雙黃連方藥抗病毒物質(zhì)基礎(chǔ)研究

1、雙黃連方藥抗病毒物質(zhì)基礎(chǔ)研究目的: 雙黃連方藥由金銀花、 連翹、黃芩配伍而成 , 是目前臨床治療呼吸道感 染性疾病的代表方劑之一 ,療效顯著,有三十多年臨床用藥歷史 ,在禽流感、 SARS 等烈性呼吸道傳染性疾病的治療中也發(fā)揮了重要作用 ,具有清熱解毒 ,清宣透散 之功, 現(xiàn)代藥理研究表明雙黃連方藥具有廣譜抗病毒和抗菌效果 , 但雙黃連的抗 病毒物質(zhì)基礎(chǔ)研究尚不夠充分 , 制約了該方藥的二次開發(fā) , 闡明該方藥的抗病毒 物質(zhì)基礎(chǔ)仍是雙黃連方藥繼續(xù)向前發(fā)展的關(guān)鍵所在。方法 :（1）高效液相色譜電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法全面分析雙黃連粉針劑及其各組成藥材提取物中化學(xué)成分 , 對其 進(jìn)行初步的定性分析 , 并

2、對其藥味來源進(jìn)行歸屬。雙黃連粉針為哈爾濱中藥二廠生產(chǎn) ,各組成藥材按 2005 版中國藥典中雙黃 連口服液工藝進(jìn)行提取 , 液質(zhì)聯(lián)用條件為 : 色譜柱 :Aglient Zorbax Extend C18 柱（50X 4.6 mm,1.8卩m）;流動(dòng)相:A （0.25%醋酸水溶液）-B （甲醇）梯度洗脫:0 min5 min （B:15%35% ,5 min 7 min （B:35% ,7 min 30 min （B:35% 100% ;流速:0.6 ml/mim進(jìn)樣量:5卩l(xiāng),檢測波長:350nm。質(zhì)譜條件：電噴霧電離 源（ESI源），碰撞能100V,干燥氣溫度350r ,干燥氣流速:11

3、L/min,霧化氣壓 力 40psi, 負(fù)離子掃描 , 掃描范圍 m/z 501000。將各供試液上機(jī)分析 , 對各色譜峰的質(zhì)譜信號進(jìn)行分析 , 對化合物進(jìn)行初步 定性。（2 優(yōu)選大孔樹脂對雙黃連方藥的組成藥材金銀花、 連翹進(jìn)行大孔樹脂分 離, 并對各提取分離部位化學(xué)成分進(jìn)行定性分析 , 對指標(biāo)成分進(jìn)行定量分析。（ 3 以陽性藥物利巴韋林注射液作為對照 , 對各提取分離部位進(jìn)行體外抗呼 吸道合胞病毒活性評價(jià) , 實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。藥物毒性實(shí)驗(yàn)方法 :Hela 細(xì)胞常規(guī)傳代 培養(yǎng),待長滿后用胰酶消化，含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液 以8X 10<sup>5&l

4、t;/sup>個(gè)/ml的細(xì)胞密度,加入96孔板中,每孔200卩1,37 C ,5%CO<sub>2</sub孵箱中培養(yǎng)24h,待細(xì)胞長成單層。吸出培養(yǎng)液，加入各濃度藥液200卩I,每個(gè)濃度8個(gè)復(fù)孔。正常對照只加入 等體積 2%小牛血清的細(xì)胞維持液。37C ,5%CO<sub>2</sub孵箱中培養(yǎng)，每24小時(shí)觀察細(xì)胞病變情況(CPE ,連續(xù)觀察72h,記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。72h后,將藥液吸出，每孔加入5 mg/mlMTT(用PBS 配制)200卩l(xiāng),37 C ,5%CO<sub>2</sub孵箱中孵育2h后，棄上清，每孔加入 DMSO200

5、I,室溫下振蕩混勻10min,在490nm下，酶聯(lián)免疫檢測儀測定吸光度值， 并計(jì)算細(xì)胞存活率。采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，Regression-probit回歸將藥物濃度與細(xì)胞存活率進(jìn)行回歸分析 , 計(jì)算細(xì)胞半數(shù)存活濃度 (TC₅₀) 。呼吸道合胞病毒( RSV) 毒力測定：采用TCID₅₀微量法，用Reed-Munch公式計(jì)算 TCID₅₀。藥物抗病毒實(shí)驗(yàn)方法 ： 藥物在無毒濃度范圍內(nèi) , 用含 2%小牛血清的細(xì)胞維持 液對藥物進(jìn)行倍比稀釋，加入病毒液使

6、病毒濃度為100TCID₅₀,混勻，陽性對照藥為利巴韋林注射液( 0.1 g/ml ), 用 2%細(xì)胞維持液稀釋 , 并加入病毒 液，使利巴韋林終濃度為100卩g/ml,病毒終濃度為100TCID₅₀,于 37C ,5%CO<sub>2</sub孵箱中孵育1h。已長成單層Hela細(xì)胞的96孔板，吸掉 培養(yǎng)液,每孔接種200卩l(xiāng)各濃度藥液與病毒的混合液，每個(gè)濃度8個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè) 陽性對照組，病毒對照組和正常對照組,37 C ,5%CO<sub>2</sub培養(yǎng)2h后，將

7、藥 物組和病毒組液體吸出 , 加入細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng) , 每日觀察 CPE。72h后將藥液吸出，每孔加入5 mg/ml MTT (用PBS配制)200卩1,37 C ,5%CO<sub>2</sub孵箱中孵育2h后,棄上清,每孔加入DMSO 20Q I,室溫下振蕩混勻10min,在490nm下，酶聯(lián)免疫檢測儀測定吸光度值。 并計(jì)算藥物對 病毒的抑制率。采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，Regression-probit回歸將藥物濃度與病毒抑制率進(jìn)行回歸分析，計(jì)算藥物的半數(shù)有效濃度IC₅₀。并計(jì)算治療指數(shù)TI。采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟

8、件，One-WayANOVA寸各藥物不同濃度組、陽性對照組、 病毒對照組、正常對照組間吸光度均數(shù)進(jìn)行方差分析及組間多重比較 , 確定各藥 物組間及其與對照組間病毒抑制率是否有顯著性差異。 （4）通過分析抗病毒活性 部位成分、對比其與雙黃連粉針中化學(xué)成分差異 ,尋找相關(guān)抗病毒物質(zhì)基礎(chǔ)。結(jié)果:（1）對雙黃連粉針及各藥材提取物中各色譜峰的質(zhì)譜信號進(jìn)行分析,推斷化合物分子量 , 通過標(biāo)準(zhǔn)品對照、 譜圖中碎片離子結(jié)構(gòu)分析及文獻(xiàn)查閱 , 從雙 黃連粉針中共檢測出 30個(gè)色譜峰,其中鑒定了 26個(gè)化學(xué)成分;從金銀花提取物中 檢測出21個(gè)色譜峰,鑒定了18個(gè)化學(xué)成分;從連翹提取物中檢測出 23個(gè)色譜峰, 鑒定

9、了11個(gè)化學(xué)成分;從黃芩提取物中檢測出 5個(gè)色譜峰,鑒定了4個(gè)化學(xué)成分 ; 從金銀花連翹合煎提取物中檢測出 24個(gè)色譜峰,鑒定了22個(gè)化學(xué)成分。 （2）通 過各譜圖間的比較 , 對雙黃連粉針中各色譜峰進(jìn)行藥味歸屬。雙黃連粉針總離子流圖中共檢測到 30 個(gè)色譜峰 , 其中 14 個(gè)峰來自金銀花 , 主要為綠原酸、異綠原酸及其同分異構(gòu)體等化合物 ;10 個(gè)峰來自連翹 ,主要為連 翹酯苷及其同分異構(gòu)體等化合物 ;5 個(gè)峰來自黃芩 , 主要為黃芩苷等黃酮類化合 物;另有 4 個(gè)峰從各藥味中找不到歸屬 , 推測可能與以下因素有關(guān) : 中藥材的化學(xué) 成分與產(chǎn)地及季節(jié)有一定的依賴關(guān)系 ,實(shí)驗(yàn)所用的 3個(gè)藥材

10、,與雙黃連粉針生產(chǎn)廠所用原料 , 雖然品種一致 , 但來源不同 , 因此在成分上可能存在差異 ; 是生產(chǎn)過程中化合物間的相互作用或分解等產(chǎn)生的新的化合物。對比金銀花提取物 , 連翹 提取物,及金銀花連翹合煎提取物的總離子流圖 , 發(fā)現(xiàn)金銀花單煎提取物中有 4 個(gè)綠原酸的同分異構(gòu)體 ,而金銀花連翹合煎只有 2 個(gè)綠原酸的同分異構(gòu)體 ,推測 可能是綠原酸在合煎條件下比單煎穩(wěn)定 , 連翹單煎提取物中的 3、4、5、6,12 號 峰在金銀花連翹合煎提取物中不明顯 , 說明金銀花連翹合煎與兩藥材單煎在物質(zhì) 基礎(chǔ)上存在一定差異。對比連翹提取物、金銀花連翹合煎提取物及雙黃連粉針的總離子流圖 , 發(fā)現(xiàn) 連翹提

11、取物中的 9,10 號峰在雙黃連粉針中消失 , 但在金銀花連翹合煎提取物中 能找到這兩個(gè)峰的歸屬 , 說明這兩個(gè)峰的消失應(yīng)該與雙黃連粉針進(jìn)一步的生產(chǎn)制 備工藝有關(guān)。兩個(gè)峰 M-H^- 。離子m/z均為639,推測其應(yīng)該是連翹酯苷及其同分異構(gòu)體B-hydroxyfosythiaside, 考察其分子結(jié)構(gòu)比連翹酯苷 A 多一個(gè)羥基 , 可能失去一 分子水并發(fā)生雙鍵還原反應(yīng)M+2H-H<sub>2v/sub>O-H<sup>-v/sup>而變成 m/z623,在雙黃連粉針中17號峰M-H<sup>-</

12、sup>離子m/z為623,為連翹酯苷A的同分異構(gòu)體，且從各單味藥中找不到歸屬，是否由連翹酯苷C反應(yīng)得來,需進(jìn) 一步驗(yàn)證 ; 雙黃連粉針中 6 號峰 M-H^- 為 m/z461, 響應(yīng)值較高 , 推測 其為連翹酯苷 E, 在連翹提取物中能找到對應(yīng)峰 , 但連翹提取物中的 m/z461 響應(yīng) 值較低,本研究認(rèn)為如果是連翹中已含有的連翹酯苷E,在雙黃連粉針中的響應(yīng)值不應(yīng)該明顯增大 , 考慮到連翹酯苷分子結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定 , 容易失去一個(gè)咖啡?；?M-H-162vsup>-v/sup>而得到連翹酯苷Em/z461,因此推測雙黃連粉針中的 m/

13、z461峰的顯著增大可能由連翹酯苷 A失去咖啡?；稹＃?）通過以上各譜圖間的對比分析及對各色譜峰的初步定性 , 可以看出雙黃連粉針是一個(gè)非常復(fù)雜 的化合物組群 , 其中許多化合物均以同系物或同分異構(gòu)體的形式存在 , 首次確定 了雙黃連粉針中綠原酸類化合物有 3 個(gè)單咖啡?？崴岬耐之悩?gòu)體 （4,7,8 號 峰）和 3 個(gè)雙咖啡酰奎尼酸的同分異構(gòu)體（ 17,18,22 號峰）; 首次檢測出雙黃連 粉針中同時(shí)存在著連翹酯苷 A（ m/z為623）的3個(gè)同分異構(gòu)體（13,17,18號峰）, 都有相同的碎片離子m/z 461,推測其由m/z623脫咖啡?；脕怼Ｆ渲?13和18號峰可以在單味連翹

14、提取物及金銀花連翹合煎提取物中找到歸屬，目前文獻(xiàn)報(bào)道的連翹中分子量為 624的苯乙醇苷只有連翹酯苷 A和阿克替苷 （ acteoside ）兩個(gè)（兩個(gè)化合物具有相同的母核和取代基 , 但取代基位置不同） 經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品對照，確定18號峰為連翹酯苷A,因此13號峰應(yīng)為阿克替苷。17號峰則 不能從上述組成藥材中找到歸屬，是否由連翹酯苷C反應(yīng)得來,需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn) 證。中藥理論認(rèn)為中藥中通常存在一類結(jié)構(gòu)類似的化合物 , 共同發(fā)揮藥效作用 , 從此實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以確認(rèn)中藥中確實(shí)存在著這樣的結(jié)構(gòu)類似的化合物群。 同時(shí)可以 看到全方化學(xué)成分絕非各單味藥材化學(xué)成分的簡單疊加 , 在生產(chǎn)過程中 , 受到工 藝條件、化合物

15、間相互作用等各種因素的影響 ,通常有新的化合物產(chǎn)生。在雙黃連粉針、金銀花提取物及金銀花連翹合煎提取物中均存在一個(gè)響應(yīng)值 很高的 m/z191 峰（1 號峰） , 經(jīng)理論推斷和標(biāo)準(zhǔn)品對照 , 證實(shí)其為奎尼酸 , 為首次 報(bào)道雙黃連粉針中存在奎尼酸 , 奎尼酸應(yīng)該不是來自綠原酸的水解 , 而是來源于 金銀花。（ 4）經(jīng)大孔樹脂分離 , 金銀花得到 3 個(gè)分離部位 A、B、C, 各部位成分基 本無重疊,其中A部位主要為綠原酸及其同分異構(gòu)體等成分;B部位主要為異綠原 酸及其同分異構(gòu)體等成分 ;C 部位分子量相對較大 , 尚未鑒定出為哪些成分。連翹得到3個(gè)分離部位A'、B'、C ,各部位

16、成分無重疊，其中A部位成分未能鑒定,B '部位主要為連翹酯苷及其同分異構(gòu)體、蘆丁等成分,C部位成分未能鑒定。（5）對各分離部位、黃芩精制物、雙黃連粉針等共10 個(gè)藥物進(jìn)行體外抗呼吸道合胞病毒活性篩選 , 結(jié)果金銀花 A 部位表現(xiàn)出較好的抗病毒活性,TC₅₀=8.125 mg/ml,IC₅₀=0.0423 mg/ml, 治療指數(shù)TI=192.1;B 部位抗病毒活性較弱 ,TC₅₀=87.61 mg/ml,IC<sub>50</sub&

17、gt;=4.529 mg/ml, 治療指數(shù) TI=19.34;C 部位未表現(xiàn)出抗病 毒活性;連翹A部位抗病毒活性較弱,TC<sub>50v/sub>=27.46mg/ml,IC<sub>50v/sub>=1.705mg/ml,治療指數(shù)TI=16.11;B '部位表現(xiàn)出很好的抗病毒活性，優(yōu)于陽性藥物,TC<sub>50v/sub>=12.41mg/ml,IC<sub>50v/sub>=0.00509 mg/ml,治療指數(shù)TI=2438.11;C '部位表現(xiàn)出很好的抗病毒活性,TC<sub>50v/

18、sub>=31.487mg/ml,IC<sub>50v/sub>=0.0167mg/ml,治療指數(shù)TI=1885.45; 黃芩精制物表現(xiàn)出較好的抗病毒活性,TC<sub>50v/sub>=0.2188mg/ml,IC<sub>50v/sub>=0.00332mg/ml,治療指數(shù)TI=65.90; 雙黃連粉針表現(xiàn)出很好的抗病毒活性,TC₅₀=1.1879mg/ml,IC₅₀=0.01mg/ml,治療指數(shù) TI=114.69。結(jié)論: 雙黃連方藥的抗病毒效果應(yīng)歸功于多成分的協(xié)同作用 , 其中金銀花的A分離部位、連翹的B'、C部位,黃苓精制部位均具有很好的抗病毒活性，各部位化學(xué)成分研究