反義核苷酸技術(shù)教學(xué)提綱

1、反義核苷酸技術(shù) RNA干擾干擾(RNA interference，RNAi)是雙鏈?zhǔn)请p鏈RNA特異性地結(jié)合到特異性地結(jié)合到與之序列互補(bǔ)的與之序列互補(bǔ)的mRNA上，導(dǎo)致上，導(dǎo)致mRNA降解，從而介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄水平基因表降解，從而介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄水平基因表達(dá)抑制。達(dá)抑制。脫靶效應(yīng)脫靶效應(yīng)定義：定義：影響因素影響因素檢測方法：檢測方法：如何盡量避免？如何盡量避免？ 指指siRNA轉(zhuǎn)染中的非特異反應(yīng)，這不僅包轉(zhuǎn)染中的非特異反應(yīng)，這不僅包括括siRNA序列，還包括轉(zhuǎn)染試劑本身或其他相序列，還包括轉(zhuǎn)染試劑本身或其他相關(guān)因素對轉(zhuǎn)染細(xì)胞的其他相關(guān)基因發(fā)生非特異關(guān)因素對轉(zhuǎn)染細(xì)胞的其他相關(guān)基因發(fā)生非特異性的表達(dá)變化，從而導(dǎo)致假

2、陽性和假陰性。性的表達(dá)變化，從而導(dǎo)致假陽性和假陰性。基因表達(dá)譜芯片基因表達(dá)譜芯片siRNAsiRNA濃度濃度轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染試劑2、采用不同轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)、采用不同轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)1、針對同一靶基因設(shè)計、針對同一靶基因設(shè)計2條以上抑制效率條以上抑制效率在在70以上的不同以上的不同siRNA序列，分別進(jìn)行序列，分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn) 一、一、RNAi基本概念及相關(guān)作用機(jī)制基本概念及相關(guān)作用機(jī)制 二、二、siRNA序列設(shè)計及制備；脫靶效應(yīng)序列設(shè)計及制備；脫靶效應(yīng) 三、三、siRNA轉(zhuǎn)染過程相關(guān)問題轉(zhuǎn)染過程相關(guān)問題siRNA轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染方法：方法：轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體類脂質(zhì)體類非脂質(zhì)體聚合物類非脂質(zhì)體聚合物類

3、lipofectamineTM 2000和RNAiMAXEntransterTM 轉(zhuǎn)染過程相關(guān)問題轉(zhuǎn)染過程相關(guān)問題1、細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞數(shù)量2、siRNA濃度濃度3、血清、血清4、抗生素、抗生素5、轉(zhuǎn)染后換液、轉(zhuǎn)染后換液6、轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化、轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化7、RNAi檢測方法檢測方法化學(xué)方法，電轉(zhuǎn)化化學(xué)方法，電轉(zhuǎn)化系列(EntransterTM-R)siRNA Lipofectamine RNAiMAX ReagentDilute Lipofectamine RNAiMAX Reagent in Opti-MEM mediumDilute siRNA in Opti-MEM mediumAdd Diluted siRNA to Diluted Lipofectamine RNAiMAX Reagent (1:1 rati