分子實驗室手冊

1、LogoLogo第三篇第三篇 實驗部分實驗部分第7章 配制試劑和緩沖液第8章 貯藏和處理第9章 無菌操作技術 LogoLogo第七章第七章配制試劑和緩沖液配制試劑和緩沖液 Logo確定所需之物確定所需之物配制試劑與緩沖液配制試劑與緩沖液1計算所需之物計算所需之物2稀釋儲備的緩沖液稀釋儲備的緩沖液3稱量和混合稱量和混合4測定測定pHpH值值5緩沖液和溶液的儲存緩沖液和溶液的儲存溶液滅菌溶液滅菌67一、確定所需之物一、確定所需之物1.熟讀整個試驗程序,寫下所需要用到的試劑。2.確定每一種試劑你要配制多少。3.確定配制直接使用的溶液還是配制高濃度的 儲備液。4.確認需要的化學試劑可以在實驗室里找到。

2、5.如果沒有庫存應盡快獲得藥品。 安全性安全性1.1.清楚你所接觸的每一個藥品的組分及相關毒清楚你所接觸的每一個藥品的組分及相關毒 性性2.2.遵照建議處理遵照建議處理 （手套 眼睛保護 櫥罩 面罩 標簽）3.3.知道如何使用通風櫥知道如何使用通風櫥常見有害試劑常見有害試劑丙烯酰胺丙烯酰胺 神經(jīng)毒性，用于蛋白質(zhì)電泳凝膠和測序凝 膠的制備，要戴面罩。溴化乙錠溴化乙錠 EtBr是一種誘變劑，能嵌入DNA，用于核 酸標記。有毒，固體可以刺激皮膚和黏膜。酚酚 強腐蝕性，可以灼傷皮膚，萃取和配制時應使用 通風櫥。苯甲基磺酰氟（苯甲基磺酰氟（PMSFPMSF）分離蛋白質(zhì)時用于對蛋白水 解酶的抑制，吞咽或通

3、過皮膚吸收都有可能致命十二烷基硫酸鈉（十二烷基硫酸鈉（SDSSDS）去垢劑，易燃，尤其對于 鼻腔刺激性強，SDS質(zhì)地光滑蓬松，稱量時要動作 要輕盈和戴面罩。水質(zhì)分類水質(zhì)分類級別級別特性特性用途用途自來水常含有氯化物、碳酸鹽、硫酸鹽、泥沙及少量有機物等雜質(zhì)僅用于清洗玻璃器皿和其他實驗設備實驗級用水（三級水）含有一些離子雜質(zhì)配置緩沖液試劑級用水（二級水）含有微量的無機、有機或膠態(tài)雜質(zhì) 用于無機痕量分析等試驗，如原子吸收光譜分析用水 超純試劑級用水（一級水）基本上不含有溶解或膠態(tài)離子雜質(zhì)及有機物 一級水用于有嚴格要求的分析試驗，包括對顆粒有要求的試驗，如高壓液相色譜用 ，及細胞實驗塑料和玻璃器皿塑料

4、和玻璃器皿用于混合的玻璃器皿用于混合的玻璃器皿 燒杯 三角燒瓶 試管 容量瓶不能用于混合的玻璃器皿不能用于混合的玻璃器皿 量筒儲存緩沖液的玻璃器皿儲存緩沖液的玻璃器皿 帶線紋蓋的玻璃瓶 細胞培養(yǎng)液玻璃瓶 細口瓶不適合用于緩沖液儲存的器皿不適合用于緩沖液儲存的器皿 廣口燒瓶 琥珀色容器 線紋蓋子封口不嚴密二、計算所需之物二、計算所需之物1.1.計算物質(zhì)的量濃度計算物質(zhì)的量濃度2.2.當量濃度（當量濃度（N N） 1L水溶液中溶解的溶質(zhì)的用氫的當量物除摩爾質(zhì)量3.3.質(zhì)量分數(shù)溶液質(zhì)量分數(shù)溶液 質(zhì)量體積分數(shù)（W/V） 體積分數(shù) (V/V) 質(zhì)量/質(zhì)量分數(shù) (W/W) 三、稀釋儲備的緩沖液三、稀釋儲備

5、的緩沖液連續(xù)稀釋連續(xù)稀釋 410稀釋前 溶液mg/ml100ul100ul100ul900ul900ul900ul900ul110210310410100ul制備酚和酚氯仿制備酚和酚氯仿酚酚 無色透明，可直接用于分子克隆。 （注意：強腐蝕性，會灼傷皮膚，應帶口罩、護目鏡，穿防護衣，在通風櫥內(nèi)進行。）平衡酚平衡酚 使用前，必須將酚平衡到PH7.8，因為DNA在酸性條件下會進入有機相。酚：氯仿：異戊醇酚：氯仿：異戊醇 （25:24:125:24:1） 含等量酚-氯仿-異戊醇的混合物常在抽提核酸的實驗中使用，以除去蛋白質(zhì)。氯仿能夠使蛋白質(zhì)變性，且有助于水相和有機相分離，異戊醇可以減少萃取過程中產(chǎn)生的

6、泡沫。四四. .稱量和混合稱量和混合準備所需準備所需 稱量紙 稱量器皿 刮刀、藥匙 干凈的量筒 燒杯或三角燒瓶 磁力攪拌器和攪拌子 處置藥匙和磁力攪拌子的地方 擦拭紙 蒸餾水稱量稱量1.1.稱量時戴上手套。稱量時戴上手套。2.2.閱讀瓶上的標簽。閱讀瓶上的標簽。（是否戴面罩）3.3.打開天平電源。打開天平電源。4.4.稱量紙及稱量器的重量。稱量紙及稱量器的重量。5.5.稱量材料。稱量材料。（能放回藥品瓶中多余的藥品：該物質(zhì)沒有吸濕性；除了干凈的稱量紙及稱量器，沒有接觸過其他物品。）6.6.藥品倒入燒杯或三角燒瓶中。藥品倒入燒杯或三角燒瓶中。7.7.緊緊該上藥品瓶蓋。緊緊該上藥品瓶蓋。8.8.稱

7、量結(jié)束，打掃天平。稱量結(jié)束，打掃天平。（不能馬上加水的藥品，用鋁箔或者塑料紙蓋住燒杯口，做上標記，放到自己的試驗臺上。）混合混合：（對于多數(shù)溶液）1.加入終體積約80%的水到燒杯中，然后加固體溶質(zhì)。2.輕輕放入磁力攪拌子，確保能有足夠空間自由轉(zhuǎn)動。3.先把燒杯放在磁力攪拌器上，打開低速攪拌開關，緩 慢調(diào)大轉(zhuǎn)速。4.待溶質(zhì)充分溶解后停止攪拌。5.把溶解完全的溶液倒入量筒或燒杯中，測定體積，加溶劑使整個溶液的體積接近所需體積的90%。6.將溶液倒回燒杯或三角瓶中，調(diào)pH值。7.在燒杯上標記好內(nèi)容物。五、測定五、測定pHpH值值 校準校準PHPH計計至少兩種PH標準溶液（通常使用PH4和10的標準

8、液。）34個50ml的玻璃或塑料藥品杯棉紙校準校準PHPH計計1.將電極從浸泡緩沖液中拿出，用蒸餾水沖洗，用棉紙巾小心擦干電極外面的液體。2.倒出約1.5英寸的PH4（或10）的標準溶液，倒在小燒杯中，蓋上瓶蓋，把電極頭浸入燒杯的溶液中。3.按下PH計上的“標準化”按鈕，直到儀器上顯示穩(wěn)定的PH為4。4.按下“待命”按鈕，拿出電極清洗干凈并擦干。5.把PH10的溶液倒入另外的燒杯中，用同樣方法標定。6.標定后清洗擦干，把電極插回保存液中保存。7.測定標準化緩沖液的PH。測定測定PHPH1.在磁力攪拌器上攪拌準備調(diào)PH的溶液。2.將電極從保存液中取出，用蒸餾水沖洗干凈，棉紙擦干，PH計的狀態(tài)應保

9、持在“待命”。3.把電極頭進入需測定的溶液中，并確定攪拌子不會碰撞到電極。4.將PH計上的轉(zhuǎn)換開關從“待命”轉(zhuǎn)到“PH測定”。5.讀取數(shù)值，并用 NaOH或HCl進行調(diào)節(jié)。6.將PH計的功能調(diào)回到“待命”。7.將電極拿出，用蒸餾水沖洗干凈并用棉紙擦干。8.將電極浸入儲存緩沖液。9.把調(diào)好PH的溶液倒入量筒或容量瓶，定容。10.把定容的溶液倒入有蓋的玻璃瓶或塑料瓶中密封。11.在瓶子上貼上標簽，滅菌。六、溶液滅菌六、溶液滅菌高壓滅菌高壓滅菌大多數(shù)緩沖液，不明確的細菌和酵母培養(yǎng)基。不能高壓滅菌不能高壓滅菌l含有去垢劑的緩沖液，如10%SDS，會因沸騰溢出。l有機溶劑，包括酚。l含有熱不穩(wěn)定的成分，

10、如血清、維生素、抗體、 BSA 等蛋白質(zhì)。l哺乳動物、植物和昆蟲的培養(yǎng)基。l含HEPES的溶液。l 含有DTT二硫蘇糖醇或BME的溶液。高壓滅菌高壓滅菌1.將待滅菌器材、試劑放入高壓蒸鍋內(nèi)，裝液體的瓶中液體不能超過2/3，蓋緊蓋子后松動一圈，或用鋁箔紙包緊； 2.高壓滅菌開始時，先打開排氣口，待熱水蒸氣排出數(shù)分鐘后，關閉閥門滅菌，調(diào)溫，20分鐘。待壓力降到0后放氣；3.滅菌后，讓瓶子冷卻，并及時扭緊瓶蓋； 4.可以將高壓蒸鍋蓋留一條縫，在加熱至100度，冷卻后高壓蒸鍋內(nèi)的器材也自動烘干了。 5. 一般器材開15-20分鐘即可，液體30分鐘。 高壓滅菌高壓滅菌注意： 1有時裝液體的瓶子可能破裂，

11、可將瓶子放在鋼制托盤中，防止瓶子一旦破裂時，試劑流入高壓鍋內(nèi)。2高壓滅菌全過程中，應有專人看護。 3強酸、強堿、揮發(fā)性液體、爆炸性物質(zhì)不能開蒸鍋。過濾除菌過濾除菌 用于熱不穩(wěn)定的、易揮發(fā)的或體積小于20ml的溶液。利用重力、加壓或真空的方法，使溶液通過孔徑足夠小的膜除去微生物。 0.2微米的濾膜緩沖液和一般培養(yǎng)基 0.1微米的濾膜組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基七、緩沖液和溶液的儲存七、緩沖液和溶液的儲存培養(yǎng)液應該在4儲存。緩沖液可以在4或者室溫儲存。濃度高的溶液室溫保存。光敏感試劑應該在適宜的溫度下在棕色瓶中儲存，或放在盒子里的瓶內(nèi)保存，瓶外裹上鋁箔保存也可以。LogoLogo第八章第八章 貯藏和處理貯藏和

12、處理 Logo緊急貯藏緊急貯藏1儲存試劑儲存試劑2分裝分裝3冰箱和冷庫冰箱和冷庫4實驗室廢物的處理實驗室廢物的處理5 貯藏和處理貯藏和處理緊急貯藏緊急貯藏物品物品緊急貯藏方式緊急貯藏方式酸或堿直接留在實驗臺上；單獨保存酸和堿單克隆和多克隆抗體多數(shù)純化過的抗體長期在4保存，但有一些需要-20保存分析管可以在4保存，但試驗的穩(wěn)定性不同（大多數(shù)比色反應不能過夜測定）緩沖液4細胞返回原處或丟棄去垢劑室溫DNA4緊急貯藏緊急貯藏物品物品緊急貯藏方式緊急貯藏方式酶大多數(shù)限制性內(nèi)切酶保存在-20，但一定要先閱讀說明，有些酶不能冷凍乙醇室溫生長因子和細胞因子-20PCR反應4RNA酒精中-20，水溶液-70脂

13、類-20，大多數(shù)脂類不穩(wěn)定，對氧氣或光線敏感，或者隨溫度變化而改變培養(yǎng)基4緊急貯藏緊急貯藏細胞細胞平板或穿刺培養(yǎng)物4液體培養(yǎng)物4凍干培養(yǎng)物4冷凍培養(yǎng)物-70放射性同位素放射性同位素 32P核苷酸態(tài)的，-20；磷酸鹽的，4 33P4 35S甲硫氨酸的硫，-70 125I125I 蛋白質(zhì)A，4；單質(zhì) 125I 通風櫥室溫保存 3H4 14C4儲存試劑儲存試劑儲存試劑的須知儲存和丟棄須知的獲取怎樣保存需要干貯的試劑如何儲存光敏感試劑如何儲存氧敏感試劑儲存試劑的須知儲存試劑的須知溫度要求把試劑儲存在烘箱、室溫、冰箱、低溫冷柜或液氮中空氣要求注意試劑是否對氧氣敏感，或者需要其他氣體保存濕度要求如果水蒸氣

14、對試劑有害，那么必須干貯或者真空保存相關的危害相關的危害：注意試劑是否是放射性同位素、易燃、劇毒或揮發(fā)性的。 試劑必須按照儲存要求存放。儲存和丟棄須知的獲取儲存和丟棄須知的獲取物質(zhì)安全資料表（MSDS）Merck手冊環(huán)境健康與安全部門部在因特網(wǎng)上搜索怎樣保存需要干貯的試劑怎樣保存需要干貯的試劑容器容器 容器必須能蓋緊，內(nèi)部有放干燥劑的空間。對于一些試劑，廣口瓶是最好的。對于更大的瓶子來說，玻璃或塑料的干燥器是必需的。干燥器有不同的形狀、大小和材料，應該首先考慮大小。性質(zhì)活潑的試劑需要真空保存，任何用于厭氣培養(yǎng)細菌的容器也需要真空潤滑劑。干燥劑干燥劑 干燥劑通常是藍色或紫色粗糙的碳酸鈣小圓球，或

15、是相類似的圓球。干燥劑一般裝在袋子、桶或是有孔的罐子里。干燥劑也可以用于氣體的干燥，但大多數(shù)實驗室并不采用。 干燥器干燥器 PC-3PC-3塑料真空干燥器塑料真空干燥器玻璃干燥器玻璃干燥器如何儲存光敏感試劑如何儲存光敏感試劑棕色瓶或琥珀色瓶儲存，或者用鋁箔包好。管裝試劑可以放在盒子中，可凍存或運輸?shù)暮凶幼钸m合。將常規(guī)信息貼在盒子上，如“內(nèi)有光敏感試劑”，但是光敏感試劑應是盒子中的唯一試劑，不要在盒子中到處尋找其他試劑。常見的光敏感試劑有放線菌素D、絲裂菌素C、氮藍四唑(NBT)、酚、利福霉素和四環(huán)素。如何儲存氧敏感試劑如何儲存氧敏感試劑1.氮氣瓶必須放在化學通風櫥的附近，因為通常有機溶劑的溶液

16、需要氮氣，使用時打開通風櫥。2.確定氮氣瓶用帶子固定住。3.將巴氏管插入和壓力調(diào)節(jié)器相連的管子中。4.打開氮氣，將流量調(diào)節(jié)到將管子靠近手背也幾乎感覺不到為止。5.在通風櫥中打開試管或瓶子，試管和瓶子應妥善的放置在架子上。6.將巴氏管的尖端放入容器口至能看到液體表面有波浪，保持5-10秒，較高的液體-氣體比例需更長的時間。7.迅速蓋上容器。8.關掉氮氣。9.保存瓶子，通常保存在-20，也可以保存在真空。分裝分裝為什么要分裝什么時候不用分裝如何分裝為什么要分裝為什么要分裝防止儲存液反復凍融造成的降解避免多次使用造成的污染空間上方便節(jié)省時間什么時候不用分裝什么時候不用分裝稀釋的物質(zhì)不穩(wěn)定不常用的物質(zhì)

17、使用不同濃度或濃度變化范圍較大的物質(zhì)如何分裝如何分裝配制儲備液須知：物質(zhì)的工作濃度在什么溶劑中溶解物質(zhì)分裝的體積決定配成幾倍。準備好無菌的管子，做好標簽。如果要分裝的物質(zhì)必須冷藏，就把管子置于冰上。配制濃溶液，如果需要，過濾。把配好的無菌溶液分裝到試管,存放在冷藏庫或者是合適溫度的架子上。在記錄本上做好記錄。冰箱和冷庫冰箱和冷庫使用適當?shù)谋浠蚶洳貛熘挥性谌≡噭┑臅r候才打開冰箱門冰箱或冷藏庫內(nèi)所有容器都必須有標簽定期清理那些已經(jīng)不用的試劑把所有試劑放置的位置記錄下來尊重私人空間怎樣除霜怎樣除霜除霜工作應該提前一個星期做計劃除霜前的清理是丟棄無用試劑的好時機仔細地把所有試管包好除霜要在上午盡可能

18、早的時候開始戴好手套除冰備好任何可以吸水的東西，還有放置丟棄吸水物的盆除霜用吹風機加速除霜除去所有產(chǎn)生的水保持地面干燥把除過霜的冰箱擦干凈等到冰箱完全干了才能插上電源記錄試劑的放置位置實驗室廢物的處理實驗室廢物的處理實驗室廢物處理須知：實驗室廢物處理須知：化學組成有危害還是無危害是否有放射性是否有生物危害是否可以回收利用處理的優(yōu)先順序處理的優(yōu)先順序1.放射性，固體；2.放射性，液體；3.化學危害廢物；4.生物危害廢物；5.尖利物品；6.無害的化學物品。LogoLogo第九章第九章 無菌技術操作無菌技術操作 Logo何時使用無菌技術何時使用無菌技術1無菌技術無菌技術2保護實驗人員保護實驗人員3

19、無菌技術操作無菌技術操作什么時候使用無菌技術什么時候使用無菌技術當必須進行無菌操作時當必須進行無菌操作時 無論什么時候在進行活的有機體實驗或是為進行活體實驗二準備培養(yǎng)基、緩沖液、培養(yǎng)容器等時，必須使用無菌操作技術，例如：準備轉(zhuǎn)化用的大腸桿菌培養(yǎng)物制備LB平板培養(yǎng)基分裝細胞過濾培養(yǎng)基的血清打開和溶解凍細胞什么時候使用無菌技術什么時候使用無菌技術 在無菌操作有幫助的情況下在無菌操作有幫助的情況下限制性酶切反應限制性酶切反應：雖然大部分酶被保存在甘油中，而且甘油濃度大于50%時通常不會長菌，但是在稀釋酶和進行沒有甘油參與的操作時存在潛在污染的可能性，而且微量的常見元素的污染也會抑制酶的活性。進行進行

20、PCRPCR反應反應：進行PCR反應時要防止外源性DNA等的污染，避免造成酶活性和特異性降低。利用利用3232P P磷酸鹽標記細胞：磷酸鹽標記細胞：使用無菌技術是出于對自身的保護，而不是出于保護細胞。出于無菌考慮，不應讓蓋子一直敞開，不能讓氣霧產(chǎn)生以及不要使用已經(jīng)用過的移液管。無菌技術無菌技術 規(guī)則規(guī)則工作區(qū)域盡可能地遠離通風口和交通口確保整潔的工作環(huán)境實驗前用消毒劑或清潔劑清潔工作區(qū)域所有用到的移液管和試劑瓶都必須是無菌的工作區(qū)間內(nèi)盡量減少手臂的運動把所有可能用到的東西都準備好戴好乳膠手套并及時更換技術技巧技術技巧最小化保持試劑瓶與桌面成大約45角時打開蓋子若必須取下蓋子，則要把它倒放在干凈的臺面上使用玻璃的移液管及打開試劑瓶時都要用火燒一下塑料的試劑瓶和移液管不能用火燒輕輕地吸取液體，不要旋轉(zhuǎn)試劑瓶不要讓試劑瓶保持開口狀態(tài)停下你手中的工作移液移液使用可重復使用的玻璃移液管使用一次性移液管過濾除菌過濾除菌用注射式過濾器過濾少量溶液使用杯狀濾器過濾大體積的溶液抽氣操作抽氣操作保護實驗人員保護實驗人員生物安全水平的要求生物安全水平的要求生物安全櫥生物安全櫥生物安全櫥是為操作原代培養(yǎng)物、菌毒株以及診斷性標本等具有感染性的實驗材料時，用來保護操作者本人、實驗室環(huán)境以及實驗材料，使其避免暴露于上述操作過程中可能產(chǎn)生的