醫(yī)學課題開題

1、1 1 開題報告開題報告中性粒細胞誘捕網在支氣管肺發(fā)育中性粒細胞誘捕網在支氣管肺發(fā)育不良的作用及胞外組蛋白拮抗劑對不良的作用及胞外組蛋白拮抗劑對其保護機制探討其保護機制探討 目錄目錄u研究背景研究背景u研究內容研究內容u研究方案研究方案u預期結果預期結果研究背景研究背景支氣管肺發(fā)育不良（BPD）是早產兒尤其是極低出生體重兒最常見的并發(fā)癥，嚴重影響其生長發(fā)育及生存質量。u 支氣管肺發(fā)育不良（支氣管肺發(fā)育不良（BPD）的最新定義的最新定義1：任何氧依賴：任何氧依賴(21)超過超過28天的新生兒。天的新生兒。u 病理特征病理特征：肺泡數量減少，體積增大；肺血管形態(tài)改變，：肺泡數量減少，體積增大；肺血

2、管形態(tài)改變，微血管發(fā)育不良；呼吸道平滑肌輕度增厚，肺纖維化少見微血管發(fā)育不良；呼吸道平滑肌輕度增厚，肺纖維化少見u2010年年NICHD發(fā)布的報告顯示，發(fā)布的報告顯示，20032007年美國年美國20個中心出生體重在個中心出生體重在4011500 g和胎齡在和胎齡在2228周的早產兒周的早產兒68患有患有BPD2，輕度，輕度27，中度，中度23，重，重度度18。一項中國。一項中國10個新生兒重癥監(jiān)護室的調查顯示，個新生兒重癥監(jiān)護室的調查顯示，12351個個37周早產兒中周早產兒中1.26發(fā)生發(fā)生BPD，胎齡，胎齡28周的早產兒周的早產兒BPD的發(fā)生率為的發(fā)生率為1933。發(fā)病率高發(fā)病率高美國中

3、國u 死亡率高，呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、神經系統(tǒng)都有影響，生死亡率高，呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、神經系統(tǒng)都有影響，生長發(fā)育受限長發(fā)育受限預后差預后差u 早產和宮內發(fā)育遲緩早產和宮內發(fā)育遲緩u 遺傳易感性遺傳易感性u 機械通氣機械通氣u 高濃度氧高濃度氧u 營養(yǎng)營養(yǎng)u 動脈導管開放（動脈導管開放（PDA）及室間）及室間隔缺損（隔缺損（VSD）u 感染感染發(fā)病機制和高危因素發(fā)病機制和高危因素BPD患兒氣管抽吸液中眾多炎性標志物證實炎癥反應是患兒氣管抽吸液中眾多炎性標志物證實炎癥反應是BPD發(fā)生啟動的一個中心環(huán)節(jié)。發(fā)生啟動的一個中心環(huán)節(jié)。Landry等等4在在對對1192例早產兒的回顧性分析中發(fā)現(xiàn)，新生兒肺炎

4、膿毒癥與例早產兒的回顧性分析中發(fā)現(xiàn)，新生兒肺炎膿毒癥與BPD密切相關密切相關(OR 1.9，95CI 1.13.2)OR 1.9，95CI 1.13.2新生兒肺炎/膿毒癥BPD感染因素感染因素u在高氧致肺損傷模型中均存在大量在高氧致肺損傷模型中均存在大量中性粒細胞（中性粒細胞（PMN）浸潤及浸潤及中性粒細胞誘捕網（中性粒細胞誘捕網（NETs）過度形過度形成，并通過釋放大量細胞因子、蛋白酶等破壞肺泡上皮細胞及內皮細胞，最終引起肺損傷；通過減成，并通過釋放大量細胞因子、蛋白酶等破壞肺泡上皮細胞及內皮細胞，最終引起肺損傷；通過減少少PMN及及NETs形成可改善肺損傷程度。形成可改善肺損傷程度。高氧致

5、肺高氧致肺損傷模型損傷模型 中性粒細胞中性粒細胞 （PMN）中性粒細胞誘中性粒細胞誘捕網（捕網（NETs）肺損傷uNETs NETs 是由是由PMNPMN釋放到胞外的包含有釋放到胞外的包含有DNADNA、組蛋白、髓過氧化物酶、中性粒細胞彈性蛋白酶、組織蛋、組蛋白、髓過氧化物酶、中性粒細胞彈性蛋白酶、組織蛋白酶白酶G G的網狀結構。的網狀結構。uBrinkmannBrinkmann等等 55發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)，NETsNETs能能殺滅病原微生物殺滅病原微生物。u而而SaffarzadehSaffarzadeh等等88證實組蛋白是證實組蛋白是NETsNETs發(fā)揮作用的關鍵物質發(fā)揮作用的關鍵物質。PMNPM

6、NNETSNDA組蛋白髓過氧化物酶中性粒細胞彈性蛋白酶組織蛋白酶G捕獲并捕獲并殺滅病殺滅病原菌原菌u機體局部出現(xiàn)高濃度機體局部出現(xiàn)高濃度NETs，NETs相關效應分子將會導致組織損傷、器官功能失調或衰竭。相關效應分子將會導致組織損傷、器官功能失調或衰竭。uSaffarzadeh【8】等研究發(fā)現(xiàn)等研究發(fā)現(xiàn)NETs可直接導致肺上皮細胞與內皮細胞死亡，其細胞毒性呈劑量依可直接導致肺上皮細胞與內皮細胞死亡，其細胞毒性呈劑量依賴性；賴性；u給予給予外源性組蛋白外源性組蛋白，可致肺損傷，可致肺損傷: :肺水腫，肺泡間隔增寬，中性粒細胞浸潤，肺出血。肺水腫，肺泡間隔增寬，中性粒細胞浸潤，肺出血。11 11

7、而肝而肝腎等器官損傷不明顯。腎等器官損傷不明顯。1010PMN/NETS過度動脈粥樣硬化、自身免疫性疾病、血管炎、血栓以及腫瘤性、膿毒癥囊性肺纖維化、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、急性肺損傷（ALI）/急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）、肺氣腫、輸血相關性急性肺損傷可直接導致肺上皮細胞與內皮細胞死亡u抗組蛋白抗體抗組蛋白抗體可結合血液中循環(huán)組蛋白可結合血液中循環(huán)組蛋白u肝素、硫酸乙酰肝素肝素、硫酸乙酰肝素可結合循環(huán)組蛋白可結合循環(huán)組蛋白1212，肝素因為高度硫酸化而富含負電，肝素因為高度硫酸化而富含負電荷，組蛋白富含帶正荷，組蛋白富含帶正電荷的精氨酸和賴氨酸，肝素特異性低但高親和力的靜電相互作用可能導致

8、肝素對組蛋白的中和作電荷的精氨酸和賴氨酸，肝素特異性低但高親和力的靜電相互作用可能導致肝素對組蛋白的中和作用。用?？菇M蛋白抗體肝素組蛋白減少改善NETs引起的細胞毒性髓過氧化物酶抑制劑組蛋白是真核生物細胞中染色質的結構蛋白H1、H2A、H2B、H3、H4由細胞凋亡或壞死時染色質發(fā)生降解，釋放到外周血中產生由PMN釋放NETs產生u組蛋白組蛋白引起引起細胞毒細胞毒性的性的作用作用機制：機制：u補體激活補體激活u細胞外組蛋白的完全釋放需細胞外組蛋白的完全釋放需C5aRC5aR和和C5L2C5L2受體的參與受體的參與u導致導致C5aC5a受體破壞作用受體破壞作用u通過鈣離子內流引發(fā)了細胞毒性通過鈣離

9、子內流引發(fā)了細胞毒性u誘導髓過氧化物酶（誘導髓過氧化物酶（MPOMPO） 高氧致BPD發(fā)病機制中有PMN過度浸潤及NETs的過度形成NETs通過胞外組蛋白、髓過氧化物酶等破壞肺泡上皮細胞及血管內皮細胞，使肺發(fā)育受阻，最終導致BPD發(fā)生。本課題擬通過檢測高氧致BPD模型中NETs及胞外組蛋白含量進一步明確其發(fā)病機制，并通過胞外組蛋白拮抗劑（抗組蛋白抗體、肝素）阻斷胞外組蛋白來破壞NETs結構，從而干擾其對肺泡上皮細胞及血管內皮細胞的破壞作用，最終改善BPD，為BPD發(fā)病機制及臨床治療提供一定的理論依據。實驗構想實驗構想高氧致BPD模型NETs胞外組蛋白抗組蛋白抗體肝素破壞治療BPD研究內容研究內

10、容o 1）建立高氧致）建立高氧致BPD模型。模型。o 2）共聚焦成像技術識別）共聚焦成像技術識別NETs結構。結構。o 3）檢測胞外組蛋白水平。）檢測胞外組蛋白水平。o 4）通過組蛋白拮抗劑（抗組蛋白抗體、肝素）破壞）通過組蛋白拮抗劑（抗組蛋白抗體、肝素）破壞NETs結構，觀察肺組織病理變化結構，觀察肺組織病理變化。研究方案研究方案 新生SD大鼠空氣組BPD組BPD+外源性組蛋白BPD+抗組蛋白抗體BPD+肝素組4、7、14、21d評價指標肺組織形態(tài)NETs、細胞外組蛋白機制探討、治療研究空白對照組外源性組蛋白外源性組蛋白：（1 1）給予）給予8-98-9周的周的Wister Wister 大

11、鼠注入大鼠注入30mg/kg30mg/kg、50mg/kg50mg/kg、80mg/kg80mg/kg牛胸腺組蛋白牛胸腺組蛋白，2-242-24小時觀察肺病理，提示肺損傷呈劑量小時觀察肺病理，提示肺損傷呈劑量依賴性。依賴性。1111，規(guī)格：濃度，規(guī)格：濃度25ug/ml25ug/ml。1212（2 2）給予）給予75mg/kg75mg/kg，逐漸出現(xiàn)呼衰、心衰，逐漸出現(xiàn)呼衰、心衰，2 2小時后死亡。小時后死亡。1010劑量劑量抗組蛋白抗體抗組蛋白抗體：（1 1）急性肺損傷模型中，小劑量）急性肺損傷模型中，小劑量( (2 255 mg55 mgkgkg) )中和抗體保護作用不明顯，大劑量中和抗中

12、和抗體保護作用不明顯，大劑量中和抗體體( (101020 mg20 mgkgkg) )可明顯降低病死率?？擅黠@降低病死率。114 4 （2 2）給予）給予10mg/kg10mg/kg，可糾正使用相同劑量外源性組蛋白后引起的肺損傷。，可糾正使用相同劑量外源性組蛋白后引起的肺損傷。1010肝素、硫酸乙酰肝素肝素、硫酸乙酰肝素:10 mg/kg:10 mg/kg，保護作用；，保護作用；20 mg/kg20 mg/kg，硫酸乙酰肝素保護作用，肝素加重，硫酸乙酰肝素保護作用，肝素加重肺損傷。肺損傷。113 3 人體組蛋白水平人體組蛋白水平：正常：正常 中位數中位數2.3ug/ml2.3ug/ml，四分位

13、數間距，四分位數間距0.5-3.60.5-3.6；外傷性肺損傷；外傷性肺損傷 中位數中位數28.6ug/ml28.6ug/ml，四分位數間距，四分位數間距13.7-58.9ug/ml13.7-58.9ug/ml。組蛋白大于。組蛋白大于50 ug/ml50 ug/ml，損傷明顯。，損傷明顯。1010鼠組蛋白水平鼠組蛋白水平：外傷性肺損傷后：外傷性肺損傷后4 4小時可達到小時可達到190ug/ml190ug/ml；1010劑量劑量1 1 實驗動物實驗動物、器材、器材和試劑和試劑u動物實驗動物實驗已已得到得到溫州醫(yī)科大學溫州醫(yī)科大學動物管理和應用委員會的許可動物管理和應用委員會的許可uSDSD大鼠：

14、雌性大鼠：雌性1 16 6只（體重只（體重220-240g220-240g），雄性），雄性8 8只（體重只（體重300-310g300-310g），購自溫州醫(yī)科大學），購自溫州醫(yī)科大學動動物實驗中心物實驗中心u氧箱氧箱（規(guī)格）、24h HBO-2B型控氧儀（浙江建德梅域電化分析儀器廠）、測氧裝置（德測氧裝置（德國國 Envite C-Wismar）、二氧化碳檢測二氧化碳檢測儀儀、電子天平（梅特勒電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司托利多儀器有限公司 檢測分度值檢測分度值0.001g）、氧氣（購買于氧氣（購買于歐源氣體公司歐源氣體公司）u刀片、組織剪、線剪、鑷子、膠布、刀片、組織剪、線剪、鑷子、

15、膠布、100ul100ul胰島素針、胰島素針、10ml10ml注射器、凍存管、注射器、凍存管、EPEP管、離心管、離心機、移液槍、酒精、機、移液槍、酒精、4%4%多聚甲醛、水合氯醛、無水氯化鈣多聚甲醛、水合氯醛、無水氯化鈣u外源性組蛋白（外源性組蛋白（ugug/ml/ml）、抗組蛋白抗體）、抗組蛋白抗體()()、組蛋白檢測試劑盒、組蛋白檢測試劑盒(ELISA(ELISA法法) )、蛋白定量試劑、蛋白定量試劑盒、硫酸乙酰肝素盒、硫酸乙酰肝素 材料與方法材料與方法u2 2 動物分組和模型制備動物分組和模型制備u配鼠：配鼠：按雌雄比為按雌雄比為2:12:1進行配種，即進行配種，即2 2只雌鼠與只雌鼠

16、與1 1只雄鼠共同放進一個鼠籠，通過只雄鼠共同放進一個鼠籠，通過陰道涂片找精子細胞作為雌鼠受孕成功的參考依據。及時清潔鼠籠、補充食物陰道涂片找精子細胞作為雌鼠受孕成功的參考依據。及時清潔鼠籠、補充食物和水。和水。u雌鼠約孕雌鼠約孕3 3周生產，選取子鼠周生產，選取子鼠1 16868只，體重只，體重6-8g6-8g進行實驗進行實驗u分組：空氣組（分組：空氣組（A A組）、組）、BPDBPD組（組（B B組）、組）、BPD+BPD+外源性組蛋白組（外源性組蛋白組（C C組）、組）、BPD+BPD+抗抗組蛋白抗體組（組蛋白抗體組（D D組）、組）、BPD+BPD+肝素組（肝素組（E E組）、空白對照

17、組（組）、空白對照組（F F組）組）uA A、B B每組各設每組各設3 3小組，每小組小組，每小組1212只，只，C C、D D、E E、F F每組各設每組各設2 2小組，每小組小組，每小組1212只只 u空氣組（空氣組（A A組）組）：置于空氣中飼養(yǎng)：置于空氣中飼養(yǎng)uBPDBPD組（組（B B組）組）：置于氧箱（：置于氧箱（91%91%氧濃度、氧濃度、0.5%0.5%二氧化碳濃度）二氧化碳濃度）uBPD+BPD+外源性組蛋白組（外源性組蛋白組（C C組）組）：處理方法同處理方法同BPD組組，于生后第四天內眥靜脈注射，于生后第四天內眥靜脈注射外源性組蛋白外源性組蛋白uBPD+BPD+抗組蛋白抗

18、體組（抗組蛋白抗體組（D D組）組）：處理方法同處理方法同BPD組組，于生后第四天內眥靜脈注射，于生后第四天內眥靜脈注射抗組蛋白抗體抗組蛋白抗體uBPD+BPD+肝素組（肝素組（E E組）：組）：處理方法同處理方法同BPD組組，于生后第四天內眥靜脈注射肝素，于生后第四天內眥靜脈注射肝素u空白對照組（空白對照組（F F組）：組）：處理方法同處理方法同BPD組組，于生后第四天內眥靜脈注射非特異性，于生后第四天內眥靜脈注射非特異性IgGu氧箱內母鼠需每天更換代乳母鼠，防治母鼠氧中毒氧箱內母鼠需每天更換代乳母鼠，防治母鼠氧中毒 uA A組、組、B B組生后第組生后第4 4、7 7、1010、1414、

19、2121天，每次取天，每次取6 6只鼠的只鼠的血標本、肺標本血標本、肺標本；C C、D D、E E、F F組第組第7 7、1010、1414、2121天，每次取天，每次取6 6只鼠只鼠血標本、肺標本血標本、肺標本；u予予4%4%水合氯醛腹腔注射麻醉，用水合氯醛腹腔注射麻醉，用100ul100ul針頸靜脈取針頸靜脈取血血，5000r/min5000r/min離心離心10min10min，留取上清液，留取上清液, ,置于置于44冰箱保存；取冰箱保存；取肺肺標本，標本，3 3只只10%10%多聚甲醛肺多聚甲醛肺灌注后置于盛有多聚甲醛液的灌注后置于盛有多聚甲醛液的EPEP管內，置于管內，置于44冰箱保

20、存；冰箱保存；3 3只取肺取后只取肺取后于凍存管，置于于凍存管，置于-80-80冰箱保存。冰箱保存。 標本留取及保存方法標本留取及保存方法o動物一般狀態(tài)：毛發(fā)顏色、呼吸、精神及反應。動物一般狀態(tài)：毛發(fā)顏色、呼吸、精神及反應。o死亡及生長情況：死亡率、死亡時間、體重增長死亡及生長情況：死亡率、死亡時間、體重增長等。等。o肺組織形態(tài)學觀察不同組肺組織病理變化：肺組織形態(tài)學觀察不同組肺組織病理變化：取自取自小鼠左肺葉的組織浸泡在小鼠左肺葉的組織浸泡在1010甲醛溶液中甲醛溶液中24 h24 h，用石蠟包埋，用石蠟包埋，乙醇梯度脫水乙醇梯度脫水，切成切成4 um4 um的切片，的切片，采用采用HEHE

21、染色后于光鏡下觀察肺組織形態(tài)。染色后于光鏡下觀察肺組織形態(tài)。RACRAC（放（放射肺泡計數）：自終末細支氣管中心到最近的纖射肺泡計數）：自終末細支氣管中心到最近的纖維隔或肺邊緣作垂直線，該線上的肺泡個數。維隔或肺邊緣作垂直線，該線上的肺泡個數。 計劃觀察指標計劃觀察指標o共聚焦成像技術識別共聚焦成像技術識別NETs結構：分別用中性結構：分別用中性粒細胞彈性蛋白酶抗體、粒細胞彈性蛋白酶抗體、DAPI及組蛋白及組蛋白H1抗體進行免疫組化染色，并采用共聚焦成像抗體進行免疫組化染色，并采用共聚焦成像技術觀察技術觀察NETs結構。結構。o檢測胞外組蛋白水平：以檢測胞外組蛋白水平：以ELISA法檢測法檢測

22、SD大鼠外周血胞外組蛋白水平變化，主要是大鼠外周血胞外組蛋白水平變化，主要是H3、H4變化。變化。o通過組蛋白拮抗劑（抗組蛋白抗體、肝素）通過組蛋白拮抗劑（抗組蛋白抗體、肝素）破壞破壞NET結構，觀察肺組織病理變化。結構，觀察肺組織病理變化。o肺組織肺組織PCR/WB 計劃觀察指標計劃觀察指標采用采用SPSS SPSS 統(tǒng)計軟件分析，計量資料以統(tǒng)計軟件分析，計量資料以 x xs s表示，采用單因素方差分析，組間表示，采用單因素方差分析，組間多重比較采用多重比較采用LSD-tLSD-t檢驗，檢驗，P0P BPDBPD組組 空氣組，空氣組，BPD+BPD+抗組蛋白抗體組抗組蛋白抗體組 BPDBPD

23、組，組，BPD+BPD+肝素組肝素組 BPDBPD組組；BPD+BPD+抗組蛋白抗體組、抗組蛋白抗體組、BPD+BPD+肝素組、空氣組對比？肝素組、空氣組對比？u 得出組蛋白對細胞及肺血管內皮的毒性作用作為得出組蛋白對細胞及肺血管內皮的毒性作用作為BPDBPD的發(fā)生的發(fā)生發(fā)展中的因素發(fā)展中的因素u 抗組蛋白抗體、肝素的應用能夠阻止抗組蛋白抗體、肝素的應用能夠阻止BPDBPD的發(fā)生發(fā)展的發(fā)生發(fā)展預期結果預期結果36年度計劃年度計劃u 20152015年年7 7月月-2015-2015年年9 9月月 完成空氣組、完成空氣組、高氧組標本獲取。高氧組標本獲取。u 2012015 5年年1 10 0月月

24、-201-2015 5年年1212月月 完成實驗組完成實驗組、對照組標本獲取。、對照組標本獲取。u 2012016 6年年1 1月月-201-2016 6年年2 2月月 完成血漿組蛋完成血漿組蛋白測定、肺組織病理切片、白測定、肺組織病理切片、PCRPCR、WBWB。u 2012016 6年年3 3月月-201-2016 6年年6 6月數據整理分析，月數據整理分析，論文撰寫。論文撰寫。 u 參考文獻參考文獻1 Jobe AH1 Jobe AH，Bancalari EBancalari EBrenchopulmonary dysplasiaJBrenchopulmonary dysplasiaJA

25、m J Am J Respir Crit Care MedRespir Crit Care Med，20012001，163(7)163(7)：17231729172317292 Stoll BJ2 Stoll BJ，Hanson NIHanson NI，Bell EFBell EF，et a1et a1Eunice Kennedy Shriver Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development Neonatal National Institute of Child Health

26、and Human Development Neonatal Research NetworkResearch NetworkNeonatal outcomes of extremely preterm infants from Neonatal outcomes of extremely preterm infants from the NICHD Neonatal Research NetworkJthe NICHD Neonatal Research NetworkJPediatricsPediatrics，20102010，126(3)126(3)：443-443-4564563 3

27、早產兒支氣管肺發(fā)育不良調查協(xié)作組早產兒支氣管肺發(fā)育不良發(fā)生率早產兒支氣管肺發(fā)育不良調查協(xié)作組早產兒支氣管肺發(fā)育不良發(fā)生率及高危因素的多中心回顧調查分析及高危因素的多中心回顧調查分析JJ中華兒科雜志，中華兒科雜志，201l201l，49(9)49(9)：655-662655-6624 Landry JS4 Landry JS，Menzies DMenzies DOccurrence and severity of Occurrence and severity of brenchopulmonary dysplasia and respiratory distress syndrome afte

28、r a brenchopulmonary dysplasia and respiratory distress syndrome after a preterm birthJpreterm birthJPaediatr Child HealthPaediatr Child Health，201l201l，16(7)16(7)：399-403399-4035Brinkmann V5Brinkmann V，Reichard UReichard U，Goosmann CGoosmann C，et a1et a1Neutrophil Neutrophil extraeellular traps kil

29、l bacteriaJScienceextraeellular traps kill bacteriaJScience，20042004，303(5663)303(5663)：532532153515356von KSckritzBlickwede M6von KSckritzBlickwede M，Goldmann 0Goldmann 0，Thulin PThulin P，et a1et a1Phagocytosisindependent antimicrobial activity of mast cells by Phagocytosisindependent antimicrobial

30、 activity of mast cells by means of extracellular trap formationJ1means of extracellular trap formationJ1BloodBlood，20082008，111(6)111(6)：30703070308030807Kawasaki H7Kawasaki H，1wamuro S1wamuro SPotential roles of histories in host Potential roles of histories in host defensedefenseas antimicrobial

31、agentsJjas antimicrobial agentsJjInfect Disord DrugTargetsInfect Disord DrugTargets。20082008，8(3)8(3)：195205195205 8 8 Saffarzadeh MSaffarzadeh M，Juenemann CJuenemann C，Queisser MAQueisser MA，et a1et a1Neutrophil Neutrophil cxtraeellular traps directly induce epithelial and endothelial cellcxtraeell

32、ular traps directly induce epithelial and endothelial celldeathdeath：8 predominant role of histones J8 predominant role of histones JPLoS OnePLoS One，20122012，7(2)7(2)：e32366e323669Zeerleder S9Zeerleder S，Zwart BZwart B，Wuillemin WAWuillemin WA，et a1et a1Elevated nueleosome Elevated nueleosome levels in systemic inflammation and sepsis lJjlevels in systemic inflammation and sepsis lJjCrit Care MedCrit