第14章基因重組和基因工程

1、第第14章章基因重組和基因工程基因重組和基因工程Genetic recombination and Genetic Engineering第一節(jié)第一節(jié) 基因重組基因重組一、一、自然界自然界DNA重組和基因轉(zhuǎn)移是經(jīng)常發(fā)生的重組和基因轉(zhuǎn)移是經(jīng)常發(fā)生的1.自然界自然界DNA重組的類型重組的類型接合作用接合作用 (conjugation)轉(zhuǎn)化作用轉(zhuǎn)化作用 (transformation)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用轉(zhuǎn)導(dǎo)作用 (transduction)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 座座 (transposition)同源重組同源重組 (homologous recombination)位點特異的重組位點特異的重組(site-specific r

2、ecombination) 發(fā) 生 在 同 源 序 列 間 的 重 組 稱 為發(fā) 生 在 同 源 序 列 間 的 重 組 稱 為 同 源 重 組同 源 重 組(homologous recombination)(homologous recombination)，又稱又稱基本重組基本重組（general recombinationgeneral recombination）。是最基本的。是最基本的DNADNA重重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個DNADNA分子分子同源序列間進行單鏈或雙鏈片段的交換。同源序列間進行單鏈或雙鏈片段的交換。2.同源重組是最基本

3、的同源重組是最基本的DNA重組方式重組方式3.細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組主要有三種方式細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組主要有三種方式（1）接合作用）接合作用(conjugation) ：當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞、或細(xì)菌通過菌毛相互接觸時，當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞、或細(xì)菌通過菌毛相互接觸時，質(zhì)粒質(zhì)粒DNA從一個細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞（細(xì)菌）的從一個細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞（細(xì)菌）的DNA轉(zhuǎn)移稱為轉(zhuǎn)移稱為接合作用。接合作用。（2）轉(zhuǎn)化作用）轉(zhuǎn)化作用(transformation)：通過自動獲取或人為地供給外源通過自動獲取或人為地供給外源DNA，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型，稱為使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型，稱為轉(zhuǎn)

4、化作用轉(zhuǎn)化作用 。（3）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(transduction) ：當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放出當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放出來、再次感染另一（供體）細(xì)胞時，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的來、再次感染另一（供體）細(xì)胞時，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移及基因重組即為移及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。4.位點特異重組，即特異位點間發(fā)生的整合位點特異重組，即特異位點間發(fā)生的整合 位點特異重組位點特異重組(site-specific recombination) 是由整合酶催化，在兩是由整合酶催化，在兩個個DNA序列的特異位點間發(fā)生的整合。序列的特異位點間發(fā)生的整合。5.

5、轉(zhuǎn)座重組轉(zhuǎn)座重組由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因移位或重排稱為由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因移位或重排稱為轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座(transposition)。大多數(shù)基因在基因組內(nèi)的位置是固定的，但有些基因可以大多數(shù)基因在基因組內(nèi)的位置是固定的，但有些基因可以從一個位置移動到另一位置。這些可移動的從一個位置移動到另一位置。這些可移動的DNA序列包括序列包括插入序列和轉(zhuǎn)座子。插入序列和轉(zhuǎn)座子。 轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子(transposons) 可從一個染色體位點轉(zhuǎn)移到另一可從一個染色體位點轉(zhuǎn)移到另一位點的分散重復(fù)序列。位點的分散重復(fù)序列。第二節(jié)第二節(jié) 重組重組DNA技術(shù)技術(shù)又稱又稱DNA克隆或分子克隆克隆或分子克隆 .相關(guān)概

6、念相關(guān)概念 DNA克隆克隆 工具酶工具酶 目的基因目的基因 基因載體基因載體.基本原理基本原理 .重組重組DNA技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用及前景技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用及前景.重組重組DNA技術(shù)相關(guān)概念技術(shù)相關(guān)概念克隆克隆(clone):來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過程稱為獲取同一拷貝的過程稱為克隆化克隆化(cloning)，即無性繁殖。，即無性繁殖。1. DNA克隆克隆水平：水平：分子克隆分子克隆(molecular clone)（即（即DNA 克隆）；克?。?；細(xì)細(xì)胞克?。粋€體克?。▌游锘蛑参铮┌寺?；個體克隆（動物或植物）DNA克隆克隆:應(yīng)用酶學(xué)

7、的方法，在體外將各種來源應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的或人工的DNA）與載體）與載體DNA接合成一具有自我復(fù)制能力的接合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子分子復(fù)制子復(fù)制子(replicon)，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進行擴增提細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進行擴增提取獲得大量同一取獲得大量同一DNA分子，也稱分子，也稱基因克隆或重組基因克隆或重組DNA (recombinant DNA) 。 2.工具酶工具酶 限制性

8、核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 DNA聚合酶聚合酶 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶 T4DNA連接酶連接酶 堿性磷酸酶堿性磷酸酶 末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶 Taq DNA聚合酶聚合酶重組重組DNA技術(shù)中常用的工具酶技術(shù)中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割識別特異序列，切割DNADNA連接酶連接酶催化催化DNA中相鄰的中相鄰的5 磷酸基和磷酸基和3 羥基末端之間形成磷酸羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個切口封合或使兩個DNA分子或片段連接分子或片段連接DNA聚合酶聚合酶合成雙鏈合成雙鏈cDNA分子或片段連接分子或片段連接缺口平移制作高比

9、活探針缺口平移制作高比活探針DNA序列分析序列分析填補填補3 末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而無外切活性，而無53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈第二鏈合成，雙鏈DNA 3 末端標(biāo)記等末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I進行填補，標(biāo)記或進行填補，標(biāo)記或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶在在3 羥基末端進

10、行同質(zhì)多聚物加尾羥基末端進行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶堿性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease) 概念：概念：限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease, RE)是識別是識別DNA的特異序列的特異序列, 并在識別位點或其周圍切割雙鏈并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一的一類內(nèi)切酶。類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam H分類：分類： 、（基因工程技術(shù)中常用（基因工程技術(shù)中常用型）型）作用：作用：與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，與甲基化酶共同

11、構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源限制外源DNA，保護自身，保護自身DNA。第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第二、第三個字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名：命名：Hin d 屬屬 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血桿菌流感嗜血桿菌d株的第三種酶株的第三種酶類酶識別序列特點類酶識別序列特點 回文結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu)(palindrome) GTCCAGHindGTCGACCAGCT

12、GGACCTG平端切口平端切口切割方式及切割結(jié)果：切割方式及切割結(jié)果：交錯切割交錯切割對稱切割對稱切割平端切口平端切口粘端切口粘端切口5突出末端突出末端 （ 5- cohesive end ）3突出末端突出末端 （ 3- overhang tail）Bam HGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGG粘端切口粘端切口 切割的化學(xué)本質(zhì)：切割的化學(xué)本質(zhì)：磷酸二酯鍵的斷裂磷酸二酯鍵的斷裂, 形成含形成含5 P和和3OH 末端的兩個末端的兩個DNA片段。片段。 對一特定的對一特定的DNA而言，識別序列堿基對少的，則切點而言，識別序列堿基對少的，則切點數(shù)多，產(chǎn)生的片段小。數(shù)多，產(chǎn)生的片段小。來源

13、不同的限制酶，但能識別和切割來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點，這些酶稱同一位點，這些酶稱同功異源酶同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBst同功異源酶：同功異源酶：有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同，但切割相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配伍未端伍未端(compatible end)。 GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GA

14、TCC GATCTAG GATCT A同尾酶同尾酶名稱名稱 識別序列及切割位點識別序列及切割位點名稱識別序列及切割點名稱識別序列及切割點切割后產(chǎn)生切割后產(chǎn)生突出末端突出末端:BamH 5GGATCC.3GATCC.3Bgl 5AGATCT.3GATCT.3EcoREcoR 5GAATTC.3AATTC.3Hind Hind 5AAGCTT.3 AGCTT.3 HpaHpa 5CCGG.3 CGG.3 MboMbo 5GATC.3 GATC.3 NdeNde 5GATATG.3TATG.3切割后產(chǎn)生切割后產(chǎn)生3突出末端突出末端:Apa 5GGGCCC.3C.3Hae 5PuGCGCPyPy.3.

15、3Kpn 5GGTACC.3C.3Pst 5CTGCAG.3G.3Sph 5GCATGC.3C.3切割后產(chǎn)生平末端切割后產(chǎn)生平末端:Alu 5AGCT.3CT.3EcoR 5GATATC.3ATC.3HaeHae 5GGCC.3CC.3PvuPvu 5CAGCTG.3CTG.3SmaSma 5CCCGGG.3GGG.3 限制性內(nèi)切核酸酶限制性內(nèi)切核酸酶3.目的基因目的基因(target gene) cDNA (complementary DNA) 指經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的、與指經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的、與RNA (通常指通常指mRNA或病或病毒毒RNA)互補的單鏈互補的單鏈DNA。以單鏈。以單鏈cDNA為模板、

16、為模板、經(jīng)聚合反應(yīng)可合成雙鏈經(jīng)聚合反應(yīng)可合成雙鏈cDNA。 基因組基因組DNA (genomic DNA) 指代表一個細(xì)胞或生物體整套遺傳信息指代表一個細(xì)胞或生物體整套遺傳信息(染色體及染色體及線粒體線粒體)的所有的所有DNA序列。序列。 4.基因載體基因載體定義定義:為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達有意義為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。分子。載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)：載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)： 能自主復(fù)制；能自主復(fù)制； 具有兩個以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選具有兩個以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；和鑒定； 有克隆位點（外源有克隆位點

17、（外源DNA插入點），常具有多個單插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點；一酶切位點，稱為多克隆位點； 分子量小分子量小，以容納較大的外源，以容納較大的外源DNA?？寺≥d體克隆載體(cloning vector)為使插入的外源為使插入的外源DNA序列被擴增而特意設(shè)計的序列被擴增而特意設(shè)計的載體稱為載體稱為克隆載體克隆載體。表達載體表達載體(expression vector) 為使插入的外源為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成 多肽多肽鏈而特意設(shè)計的載體稱為鏈而特意設(shè)計的載體稱為表達載體表達載體。載體的分類：按功能分類載體的分類：按功能分類克隆載體克隆載體 功能：用來

18、克隆和擴增功能：用來克隆和擴增DNADNA片段（目的基因）的載體。片段（目的基因）的載體。具備條件：具備條件： a a 必須是一個復(fù)制子，能在受體細(xì)胞中復(fù)制必須是一個復(fù)制子，能在受體細(xì)胞中復(fù)制 復(fù)制起點復(fù)制起點 OriOri；復(fù)制區(qū)；復(fù)制終點；復(fù)制區(qū)；復(fù)制終點 termterm b b 帶有抗藥性基因帶有抗藥性基因 TetTet r r：編碼膜蛋白，阻止：編碼膜蛋白，阻止TetTet進入細(xì)胞進入細(xì)胞 Amp Amp r r：-內(nèi)酰胺環(huán)水解酶內(nèi)酰胺環(huán)水解酶 Kan Kan r r： KanKan P , neoP , neo p p Cam Cam r r：氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶：氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶

19、 c c 具有多克隆位點（具有多克隆位點（multiple cloning sitsmultiple cloning sits，MCS MCS ） 載體上含有的一個人工合成的載體上含有的一個人工合成的DNADNA片段，其上含有數(shù)個單一酶切位點，片段，其上含有數(shù)個單一酶切位點，是外源是外源DNADNA的插入部位，是載體中的一段堿基序列，由數(shù)個酶切位點組成。的插入部位，是載體中的一段堿基序列，由數(shù)個酶切位點組成。這些位點在載體上都是單一位點。這些位點在載體上都是單一位點。 d d 可導(dǎo)入受體細(xì)胞可導(dǎo)入受體細(xì)胞 表達載體表達載體功能：在受體細(xì)胞中表達外源基因的載體功能：在受體細(xì)胞中表達外源基因的載體

20、結(jié)構(gòu)：結(jié)構(gòu)：克隆載體克隆載體 + + 表達構(gòu)件表達構(gòu)件 原核生物表達原核生物表達 真核生物表達真核生物表達具備條件：具備條件： ori ampr 基礎(chǔ)上加轉(zhuǎn)錄和翻譯相關(guān)元件基礎(chǔ)上加轉(zhuǎn)錄和翻譯相關(guān)元件 MCS 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA噬菌體噬菌體DNA病毒病毒DNA其他其他載體的分類：按來源分類載體的分類：按來源分類質(zhì)粒質(zhì)粒 (plasmid)特點特點: : 能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨立自主復(fù)制；帶有某些遺能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息傳信息, , 會賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。會賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。 噬菌體噬菌體DNA改造系統(tǒng)改造系統(tǒng) gt系列（插入型，適用系列（插入型，適用cDNA克?。┛寺。?/p>

21、 EMBL系列（置換型，適用基因組克隆）系列（置換型，適用基因組克?。┦删w噬菌體(phage) M13噬菌體噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含改造系統(tǒng)（含lacZ基因）基因） M13mp系列系列 pUC系列系列 粘性質(zhì)粒粘性質(zhì)粒(cosmid) 由由噬菌體的噬菌體的cos區(qū)與質(zhì)粒區(qū)與質(zhì)粒DNA構(gòu)建而成。構(gòu)建而成。 特點：特點：含質(zhì)粒的含質(zhì)粒的ampr 或或 tetr 、Ori成分，可在大成分，可在大腸桿菌中腸桿菌中 復(fù)制；復(fù)制； 含噬菌體的含噬菌體的cos區(qū)，可在體外進行包裝；區(qū)，可在體外進行包裝； 含含1個或多個酶切位點；個或多個酶切位點；本身分子量?。ū旧矸肿恿啃。?.5 kb 左右），可容納左右

22、），可容納40kb的的DNA片段；片段；非重組體太小不能包裝，只包裝重組體，非重組體太小不能包裝，只包裝重組體，便于篩選。便于篩選。 病毒載體病毒載體 如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒等?？蛇M一步分為：如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒等。可進一步分為： 整合性載體：整合性載體：外源基因通過這種載體與宿主細(xì)胞的染色體整合。外源基因通過這種載體與宿主細(xì)胞的染色體整合。如如pSVpSV系列載體。系列載體。 游離型載體：游離型載體：外源基因與這種載體重組后，以病毒顆粒形式在宿外源基因與這種載體重組后，以病毒顆粒形式在宿主細(xì)胞內(nèi)自行復(fù)制或在輔助病毒存在下進行復(fù)制。如痘苗病毒、主細(xì)胞內(nèi)自行復(fù)制或在

23、輔助病毒存在下進行復(fù)制。如痘苗病毒、腺病毒、桿狀病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒等。腺病毒、桿狀病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒等。 酵母人工染色體酵母人工染色體 (yeast artificial chromosome, YAC) 細(xì)菌人工染色體細(xì)菌人工染色體 (bacterial artificial chromosome, BAC) 其他其他.重組重組DNA技術(shù)基本原理技術(shù)基本原理 基本原理基本原理目的基因的獲取目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞導(dǎo)入受體細(xì)胞外源基因與載體的連接外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選重組體的篩選克隆基因的表達克隆基因的表達 以以 質(zhì)質(zhì) 粒粒 為為 載載 體

24、體 的的DNA 克克 隆隆 過過 程程（1 1）目的基因的獲?。┠康幕虻墨@取1. 化學(xué)合成法化學(xué)合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列基酸序列 。2. 基因組基因組DNA文庫文庫(genomic DNA library)3. cDNA文庫文庫(cDNA library)4. 聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)1.1.化學(xué)合成法獲取目的基因化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列。序列。組織或細(xì)胞染色體組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷基因片

25、斷克隆載體克隆載體重組重組DNA分子分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶受體菌受體菌基因組基因組DNA文庫文庫存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所由克隆載體所攜帶的所有基因組有基因組DNA的集合的集合2.從基因組從基因組DNA文文庫獲取目的基因庫獲取目的基因mRNA cDNA 雙鏈雙鏈cDNA 重組重組DNA分子分子 cDNA文庫文庫 反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶 載體載體 受體菌受體菌 復(fù)制復(fù)制3.從從cDNA文庫獲取目的基因文庫獲取目的基因 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶堿水解堿水解 T T

26、T T 根據(jù)目的基因的核苷酸序列設(shè)計一對引物以根據(jù)目的基因的核苷酸序列設(shè)計一對引物以基因組基因組DNADNA為模板經(jīng)為模板經(jīng)PCRPCR擴增目的基因。擴增目的基因。 以以mRNAmRNA或或RNARNA為模板經(jīng)為模板經(jīng)RT-PCRRT-PCR擴增目的基因。擴增目的基因。4.PCR或或RT-PCR 獲取目的基因獲取目的基因（2 2）克隆載體的選擇和構(gòu)建）克隆載體的選擇和構(gòu)建目的不同，操作基因的性質(zhì)不同，目的不同，操作基因的性質(zhì)不同，載體的選擇和改建方法也不同。載體的選擇和改建方法也不同。 載體的選擇主要考慮以下載體的選擇主要考慮以下5 5個條件個條件1.1.有足夠容納目的基因的幅度有足夠容納目的

27、基因的幅度根據(jù)克隆外源根據(jù)克隆外源DNADNA片段的大小選擇合適的片段的大小選擇合適的 載體載體2.2.構(gòu)建構(gòu)建DNADNA重組體的目的重組體的目的克隆選克隆載體，表達選表達載體克隆選克隆載體，表達選表達載體3.3.載體載體MSCMSC中的酶切位點中的酶切位點根據(jù)克隆外源根據(jù)克隆外源DNADNA的酶切位點選擇具有相同酶切位點的載體的酶切位點選擇具有相同酶切位點的載體4.4.根據(jù)受體細(xì)胞的類型確定表達載體的類型根據(jù)受體細(xì)胞的類型確定表達載體的類型5.5.載體克隆位點的閱讀框要與目的基因的閱讀框匹配載體克隆位點的閱讀框要與目的基因的閱讀框匹配 獲得載體后，用適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈钶d體獲得載體后，用適當(dāng)?shù)?/p>

28、限制酶切割載體DNADNA分子，獲得線形分子。分子，獲得線形分子。盡量用與消化目的基因時相同的酶盡量用與消化目的基因時相同的酶4. 人工接頭人工接頭(linker)連接連接（3 3）外源基因與載體的連接）外源基因與載體的連接1. 粘性末端連接粘性末端連接2. 平端連接平端連接 3. 同聚物加尾連接同聚物加尾連接方式：方式：(1)同一限制酶切位點連接同一限制酶切位點連接 (2)不同限制酶切位點連接不同限制酶切位點連接配伍末端連接配伍末端連接非配伍末端連接非配伍末端連接1. 粘性末端連接粘性末端連接Bam H切割反應(yīng)切割反應(yīng) GGATCC CCTAGGT4 DNA連接酶連接酶15CGATCC GG

29、CCTAG目的基因用目的基因用 Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG載體載體DNA用用Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重組體重組體GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG載體自連載體自連目的基因自連目的基因自連同一限制酶切位點連接同一限制酶切位點連接不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAGAATTCC

30、TTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位點切割位點Bg l切割位點切割位點AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGEcoR+ Bg l雙酶切雙酶切Eco R+ Bg l雙酶切雙酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體配伍末端的配伍末端的連接情況和同一連接情況和同一限制酶切位點連限制酶切位點連接相似。接相似。2. 平端連接平端連接 限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補齊或切平形成的平端粘端補齊或切平形成的平端適用于：適用于：目的基因目的基因載體載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)

31、切酶限制性內(nèi)切酶T4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體載體自連載體自連目的基因目的基因 自連自連在末端轉(zhuǎn)移酶在末端轉(zhuǎn)移酶(terminal transferase) 的的作作用下，在用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接。造出粘性末端，再進行粘端連接。3. 同聚物加尾連接同聚物加尾連接5 3 3 5 載體載體DNA5 3 3 5 目的基因目的基因限制酶或機械剪切限制酶或機械剪切限制酶限制酶 5 3 3 5 5 3 T(T)nT T(T)nT 3 5 5 3 3 5 3 A(A)nA A(A)nA 3 5 -核酸外切酶核酸外切酶-核酸外

32、切酶核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶+ dATP末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體5 由平端加上新的酶切位點，再用限制由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進行粘端連接酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進行粘端連接。 4. 人工接頭人工接頭(linker)連接連接人工接頭及其應(yīng)用人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R受體菌條件：受體菌條件：安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)處于感受態(tài)(competent)

33、導(dǎo)入方式：導(dǎo)入方式：轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 (transformation)轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染 (transfection)感染感染 (infection)（4）重組）重組DNA導(dǎo)入受體菌導(dǎo)入受體菌受體菌條件：受體菌條件：安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)處于感受態(tài)(competent) 1.安全宿主菌（或宿主細(xì)胞）：安全宿主菌（或宿主細(xì)胞）：在人腸道幾無存活或在人腸道幾無存活或存活率極低。存活率極低。受體細(xì)胞應(yīng)具備下列條件受體細(xì)胞應(yīng)具備下列條件: 2.限制酶缺陷型：限制酶缺陷型：外源外源DNA進入受體菌不被降解進入受體菌不被降解 3.重組缺陷型：重組缺陷型：保證外源保證外源DNA不

34、與細(xì)菌基因組不與細(xì)菌基因組DNA重重組，獨立存在組，獨立存在 4.能發(fā)展成感受態(tài)細(xì)胞的菌株能發(fā)展成感受態(tài)細(xì)胞的菌株 感受態(tài)：感受態(tài)：是受體菌能接受外源是受體菌能接受外源DNA能力的一種生理狀態(tài)能力的一種生理狀態(tài) 感受態(tài)細(xì)胞：感受態(tài)細(xì)胞：指經(jīng)過一定方法處理后具備接受外源指經(jīng)過一定方法處理后具備接受外源DNA能能力的細(xì)胞力的細(xì)胞導(dǎo)入方式：導(dǎo)入方式：轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 (transformation)轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染 (transfection)感染感染 (infection)1. 1. 轉(zhuǎn)化（轉(zhuǎn)化（transformationtransformation）定義：定義： 將質(zhì)?；蚱渌庠磳①|(zhì)?；蚱渌庠碊NADNA導(dǎo)

35、入處于感受態(tài)的宿主細(xì)胞，導(dǎo)入處于感受態(tài)的宿主細(xì)胞，并使其獲得新的表型的過程。并使其獲得新的表型的過程。過程：過程：細(xì)胞細(xì)胞低溫低溫CaClCaCl2 2處理處理感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞加重組加重組DNADNA4242熱休克熱休克重組體吸入細(xì)胞重組體吸入細(xì)胞復(fù)蘇復(fù)蘇涂板（含抗生涂板（含抗生素）素）篩選轉(zhuǎn)化菌落。篩選轉(zhuǎn)化菌落。2. 2. 感染（感染（fectionfection） 以噬菌體、粘粒和真核病毒為載體的重組以噬菌體、粘粒和真核病毒為載體的重組DNADNA分子，體外經(jīng)包裝成為具有感染能力的病毒分子，體外經(jīng)包裝成為具有感染能力的病毒或噬菌體顆粒，才能感染相應(yīng)的細(xì)胞，并在其中或噬菌體顆粒，才能感染

36、相應(yīng)的細(xì)胞，并在其中擴增。此過程又叫轉(zhuǎn)導(dǎo)（擴增。此過程又叫轉(zhuǎn)導(dǎo)（transductiontransduction）。）。 感染效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于轉(zhuǎn)化效率感染效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于轉(zhuǎn)化效率 3. 3. 轉(zhuǎn)染（轉(zhuǎn)染（transfectiontransfection） 真核細(xì)胞主動攝取或被動導(dǎo)入外源真核細(xì)胞主動攝取或被動導(dǎo)入外源DNADNA片段而獲得新片段而獲得新的表型的過程。的表型的過程。 進入細(xì)胞的進入細(xì)胞的DNADNA可以整合到宿主基因組中，也可游離于可以整合到宿主基因組中，也可游離于染色體外存在和表達。染色體外存在和表達。 1. 直接選擇法直接選擇法(1) 抗藥性標(biāo)記選擇抗藥性標(biāo)記選擇(2) 標(biāo)志補救標(biāo)志補

37、救(marker rescue)(3) 分子雜交法分子雜交法原位雜交原位雜交Southern印跡印跡2. 免疫學(xué)方法免疫學(xué)方法如免疫化學(xué)方法及酶免檢測分析等如免疫化學(xué)方法及酶免檢測分析等（5）重組體的篩選）重組體的篩選( (插入失活法插入失活法) ) 抗藥性標(biāo)記選擇抗藥性標(biāo)記選擇適用于含適用于含2個的抗性標(biāo)記的質(zhì)粒。例如個的抗性標(biāo)記的質(zhì)粒。例如pBR322，含，含Tetr（BamHI位點）和位點）和Ampr基基因，外源因，外源DNA插入，使插入，使Tetr滅活。滅活。 分別用含分別用含Ampr 和和Tetr的平皿同時篩選，的平皿同時篩選，可鑒定出重組子。可鑒定出重組子。 互補原理篩選重組體互補

38、原理篩選重組體pUC18 某些質(zhì)粒（如某些質(zhì)粒（如PUC系列），含有大腸桿菌的系列），含有大腸桿菌的lacZ基因片段，在該基因區(qū)又有基因片段，在該基因區(qū)又有MCS，這些質(zhì)粒將導(dǎo)入，這些質(zhì)粒將導(dǎo)入 lacZ- 的宿主菌中表達。的宿主菌中表達。 如果無外源基因插入：如果無外源基因插入：則質(zhì)粒則質(zhì)粒lacZ基因正常表達和宿主菌的基因正常表達和宿主菌的lacZ基因互補，產(chǎn)基因互補，產(chǎn)生有活性的生有活性的 半乳糖苷酶，經(jīng)半乳糖苷酶，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，分解誘導(dǎo)后，分解X-gal底物，產(chǎn)生底物，產(chǎn)生blue clony。 如果有外源基因插入：如果有外源基因插入：則質(zhì)粒編碼的則質(zhì)粒編碼的lacZ基因失活、菌體

39、不可能互補產(chǎn)生基因失活、菌體不可能互補產(chǎn)生 半半乳糖苷酶，產(chǎn)生乳糖苷酶，產(chǎn)生重組重組DNA技術(shù)操作的主要步驟技術(shù)操作的主要步驟載體載體質(zhì)粒質(zhì)粒噬菌體噬菌體病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因組基因組DNA cDNA 人工合成人工合成PCR產(chǎn)物產(chǎn)物限制酶消化限制酶消化開環(huán)載體開環(huán)載體DNA目的基目的基因因連接酶連接酶重組體重組體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主帶重組體的宿主篩選篩選表型篩選表型篩選酶切電泳鑒定酶切電泳鑒定菌落原位雜交菌落原位雜交重組重組DNADNA技術(shù)操作過程可形象歸納為：技術(shù)操作過程可形象歸納為： 小結(jié)小結(jié)分分分離目的基因分離目的基因 切切限制

40、酶切目的基因與載體限制酶切目的基因與載體接接拼接重組體拼接重組體 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞篩篩篩選重組體篩選重組體 表達體系的建立：表達體系的建立： 表達載體的構(gòu)建表達載體的構(gòu)建 受體細(xì)胞的建立受體細(xì)胞的建立 表達產(chǎn)物的分離純化表達產(chǎn)物的分離純化（6）克隆基因的表達）克隆基因的表達 標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)：選擇標(biāo)志選擇標(biāo)志 強啟動子強啟動子 翻譯調(diào)控序列翻譯調(diào)控序列多接頭克隆位點多接頭克隆位點 E.coli表達體系的不足表達體系的不足：不宜表達真核基因組不宜表達真核基因組DNA；不能加工表達的真核蛋白質(zhì)；不能加工表達的真核蛋白質(zhì)；表達的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體表達的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體(inclusion body) ；很難表達大量可溶性蛋白。很難表達大量可溶性蛋白。1. 原核表達體系原核表達體系 (E.coli表達體系最為常用表達體系最為常用)大鼠胰島素原大鼠胰島素原cDNA的表達和分泌的表達和分泌 優(yōu)點：優(yōu)點：可表達克隆的可表達克隆的cDNA及真核基因組及真核基因組DNA 可適當(dāng)修飾表達的蛋白質(zhì)可適當(dāng)修飾表達的蛋白質(zhì) 表達產(chǎn)物分區(qū)域積累表達產(chǎn)物分區(qū)域積累 缺點：缺點：操作技術(shù)難、費時、經(jīng)濟操作技術(shù)難、費時、經(jīng)濟 轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染 將表達載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程將表達載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程方法：方法：磷酸鈣轉(zhuǎn)染磷酸鈣轉(zhuǎn)染 DEAE葡