蛋白質印跡法westernblot應用介紹

1、會計學1蛋白質印跡法蛋白質印跡法westernblot應用介紹應用介紹 蛋白質印跡的發(fā)明者一般認為是美國斯坦福大學的喬治斯塔克（George Stark）。在尼爾伯奈特（Neal Burnette）于1981年所著的分析生物化學（Analytical Biochemistry）中首次被稱為Western Blot。 蛋白免疫印跡( Western Blot) 是將電泳分離后的細胞或組織總蛋白質從凝膠轉移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上，然后用特異性抗體檢測某特定抗原的一種蛋白質檢測技術，現己廣泛應用于基因在蛋白水平的表達研究、抗體活性檢測和疾病早期診斷等多個方面。分多次將細胞收至一個管中（2

2、 2）蛋白含量測定（福林）蛋白含量測定（福林- -酚法酚法 ） 目前常用比色法測定樣品蛋白的含量：Bradford法（考馬斯亮藍法）、Lowry法（福林-酚試劑法）、 BCA法等。 1、配制BSA標準溶液：0、25、50、100、150、200、300 g/mL（用PBS配制）。 樣品液：取原液2 L至200 L （用PBS配制）。 2、操作：先取一塊新的96孔板，于630nm下測光密度值，取溶液/樣品40L和E液40L，每個濃度點均作三復孔，振蕩混勻。37C反應10 min后，加入福林酚試劑（1:15稀釋）160L，振蕩混勻，37C反應30 min。630 nm下測光密度值。以標準蛋白濃度對

3、光密度值作出標準曲線，計算待測樣品蛋白濃度。凝膠濃度（）最佳分離范圍（KD)650-150830-901020-801212-601510-401、配制下層膠（分離膠）靜置1h后制上層膠（濃縮膠）2、配制上層膠（濃縮膠）加完后插上梳子，靜置1h(1) SDS-PAGE凝膠配制 操作時要使兩玻璃對齊，以免漏膠。加完分離膠后膠，加水液封時要很慢，否則膠會被沖變型。灌膠時開始可快一些，膠面快到所需高度時要放慢速度。操作時膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會有氣泡。分離膠充分凝固就倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。插梳子時要使梳子保持水平。制膠過程注意事項：制膠過程注意事項：(2) (2) 上樣與電泳上

4、樣與電泳 將制備好的樣品溶解后，把蛋白樣品直接上樣到將制備好的樣品溶解后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGESDS-PAGE膠加樣孔膠加樣孔內即可。跑上層膠，內即可。跑上層膠，70V 35Ma/70V 35Ma/塊塊 45 min45 min；跑下層膠，；跑下層膠，100V 35Ma/100V 35Ma/塊塊膠膠 1 h1 h左右。左右。半干轉移法半干轉移法 將凝膠和固相基質象三明治一樣夾在用緩沖液濕潤濾紙間。將凝膠和固相基質象三明治一樣夾在用緩沖液濕潤濾紙間。 | |紙紙| |膠膠| |膜膜| |紙紙| |槽式濕轉法槽式濕轉法 將凝膠和固相基質夾在濾紙中間，浸泡在轉移裝置的緩沖液中。將凝膠

5、和固相基質夾在濾紙中間，浸泡在轉移裝置的緩沖液中。 | |海綿海綿| |紙紙| |膠膠| |膜膜| |紙紙| |海綿海綿| |轉膜注意事項轉膜注意事項濾紙、膠、膜之間濾紙、膠、膜之間不能有氣泡不能有氣泡。濾紙、膠、膜的濾紙、膠、膜的大小大小和和擺放順序擺放順序。膠和膜上要做好膠和膜上要做好標記標記，識別正反面和上下，識別正反面和上下 。PVDFPVDF膜需要膜需要100%100%甲醇預處理，后續(xù)操作中膜必須保持濕潤。甲醇預處理，后續(xù)操作中膜必須保持濕潤。轉膜條件：轉膜條件：推薦：推薦：100V 100V ，1212小時；根據蛋白大小以及膠厚度的不同而不同。小時；根據蛋白大小以及膠厚度的不同而不

6、同。 蛋白帶出現后，于室溫用去離子水漂洗硝酸纖維素濾膜，換水幾次。只用于放射性標記抗體或放射性標記A蛋白探針的Western印跡過程。 將轉印膜浸泡到封閉液中，將膜上沒有結合蛋白質的區(qū)域結合將轉印膜浸泡到封閉液中，將膜上沒有結合蛋白質的區(qū)域結合上蛋白質，目的是上蛋白質，目的是使抗體與特異的蛋白質結合。使抗體與特異的蛋白質結合。 封閉液封閉液l 5 % 5 % TBSTTBST脫脂奶粉溶液（脫脂奶粉溶液（30ml30ml）l 牛血清白蛋白溶液牛血清白蛋白溶液( BSA )( BSA ) 搖床上緩慢搖動封閉，室溫搖床上緩慢搖動封閉，室溫2 h2 h或或4 4過夜。過夜。 把把NCNC膜放在密閉塑料

7、袋或者培養(yǎng)皿中，加入稀釋好的一抗，室溫或膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，加入稀釋好的一抗，室溫或4 4在側擺在側擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。如果一抗孵育一小時效果不佳，可以搖床上緩慢搖動孵育一小時。如果一抗孵育一小時效果不佳，可以4 4緩慢搖動孵緩慢搖動孵育過夜?；蚋鼡贵w的說明選擇適當的孵育溫度和時間。育過夜。或更據抗體的說明選擇適當的孵育溫度和時間。 回收一抗。加入回收一抗。加入TBSTTBST液，在側擺搖床上緩慢搖動洗滌液，在側擺搖床上緩慢搖動洗滌5-105-10分鐘。吸盡洗滌液分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液洗滌后，再加入洗滌液洗滌5-105-10分鐘。共洗滌分鐘。共洗滌3 3次。如果結

8、果背景較高可以適當延長次。如果結果背景較高可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數。洗滌時間并增加洗滌次數。 注：注：WesternWestern結果通常需要提供內參作為對照，通?？梢赃x用結果通常需要提供內參作為對照，通常可以選用TubulinTubulin抗體抗體或或ActinActin抗體抗體，進行內參檢測。，進行內參檢測。 NCNC膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，加入稀釋好的熒光二抗，膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，加入稀釋好的熒光二抗， 3737 緩緩慢搖動孵育一小時。二抗需根據一抗進行選擇，例如，一抗是小鼠來源的慢搖動孵育一小時。二抗需根據一抗進行選擇，例如，一抗是小鼠來源的IgGIgG，則二

9、抗需選擇抗小鼠，則二抗需選擇抗小鼠IgGIgG的二抗。的二抗。 回收二抗。加入回收二抗。加入TBSTTBST液，在側擺搖床上緩慢搖動洗滌液，在側擺搖床上緩慢搖動洗滌5-105-10分鐘。吸盡洗分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液洗滌滌液后，再加入洗滌液洗滌5-105-10分鐘。共洗滌分鐘。共洗滌3 3次。如果結果背景較高可以次。如果結果背景較高可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數。適當延長洗滌時間并增加洗滌次數。 DABDAB顯色法顯色法 ECLECL顯色原理顯色原理：( (二抗用二抗用HRPHRP標標記記) )反應物為過氧化物反應物為過氧化物+ +魯米諾，魯米諾，如果遇到如果遇到HRPHRP即發(fā)光

10、，可使膠片曝即發(fā)光，可使膠片曝光顯影。光顯影?；瘜W發(fā)光顯色法化學發(fā)光顯色法(ECL ECL )uECLECL化學發(fā)光顯色化學發(fā)光顯色 比較常用，結果容易控制，但是被催化是比較常用，結果容易控制，但是被催化是 靈敏度差一點靈敏度差一點uDABDAB顯色顯色 比較靈敏，是比較靈敏，是HRPHRP最敏感的底物最敏感的底物影響抗原抗體反應的因素影響抗原抗體反應的因素背景太高背景太高抗體濃度過高抗體濃度過高封閉不充分封閉不充分膜沒有均勻浸濕膜沒有均勻浸濕膜或者緩沖液污染膜或者緩沖液污染抗體與封閉劑出現抗體與封閉劑出現交叉反應交叉反應 雜交前檢測一抗、二抗的雜交前檢測一抗、二抗的工作濃度工作濃度延長封閉時

11、間或更換封閉延長封閉時間或更換封閉液液轉膜前用甲醇將膜完全浸轉膜前用甲醇將膜完全浸濕濕拿取膜與吸水紙時要戴手拿取膜與吸水紙時要戴手套，更換新鮮轉膜緩沖液套，更換新鮮轉膜緩沖液檢測一抗、二抗與封閉劑檢測一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應是否有交叉反應非特異條帶多非特異條帶多抗體濃度過高抗體濃度過高膜沒有均勻浸濕膜沒有均勻浸濕膜或者緩沖液污染膜或者緩沖液污染封閉不充分封閉不充分抗體與封閉劑出現抗體與封閉劑出現交叉反應交叉反應 雜交前檢測一抗、二抗雜交前檢測一抗、二抗的工作濃度的工作濃度轉膜前用轉膜前用100%100%甲醇將膜甲醇將膜完全浸濕完全浸濕拿取膜與吸水紙時要戴拿取膜與吸水紙時要戴手套，更換新

12、鮮轉膜緩手套，更換新鮮轉膜緩沖液沖液檢測一抗、二抗與封閉檢測一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應劑是否有交叉反應蛋白帶型條狀蛋白帶型條狀上樣過量上樣過量樣品沉淀樣品沉淀樣品中的污染樣品中的污染制膠不佳制膠不佳 降低上樣量降低上樣量加大樣品中的加大樣品中的SDSSDS濃度濃度離心樣品離心樣品確保灌膠均勻確保灌膠均勻 條帶模糊條帶模糊 蛋白樣品部分變性蛋白樣品部分變性蛋白樣品部分還原蛋白樣品部分還原電泳時間過長電泳時間過長 完全變性蛋白完全變性蛋白確保加入足夠的確保加入足夠的DTTDTT或或-巰基乙醇巰基乙醇觀察指示劑染料，掌握觀察指示劑染料，掌握恰當的電泳時間恰當的電泳時間啞鈴型條帶或啞鈴型條帶或

13、“微笑微笑” 條帶條帶上樣體積過大導致不完上樣體積過大導致不完全堆積全堆積電泳過程中電場不均勻電泳過程中電場不均勻分離膠表面不齊分離膠表面不齊 使用恰當上樣體積使用恰當上樣體積如果蛋白濃度已知，如果蛋白濃度已知，上樣時確保對稱上樣時確保對稱制膠時使分離膠表面制膠時使分離膠表面水平水平無條帶的原因無條帶的原因 蛋白樣品制備蛋白樣品制備 檢查膠：考馬斯亮藍染膠檢查膠：考馬斯亮藍染膠 檢查膜：麗春紅檢查膜：麗春紅S S染色染色 抗體滴度太低抗體滴度太低 顯色顯色 試劑放置太久或存放條件不正確試劑放置太久或存放條件不正確分多次將細胞收至一個管中 DABDAB顯色法顯色法 ECLECL顯色原理顯色原理：( (二抗用二抗用HRPHRP標標記記) )反應物為過氧化物反應物為過氧化物+ +魯米諾，魯米諾，如果遇到如果遇到HRPHRP即發(fā)光，可使膠片曝即發(fā)光，可使膠片曝光顯影。光顯影?；瘜W發(fā)光顯色法化學發(fā)光顯色法(ECL ECL )影響抗原抗體反應的因素影響抗原抗體反應的因素背景太高背景太高抗體濃度過高抗體濃度過高封閉不充分封閉不充分