甲基化模式，為基因表達(dá)設(shè)定程序。u異常的甲基化可分為高甲基化和低甲基化 ，前者指正常組織中不發(fā)生甲基化的位點(diǎn)被甲基化 ，后者是指在正常組織中發(fā)生甲基化的位點(diǎn)去甲基化。DNADNA甲基化與腫瘤的關(guān)系甲基化與腫瘤的關(guān)系 腫瘤細(xì)胞的特征：n癌基因低甲基化 被激活；n抑癌基因高甲基化 被沉默 甲基化水平與腫瘤生物學(xué)特性密切相關(guān)，DNA甲基化水平越低，染色體越容易發(fā)生功能異常，腫瘤的浸潤(rùn)能力就越高，臨床分期也愈晚常見(jiàn)易被甲基化的抑癌基因與修復(fù)基因及其作用常見(jiàn)易被甲基化的抑癌基因

5、與修復(fù)基因及其作用 基因基因基因沉默對(duì)腫瘤的意義基因沉默對(duì)腫瘤的意義腫瘤類型腫瘤類型APC對(duì)細(xì)胞增殖、遷移、粘附、骨架重組及染色質(zhì)穩(wěn)定性失去調(diào)節(jié)作用乳腺癌、肺癌、食管癌、結(jié)腸癌、胃癌、胰、 肝癌BRCA1與DNA 修復(fù)與轉(zhuǎn)錄激活有關(guān)乳腺癌、卵巢癌 CDKN2A/p16周期素依賴性蛋白激酶抑制劑GIT 、頭與頸部瘤、NHL、肺癌 DAPK1鈣/鈣調(diào)素-依賴的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化酶; 凋亡抑制肺癌E-cadherin增強(qiáng)增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移乳腺癌 、甲狀腺癌、胃癌ER激素抵抗乳腺癌、前列腺癌GSTP1失去對(duì)致癌物活性代謝產(chǎn)物的解毒作用前列腺癌、乳腺癌、腎癌hMLH1缺損DNA錯(cuò)配修復(fù),基因點(diǎn)突變結(jié)腸癌

6、、胃癌、子宮內(nèi)膜瘤、卵巢癌MGMTp53-相關(guān)基因，與DNA 修復(fù)及耐藥性有關(guān)肺癌、腦瘤P15細(xì)胞的過(guò)度激活與增殖非白血性白血病、淋巴瘤、鱗狀細(xì)胞癌、肺癌 RASSF1A失去了對(duì)G1/S負(fù)調(diào)控抑制作用肺癌、乳腺癌、卵巢癌、腎癌、鼻咽癌Rb不能抑制DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂必需的基因轉(zhuǎn)錄成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)(細(xì)胞)瘤VHL錯(cuò)誤的降解RNA結(jié)合蛋白質(zhì)，改變RNA穩(wěn)定性腎細(xì)胞癌縮寫: APC, adenomatous polyposis coli; BRCA1, breast cancer 1; CDKN2A/p16, cyclin-dependent kinase 2A; DAPK1, deat

7、h-associated protein kinase 1; ER, estrogen receptor; GSTP1, glutathione S-transferase Pi 1; hMLH1, Mut L homologue 1; MGMT, O-6 methylguanine-DNA methyltransferase; RASSF1A, Ras association domain family member 1; Rb, retinoblastoma; VHL, von Hippel-Lindau; GIT, gastrointestinal tract; NHL, non-Hod

8、gkins lymphoma.DNADNA甲基化與腫瘤的關(guān)系甲基化與腫瘤的關(guān)系 MGMT基因在許多腫瘤中被認(rèn)為是抗腫瘤藥物治療的預(yù)測(cè)標(biāo)記。MGMT啟動(dòng)子腫瘤特異性甲基化，可以抑制MGMT蛋白的活性，從而使得腫瘤細(xì)胞對(duì)烷化類的抗腫瘤藥物敏感，因而被廣泛用于腫瘤化療治療。 Figure： KaplanMeier Estimates of Overall Survival, According toMGMTPromoter Methylation Status.DNA DNA 甲基化的檢測(cè)方法甲基化的檢測(cè)方法DNA DNA 甲基化的檢測(cè)方法甲基化的檢測(cè)方法MS-HRMMS-HRM檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)技術(shù) 目

9、前，甲基化檢測(cè)的方法很多，例如甲基化特異性PCR，Northern印跡法、Western印跡法、免疫細(xì)胞化學(xué)等，這些檢測(cè)方法由于需要花費(fèi)大量時(shí)間，成本高等等，在臨床推廣應(yīng)用時(shí)均存在一定的困難。最新報(bào)道了一種基于熔解曲線的高分辨率熔解（High Resolution Melt，HRM）的新方法，為甲基化的檢測(cè)帶來(lái)了新的曙光。用HRM方法檢測(cè)MGMT啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)的甲基化狀態(tài)，可檢測(cè)低達(dá)0.1%的甲基化程度；并且可以根據(jù)已知甲基化程度的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品的甲基化百分比進(jìn)行測(cè)定。MS-HRMMS-HRM檢測(cè)技術(shù)原理檢測(cè)技術(shù)原理 采用重亞硫酸鹽處理DNA模板后，在非CpG島位置設(shè)計(jì)一對(duì)針對(duì)經(jīng)亞硫酸氫鈉處

10、理后DNA鏈的引物，這對(duì)引物中間包含有意義的甲基化CpG島，一旦這些CpG島發(fā)生甲基化，胞嘧啶不發(fā)生變化，而未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶，樣品中的GC含量發(fā)生了變化，最終被轉(zhuǎn)化成了熔解曲線Tm值之間的差異。CpG位點(diǎn)在小的擴(kuò)增片段內(nèi)的相對(duì)位置也會(huì)對(duì)熔解峰的形狀產(chǎn)生影響，因此，根據(jù)Tm值和熔解峰的形狀可以檢測(cè)出樣本的甲基化位點(diǎn)和甲基化程度MS-HRMMS-HRM檢測(cè)方法及步驟檢測(cè)方法及步驟引物設(shè)計(jì)：引物需包含個(gè)CpG二核苷酸序列；CpG二核苷酸序列應(yīng)盡量靠近引物的端；引物的Tm值應(yīng)盡量接近，最好控制在內(nèi)；引物的端應(yīng)包含有個(gè)或多個(gè)T堿基，從而確保只有經(jīng)過(guò)重亞硫酸鹽修飾的DNA模板得到擴(kuò)增；引物不

11、能有二聚體存在；擴(kuò)增子的長(zhǎng)度盡量控制在100bp左右 MS-HRMMS-HRM檢測(cè)方法及步驟檢測(cè)方法及步驟引物設(shè)計(jì)： MS-HRMMS-HRM檢測(cè)方法及步驟檢測(cè)方法及步驟2. DNA樣本的準(zhǔn)備： 可使用新鮮組織或石蠟組織樣本，一般不使用血液樣本；3. 儀器選擇（一般可進(jìn)行HRM分析的儀器均可）：如LightCycler480 (Roche), RotorGene6000 (CorbettResearch), Applied Biosystems 7500 FAST real-time PCR system(Applied Biosystems), LightScanner System and

12、 the HR-1 instrument(Idaho Technologies). MS-HRMMS-HRM檢測(cè)方法及步驟檢測(cè)方法及步驟4. DNA樣本的甲基化修飾： 可使用FFPE Tissue Kit (QIAGEN) 對(duì)DNA甲基化修飾及回收；3. PCR擴(kuò)增：上樣體系PCR-HRM反應(yīng)程序 MS-HRMMS-HRM檢測(cè)方法及步驟檢測(cè)方法及步驟a. 上樣體系：反應(yīng)體系組分(20L)加入的體積（L）10PCR Buffer(15 mM mgcl2)2MgCl2 (25 mM)0.4dNTP（10 mM）0.520 Eva-green飽和染料1.010m Primers0.5+0.5Temp

13、late（5ng/L）1.0Taq酶(5U/L)0.2ddH2O14.3MS-HRMMS-HRM檢測(cè)方法及步驟檢測(cè)方法及步驟b. PCR-HRM反應(yīng)程序：過(guò)程溫度時(shí)間循環(huán)數(shù)cycles預(yù)變性955min1PCR9510s506015s7225s(收集熒光)HRM951min1401min651s95每秒檢測(cè)熒光25次冷卻4010s1MS-HRMMS-HRM檢測(cè)結(jié)果分析檢測(cè)結(jié)果分析MGMT甲基化檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖MS-HRMMS-HRM檢測(cè)結(jié)果分析檢測(cè)結(jié)果分析MS-HRMMS-HRM檢測(cè)結(jié)果分析檢測(cè)結(jié)果分析Figure 1 | The effect of the PCR annealing tem

14、perature on the sensitivity of the ATM MS-HRM assay. Thedilutions of methylated and unmethylated templates are indicated as follows: 100% methylated-red, 10%methylated-blue, 1% methylated-green and 0.1% methylated-brown and unmethylated-black. MS-HRMMS-HRM檢測(cè)結(jié)果分析檢測(cè)結(jié)果分析Figure 4. The MS-HRM assay for BNIP3 methylation. Results of the