蛋白質(zhì)測序儀

1、1會(huì)計(jì)學(xué)蛋白質(zhì)測序儀蛋白質(zhì)測序儀蛋白質(zhì)的氨基酸序列確定蛋白質(zhì)的氨基酸序列確定 每一種蛋白質(zhì)都具有唯一的氨基酸序列每一種蛋白質(zhì)都具有唯一的氨基酸序列。實(shí)際上蛋白質(zhì)的氨基酸序列是由。實(shí)際上蛋白質(zhì)的氨基酸序列是由DNA決定的。決定的。一一級級結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)二二級級結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)三三級級結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)四四級級結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)第1頁/共20頁A. 蛋白質(zhì)的氨基酸組成的定量蛋白質(zhì)的氨基酸組成的定量確定確定酸水解：破壞蛋白質(zhì)的肽鍵酸水解：破壞蛋白質(zhì)的肽鍵柱層析：進(jìn)行氨基酸定量分析，每個(gè)氨基柱層析：進(jìn)行氨基酸定量分析，每個(gè)氨基酸的量與洗脫峰酸的量與洗脫峰 的面積成比例。的面積成比例。第2頁/共20頁B. Edman降解方法常用于氨基酸

2、降解方法常用于氨基酸序列的測定序列的測定1、 Edman法法 （1）耦聯(lián) PITC HNA-B-C-D pH89，40 PTCA-B-C-D（2）裂解無水三氟乙酸（TFA） ATZA + H2NB-C-D（3）轉(zhuǎn)化PTHAPTC肽：苯氨基硫甲酰肽ATZ：噻唑啉酮苯胺（一氨基酸）PTH：苯乙內(nèi)酰硫脲（一氨基酸） 第3頁/共20頁第一輪第一輪降解降解第二輪第二輪降解降解第4頁/共20頁 PTH丙丙氨酸氨酸少了一個(gè)氨少了一個(gè)氨基酸殘基的基酸殘基的肽肽第5頁/共20頁第6頁/共20頁第7頁/共20頁第8頁/共20頁第9頁/共20頁第10頁/共20頁第11頁/共20頁C. 大蛋白被水解成肽段后再測序大蛋

3、白被水解成肽段后再測序 Edman降解法測序一次只能連續(xù)降解幾降解法測序一次只能連續(xù)降解幾十個(gè)氨基酸殘基。要測定大的蛋白質(zhì)的氨基十個(gè)氨基酸殘基。要測定大的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，需要將蛋白質(zhì)降解為一些肽段，然酸序列，需要將蛋白質(zhì)降解為一些肽段，然后再進(jìn)行后再進(jìn)行Edman降解測序。降解測序。：可以特異與蛋白質(zhì)中的：可以特異與蛋白質(zhì)中的蛋氨酸殘基反應(yīng)蛋氨酸殘基反應(yīng) 生成一個(gè)生成一個(gè)C末端為高絲氨酸內(nèi)酯的肽和末端為高絲氨酸內(nèi)酯的肽和一個(gè)帶有新的一個(gè)帶有新的N 末端殘基的肽。末端殘基的肽。特異地催化賴氨酸（特異地催化賴氨酸（Lys）殘基）殘基和精氨酸（和精氨酸（Arg） 殘基羧基側(cè)的肽鍵的水解，殘基羧基

4、側(cè)的肽鍵的水解，：特異地催化苯丙氨酸（：特異地催化苯丙氨酸（Phe）、酪氨酸）、酪氨酸 （Tyr）和色氨酸（）和色氨酸（Trp）三種芳香族氨）三種芳香族氨基酸殘基羧基一基酸殘基羧基一 側(cè)的肽鍵水解。側(cè)的肽鍵水解。第12頁/共20頁第13頁/共20頁胰蛋白酶胰蛋白酶作用作用胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶作用作用拼出完整氨基酸拼出完整氨基酸序列序列第14頁/共20頁 將蛋將蛋白質(zhì)水白質(zhì)水解為氨解為氨基酸，基酸，測組成測組成 確定確定N和和 C端氨基端氨基酸酸確定小確定小肽段氨肽段氨基酸序基酸序列列確定小確定小肽段氨肽段氨基酸序基酸序列列 利用兩利用兩組不同肽組不同肽段序列確段序列確定完整氨定完整氨基酸序

5、列基酸序列氨基酸序列確定過程氨基酸序列確定過程第15頁/共20頁第16頁/共20頁A. 蛋白質(zhì)的氨基酸組成的定量蛋白質(zhì)的氨基酸組成的定量確定確定酸水解：破壞蛋白質(zhì)的肽鍵酸水解：破壞蛋白質(zhì)的肽鍵柱層析：進(jìn)行氨基酸定量分析，每個(gè)氨基柱層析：進(jìn)行氨基酸定量分析，每個(gè)氨基酸的量與洗脫峰酸的量與洗脫峰 的面積成比例。的面積成比例。第17頁/共20頁 PTH丙丙氨酸氨酸少了一個(gè)氨少了一個(gè)氨基酸殘基的基酸殘基的肽肽第18頁/共20頁C. 大蛋白被水解成肽段后再測序大蛋白被水解成肽段后再測序 Edman降解法測序一次只能連續(xù)降解幾降解法測序一次只能連續(xù)降解幾十個(gè)氨基酸殘基。要測定大的蛋白質(zhì)的氨基十個(gè)氨基酸殘基。要測定大的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，需要將蛋白質(zhì)降解為一些肽段，然酸序列，需要將蛋白質(zhì)降解為一些肽段，然后再進(jìn)行后再進(jìn)行Edman降解測序。降解測序。：可以特異與蛋白質(zhì)中的：可以特異與蛋白質(zhì)中的蛋氨酸殘基反應(yīng)蛋氨酸殘基反應(yīng) 生成一個(gè)生成一個(gè)C末端為高絲氨酸內(nèi)酯的肽和末端為高絲氨酸內(nèi)酯的肽和一個(gè)帶有新的一個(gè)帶有新的N 末端殘基的肽。末端殘基的肽。特異地催化賴氨酸（特異地催化賴氨酸（Lys）殘基）殘基和精氨酸（和精氨酸（Arg） 殘基羧基側(cè)的肽鍵的水解，殘基羧基側(cè)的肽鍵的水解，：特異地催化苯丙氨酸（：特異地