ELISA基礎(chǔ)知識和注意事項PPT

1、12/7/20211 ELISA基礎(chǔ)知識和注意事項基礎(chǔ)知識和注意事項12/7/20212 類容類容oELISA的基本原理和相關(guān)概念o特別說說捕獲法oELISA結(jié)果的影響因素oELISA結(jié)果的處理12/7/20213ELISA的基本原理和相關(guān)概念 12/7/2021412/7/2021512/7/20216ELISA的分類o測抗原：競爭法（也可用于測抗體）、雙抗體夾心法。 o測抗體：間接法、捕獲法、雙抗原夾心法12/7/20217競爭法elisao 競爭法12/7/20218 包被特異性抗體包被特異性抗體 酶標抗原酶標抗原檢測抗原檢測抗原孵育孵育洗滌后顯色洗滌后顯色加樣加樣AB競爭法競爭法ELI

2、SAELISA3.顯色顯色3.孵育孵育1.加樣加樣12/7/20219 雙抗體夾心法o檢測測抗原要有至少具有2個抗原決定簇12/7/202110包被特異性抗體包被特異性抗體雙抗體夾心法雙抗體夾心法ELISAELISA檢測抗原檢測抗原1.加樣加樣2.孵育孵育3.洗滌洗滌4.加入二抗加入二抗5.孵育孵育6.顯色顯色酶標特異性抗體酶標特異性抗體12/7/202111雙抗原夾心法12/7/2021123.洗滌洗滌1.加樣加樣2.孵育孵育6.顯色顯色5.孵育孵育4.加入酶標加入酶標抗原抗原雙抗原夾心法雙抗原夾心法ELISA12/7/202113間接法 o酶標二抗是針對一類免疫球蛋白分子酶標二抗是針對一類

3、免疫球蛋白分子o只需要變換包被抗原，就可用一種酶標二抗只需要變換包被抗原，就可用一種酶標二抗檢測各種與抗原結(jié)合的抗體檢測各種與抗原結(jié)合的抗體12/7/2021141.加樣加樣2.孵育孵育3.洗滌洗滌4.加入二抗加入二抗5.孵育孵育6.顯色顯色間接法間接法ELISA12/7/202115捕獲法12/7/2021161.加樣加樣2.孵育孵育3.洗滌洗滌4.加入抗原加入抗原孵育孵育5.加入二抗加入二抗孵育孵育6.顯色顯色捕獲法捕獲法ELISA12/7/202117 區(qū)別理解o 檢測抗原？抗體？o 包被什么？ 標記什么？ 12/7/202118間接法和捕獲法比較o 間接法：假陰性，假陽性o捕獲法：酶標

4、抗體的要求較高12/7/202119間接法的假陽性麻疹I(lǐng)gG麻疹抗原麻疹I(lǐng)gM抗人抗人酶標IgM抗體類風濕因子陽陽性性結(jié)結(jié)果果假假陽陽性性結(jié)結(jié)果果12/7/202120間接法的假陰性麻疹I(lǐng)gG麻疹抗原麻疹I(lǐng)gM酶標抗人IgM抗體陽陽性性結(jié)結(jié)果果假假陰陰性性結(jié)結(jié)果果12/7/202121ELISA的有關(guān)名詞概念o質(zhì)控血清：質(zhì)控血清是為了對實驗結(jié)果進行控制而配制的血清。質(zhì)控血清可以是定值也可以是不定值，可以購置也可以自配。自己配制時要注意選用無脂血的血清或血漿，不能用試劑盒內(nèi)的陽性對照。若用稀釋的血清作為質(zhì)控血清，應(yīng)考慮稀釋基質(zhì)成分對結(jié)果的影響。因質(zhì)控血清與臨床標本不一致，應(yīng)該注意對結(jié)果的分析，應(yīng)

5、該注意質(zhì)控血清只能用于質(zhì)控活動，不可用于標定儀器或評價方法。用于室用于室內(nèi)質(zhì)控的質(zhì)控血清一般選取內(nèi)質(zhì)控的質(zhì)控血清一般選取CUTOFF值值2-3倍的倍的質(zhì)控品。質(zhì)控品。12/7/202122o室內(nèi)質(zhì)控：實驗室內(nèi)部使用控制實驗結(jié)果可靠性的一種質(zhì)量控制。o室間質(zhì)評：用于考核各個實驗室結(jié)果可靠性的一種考核，可分為國家級和地方級的室間質(zhì)評?？梢岳斫鉃?“各個實驗室的質(zhì)量評比”。12/7/202123o臨界值（CUTOFF值）：臨界值是判斷陰陽性或有臨床意義水平的數(shù)值，臨界值的確定是測定大量數(shù)據(jù)后應(yīng)用統(tǒng)計學方法確定的。許多試劑都會給出臨界值或臨界值的計算方法。o 本底：就是底色。如ELISA HBsAg，

6、陽性顯色，陰性不顯色，本底就是整個陰性顯色的情況。ELISA 抗HBcAb，陽性不顯色，陰性顯色，本底就是整個陽性顯色的情況。12/7/202124o靈敏度：能檢測到的分析物的最小量，表示檢測下限的能力。o相對靈敏度=真陽性/（真陽性+假陰性）100%o測定方法及表示方法：靈敏度標準品、質(zhì)控血清、陽性標本稀釋終點、血清盤（pannel）及臨床標本陽性率。12/7/202125o特異性特異性： 真陰性標本的檢出能力。o相對特異性=真陰性/（真陰性+假陽性）100%o測定及表示方法：質(zhì)控血清、血清盤、臨床標本陰性率。12/7/202126Elisa結(jié)果的影響因素o 試劑盒的選擇 o 標本o 加樣與

7、稀釋o 溫育o 洗版o 顯色o 質(zhì)控12/7/202127試劑盒的選擇o 同行的試劑使用情況o 上級部門對試劑實際使用的綜合評價o 使用臨界值質(zhì)控血清進行實際檢測比較,選擇林敏度和準確度高、特異性強試劑盒12/7/202128標本o應(yīng)注意避免溶血 o在5 天內(nèi)測定的血清標本可放置于4、超過一周測定的需20保存o盡量避免反復凍融（少量分裝）12/7/202129加樣和稀釋o 加樣本的準確性（個人因素和實驗條件）o 盡可能排除主關(guān)因素（盡可能用加樣槍，避免直接使用滴瓶）o 各種試劑盒標本的稀釋使用，嚴格按照說明是操作12/7/202130溫育o 溫度o 水浴箱o 發(fā)硬板應(yīng)漂浮于水上或水面應(yīng)高于反應(yīng)

8、板12/7/202131洗版o 手洗o 洗板機 （微孔液體殘留45s）12/7/202132顯色o 通常是A、B兩種液體，不穩(wěn)定，又顏色應(yīng)立即丟棄o 先加A后加B，顯色時間嚴格按說明書進行o 終止后15內(nèi)比色12/7/202133質(zhì)控o 室內(nèi)質(zhì)控血清o 即刻法12/7/202134ELISA試劑的常見問題原因及其解決o 顯色淺，靈敏度低o 假陽性多，本底高甚至花板o 重復性不好o 白板12/7/202135顯色淺 靈敏度低序號原因解決方法1試劑盒運輸時間過長，受高溫天氣影響，酶的活性降低。試劑運輸過程加放足夠冰袋并盡可能縮短運輸時間。2試劑盒（包括未用完的板條及其他組分）保藏條件不正確。試劑盒

9、內(nèi)所有組分都應(yīng)當在4冷藏，未使用完的板條要密封保存。3試劑盒使用時已超出有效期。過期試劑盒不可以使用。4溫育時間不夠。嚴格按照說明書操作。5恒溫箱溫度達不到37。注意控制恒溫箱溫度，盡可能讓其穩(wěn)定在370.5。盡量避免頻繁開關(guān)恒溫箱門。經(jīng)常注意水箱中合適的水位。在保證水不沒過酶標板的前提下，使水位盡量高，以保證反應(yīng)溫度。12/7/2021366加樣量不足；移液時抽吸排放過快，有氣泡、或吸頭內(nèi)殘留液體過多。經(jīng)常校正移液器。注意吸頭要與移液器吻合。移液不宜過快，排放要完全。7顯色劑加量不足，或加入順序顛倒。按照說明書要求，先加入A液、后加入B液，并保證加入量。8樣品用NaN3防腐，影響了酶的活性。

10、不可以使用NaN3防腐。9試劑、樣品使用前未平衡至室溫。試劑、樣品從低溫保藏條件中拿出來后，要先平衡至室溫方可以使用。10試劑開啟時間過長，污染。試劑開啟后應(yīng)該在盡可能短的時間內(nèi)用完，在保證正確貯存的前提最長不要超過。12不同批號試劑中混用不同批號試劑不能混用12/7/202137假陽性多，本底高甚至花板 序號原因解決方法1試劑過期過期試劑不能使用2加樣時污染注意更換吸頭。盡可能避免污染。3加酶時污染對先加樣后加酶的操作，加酶時要注意吸頭不要接觸標本，造成污染。當可能造成污染時，一定要更換吸頭，切忌僥幸心理。4恒溫箱溫度過高注意控制恒溫箱溫度，盡可能讓其穩(wěn)定在370.5。5整個操作時間過長、造

11、成反應(yīng)時間不同（第一孔與最后一孔反應(yīng)時間相差很懸殊）。氣溫高時更明顯。在盡可能短的時間內(nèi)完成操作。盡量不要堆積多塊板子操作（尤其手工操作時）。12/7/2021386洗液稀釋倍數(shù)過高按照要求倍數(shù)稀釋洗液7洗板次數(shù)不夠按試劑要求，不可任意減少洗板次數(shù)8洗板時浸泡時間不夠按要求操作，并適當延長浸泡時間。9手工洗板方式不正確洗板時，垂直加入洗液，保證一定的沖擊力；洗液要注滿板孔，并保證30-60秒的浸泡時間。10洗板機調(diào)試不正確或者有故障（可通過手工洗板判定）手工洗板，并聯(lián)系儀器廠家維修。11酶被污染防止組分的污染。如使用容器，注意容器的清潔。12顯色液B液被污染13顯色完后沒有終止反應(yīng)。顯色完立即

12、終止反應(yīng)。12/7/202139重復性不好 1加樣量多少不一，操作時間長短不一。重復同一樣品時，加樣量與加樣時間相同；同時注意移液器的校準。加樣后應(yīng)該將酶標板放置在微量振蕩器上，充分混合；標本保證一致、無污染；盡可能由同一名操作人員操作。盡可能模擬相同的反應(yīng)條件。2加入標本后沒有混勻。3重復實驗的操作人員不同，操作習慣不同。4反應(yīng)時間、溫度等不相同。5標本不同（被混淆或者處理不同）6精密度測定方法不標準采用正確的方法操作12/7/202140白板 1忘記加酶嚴格按照說明書操作。2忘記加顯色液3酶或A、B液被污染失效防止組分被污染，注意保存。4把終止液當A液注意液體組分加樣順序。12/7/202141結(jié)果處理o OD值出現(xiàn)負