高效液相流動相緩沖鹽選擇

1、下 面 內(nèi) 容 綜 合 了A g i l e n t和網(wǎng) 上 查 到 的 一 些 資料 ：一般來說，反相HPLC 的流動相包括有機相和水相，有機相常用的為色譜甲醇和乙腈，不太常用的還有四氫呋喃和異丙醇。甲醇有其性價比的優(yōu)勢，但是甲醇活性高，可能與某些樣品發(fā)生反應，而且甲醇在低波長下有紫外吸收，會降低分析方法的靈敏度；乙腈雖然價格很高，毒性比甲醇大，但是洗脫能力比甲醇強，很少與樣品發(fā)生反應，用作流動相系統(tǒng)壓力要比甲醇低很多，且截止波長比甲醇低20nm ，增加了檢測出在低波長下才有吸收的雜質(zhì)的可能性，所以我們一般傾向于多用乙腈，少用甲醇。但是當樣品峰形不好或者分離不好時，更換溶劑是一個很好的選擇，

2、因為不同的溶劑可提供不同的選擇性。在反相色譜中，流動相中水相的 pH 和離子強度在開發(fā)對條件微小變化不敏感的耐用方法中非常重要。對于離子型化合物，典型樣品的保留隨 pH 改變而明顯變化，因此控制 pH 對于保留和選擇性的穩(wěn)定非常重要，通常在 pH24 的條件下，保留時間對 pH 的微小改變穩(wěn)定性最高，因此建議將這一 pH 范圍作為大多數(shù)樣品方法開發(fā)的起始 pH，包括堿性化合物和一般的弱酸?？紤]到重現(xiàn)性，所用的pH 應高于或低于待分析物 pKa 或 pKb 上下一個 pH 單位。當待分析物 pKa 或 pKb 未知時，應測試一種以上流動相pH （如pH2.0和pH6.5緩沖鹽溶液） ，可提供最好

3、結(jié)果。對流動相的優(yōu)化主要體現(xiàn)在水相上。流動相 pH 值對色譜分離的影響有多鐘方式，根據(jù)待分析物的結(jié)構(gòu)性質(zhì)， pH 可能影響選擇性、峰形和保留。如果是非極性較強或中性的化合物， pH 對分離度和保留的影響一般不明顯。如果是可離子化的化合物，如酸 或 堿， 保留 因子 和選 擇 性隨p H改 變非 常 明 顯 。（ 1）酸性分析物，應選擇低 pH 緩沖液流動相，以防止分析物離子化。了解分析物的 pKa ，才能有效的選擇流動相 pH 。緩沖范圍應在其緩沖液離子 pK 值±1pH 單位，使流動相的優(yōu)化具有一定的靈活性。例如，醋酸鹽的pKa 為 4.8 ，緩沖范圍為pH3.85.8。（2）堿性

4、化合物，在高常許多堿性化合物在低如 果 選 擇 高p HpH 條件下才能得到其非離子形態(tài)，但這對色譜柱不利。通 pH 條件的保留就已經(jīng)滿足要求了，所以可選擇低 pH 條件。條件，則注意需選擇耐強堿的色譜柱。水里可以加酸、加堿、加鹽，從而改變 pH 值、改善峰形、提高分離度。常用的酸有磷酸、三氟乙酸、甲酸、乙酸、高氯酸、甲基磺酸等。單純做液相時，低波長下磷酸最合適；而做液質(zhì)時首選三氟乙酸，或甲酸、乙酸。開發(fā)液相分析方法時流動相可首選 0.1% 的磷酸水溶液，然后再以此為基礎(chǔ)做優(yōu)化。在單獨用酸不行的時候再考慮使用緩沖鹽，緩沖鹽的選擇原則是：簡單、穩(wěn)定、緩沖能力強、配制簡單，需要調(diào) pH 值時要有相

5、應的酸或堿。常用的緩沖鹽是磷酸鹽，主要是鉀鹽和鈉鹽，還有醋酸鹽，常用的鹽濃度在 1020mM 左右（根據(jù)實際情況，有時可以選擇更低或更高 濃 度 ， 建 議 最 高 濃 度 不 超 過 5 0 m M ） 。下表是Wa t e r s提供的 一個資料 ，常規(guī)實 驗室建議使 用的緩沖 鹽體系。揮緩沖鹽 /發(fā)是否性流動相pKa緩沖范圍MS 兼?zhèn)渥?？改性劑容? ±1pH)離子對試劑，能夠抑制TFA0.3-是是MS 信號，通常使用的濃度范圍 0.020.1%乙酸4.76-甲酸3.75-乙酸鹽4.763.765.76（銨鹽）甲酸鹽3.752.754.75（銨鹽）磷酸鹽2.151.153.15

6、1磷酸鹽7.26.28.22磷酸鹽12.311.313.334-甲基8.47.49.4嗎啡啉9.2氨水10.3(H8.210.2碳酸氫CO3-)銨8.211.39.2(NH4+)同乙酸銨一起使用具有是是最大的緩沖能力，通常使用的濃度范圍 0.11.0%同甲酸銨一起使用具有是是最大的緩沖能力，通常使用的濃度范圍 0.11.0%通常使用 110mM 濃度，是是注意鉀鹽和鈉鹽是非揮發(fā)性的通常使用 110mM 濃度，是是注意鉀鹽和鈉鹽是非揮發(fā)性的否否傳統(tǒng)的低 pH 緩沖體系，UV 透光度很好當 pH 超過 7 時，降低操否否作溫度 /緩沖鹽濃度以及使用保護柱可以延長色譜柱壽命當 pH 超過 8 時，降

7、低操否否作溫度 /緩沖鹽濃度以及使用保護柱可以延長色譜柱壽命是是通常使用濃度為 10mM或更少通常使用濃度為510mM （用于 MS 工作是是時保持離子源溫度超過150 ）。用氨水或乙酸調(diào)節(jié) pH 值，在 pH10 時具有很好的緩沖能力。乙酸銨9.28.210.2甲酸銨9.28.210.2硼酸9.28.210.2CAPSO（3-環(huán)己胺基9.78.710.7-2- 羥基丙磺酸Glycine2.4,9.88.810.8甘氨酸1-甲基10.29.311.3哌啶CAPS10.49.511.5三乙胺（乙酸 10.7 9.711.7 鹽）吡咯烷11.310.312.3通常使用濃度為是是110mM通常使用濃度為是是110mM降低溫度，減少濃度并使否否用色譜柱來延長柱壽命兩性離子緩沖液，同乙腈否否互溶，通常使用濃度為110mM ，氣味小兩性離子緩沖液，比使用否否硼酸鹽對柱子的損傷更小些是是通常使用濃度為110mM兩性離子緩沖液，同乙