轉錄水平檢測甲胎蛋白（課堂PPT）

1、醫(yī)學分子生物學第四次討論課第四次討論課醫(yī)學分子生物學AFP的來源及生化特性AFP測定的臨床意義從轉錄水平對AFP（甲胎蛋白）基因的表達進行檢測醫(yī)學分子生物學AFP的來源及生化特性的來源及生化特性甲種胎兒球蛋白（alpha-fetoprotein或-fetoprotein,AFP或afp）。AFP是嚙齒類動物胚胎期和人胚胎期血清中的主要蛋白成分。人類胚胎在宮內發(fā)育的第六周左右用雙向擴散法即能測出AFP，到第13周左右可達到高峰，第16周后AFP的濃度迅速下降而白蛋白濃度上升。在人類胚胎中AFP最高濃度可達34mg/ml，但新生兒期其血清濃度約為1050ug/ml，出生后第1周末用雙向擴散法即不再

2、能測出，然而用敏感的方法測定，證明AFP可持續(xù)存在于正常成人的血清中。AFP的合成部位主要是在嚙齒動物及人類胚胎的肝臟，但也可在卵黃囊及胃腸道等。人類的AFP屬于球蛋白，分子量約為64,00072,000。此蛋白約有18種氨基酸組成，碳水化合物約占4%。醫(yī)學分子生物學AFP測定的臨床意義測定的臨床意義診斷原發(fā)性肝癌。檢測AFP的含量是診斷原發(fā)性肝癌的重要手段之一，由于肝癌的癌細胞能合成或分泌較多的AFP釋放入血的緣故。正因為如此，醫(yī)生們就把檢測人體血液中的AFP作為診斷肝癌的重要依據，并把AFP稱為“肝癌標志物”。檢測AFP是診斷肝癌的一種簡便、靈敏、快捷的方法，現認為它在發(fā)現早期肝癌方面有獨

3、一無二的價值，用AFP診斷肝癌的“專一性”僅次于病理學檢查。血清AFP升高，還可出現于畸胎瘤、睪丸和卵巢腫瘤等。急性肝炎和肝硬化的鑒別診斷肝細胞再生時期，AFP在血液中呈陽性，急、慢性肝炎、肝硬化時會有肝細胞再生，因而AFP在血液中的濃度升高。一般急性肝病，可隨病情好轉AFP含量下降或正常，肝硬化可呈下降或持續(xù)低水平，肝癌則逐漸上升。先天性疾病的診斷先天性疾病的診斷：檢測羊水中AFP含量的意義已引起注意，Rendle用放射免疫法檢測，發(fā)現無腦兒羊水中含量顯著升高。正常妊娠1216周羊水AFP含量為21.11.2mg/L，以后逐月下降，足月時為0.50.2mg/L。無腦兒患者在妊娠2631周為9

4、5.719.3mg/L，32-38周為25.75.9mg/L。先天性腎病及脊柱裂也有類似報道。因此用放免法檢測羊水中AFP含量，有助于某些先天性疾病的出生前診斷。母體血中AFP升高還可見于異常妊娠，如：胎兒有脊柱裂、無腦兒、腦積水、十二脂腸和食道閉鎖、腎變性、胎兒宮內窒息、先兆流產和雙胎等。醫(yī)學分子生物學甲胎蛋白基因甲胎蛋白基因(alpha-fetoprotein，AFP) 的異常表達與肝癌、前列腺癌等惡性腫瘤有關的異常表達與肝癌、前列腺癌等惡性腫瘤有關。01020304實驗目的 實驗方法及原理技術路線 可能的結果分析及應用從從轉錄轉錄水平對水平對AFP（甲胎蛋白）（甲胎蛋白）基因基因的表達進

5、行檢測的表達進行檢測醫(yī)學分子生物學實驗目的技術路線實驗方法及原理可能的結果分析及應用 肝癌細胞的血源性播散是原發(fā)性肝癌肝外轉移的主要方式，定量檢測AFP(alphafetoprotein)mRNA可早期發(fā)現外周血的肝癌細胞，不僅對判斷肝癌的轉移、復發(fā)具有重要價值，而且對指導臨床制定治療措施亦有重要意義。 通過提取肝癌病人的外周血，根據mRNA豐度的測定方法，從轉轉錄錄水平對AFP（甲胎蛋白）基因的表達進行檢測。 取材：肝癌患者外周血，用健康志愿者與非癌性肝病患者作為對照組。醫(yī)學分子生物學技術路線實驗方法及原理實驗目的可能的結果分析及應用通過細胞RNARNA提取提取技術，然后通過逆轉錄合成逆轉錄

6、合成cDNAcDNA，利用實時熒光定量實時熒光定量PCRPCR技術，測定AFPmRNA的豐度。實時熒光定量實時熒光定量PCR（QuantitativeReal-timePCR）是一）是一種在種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質測每次擴增反應中，以熒光化學物質測每次聚合酶鏈式聚合酶鏈式反應反應（PCR）循環(huán)后產物總量的方法。）循環(huán)后產物總量的方法。Real-timePCR是在是在PCR擴增過程中，通過熒光信號，對擴增過程中，通過熒光信號，對PCR進程進行實時檢測。由于在進程進行實時檢測。由于在PCR擴增的指數時期，模擴增的指數時期，模板的板的Ct值和該模板的起始拷貝數存在線性關系，通過內參值和該

7、模板的起始拷貝數存在線性關系，通過內參或者外參法可對待測樣品中的特定或者外參法可對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析序列進行定量分析。醫(yī)學分子生物學技術路線實驗方法及原理實驗目的可能的結果分析及應用一、實時熒光定量一、實時熒光定量PCR（FQ-PCR）01熒光染料02熒光共振能量轉移03PCR擴增及其監(jiān)測04實時熒光定量PCR定量原理05實時熒光定量PCR優(yōu)缺點醫(yī)學分子生物學技術路線實驗方法及原理實驗目的可能的結果分析及應用 熒光基團通常各有單一的的光吸收峰，熒光基團吸收激發(fā)光的能量后通常以3種方式釋放出能量。 （1）光能 （2）熱能 （3）轉移給鄰近的分子01熒光染料醫(yī)學分子生物學技術路

8、線實驗方法及原理實驗目的可能的結果分析及應用 當某個熒光基團的發(fā)射光譜與另一個熒光基團的吸收光譜發(fā)生重疊，且兩個基團距離足夠近時，能量可以從短波長（高能量）的熒光基團傳遞到長波長（低能量）的熒光基團，實際相當于將短波長熒光基團釋放的熒光屏蔽（猝滅）。02熒光共振能量轉移醫(yī)學分子生物學技術路線實驗方法及原理實驗目的可能的結果分析及應用 熒光PCR的獨特之處在于PCR過程中利用熒光染料在激發(fā)光下釋放的熒光能量的變化直接反應PCR擴增產物量的變化。由于熒光信號變量與擴增產物變量成正比，通過足夠靈敏的自動化儀器對熒光進行采集和分析，能夠實現對PCR過程的檢測，達到對原始模板定量的目的，主要采用以下數種

9、模式：03PCR擴增及其監(jiān)測01仿溴乙錠著色監(jiān)測02熒光標記引物03熒光標記探針醫(yī)學分子生物學技術路線實驗方法及原理實驗目的可能的結果分析及應用04實時熒光定量PCR定量原理1.幾個基本概念01020304基線熒光閾值的設定Ct值值05S型擴增曲線型擴增曲線熔解曲線醫(yī)學分子生物學技術路線實驗方法及原理實驗目的可能的結果分析及應用是指在PCR擴增反應的最初數個循環(huán)里，熒光信號變化不大。接近一條直線，這樣的直線即是基線。一般將PCR反應前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號（本底信號是指沒有進樣時檢測器的信號值，與檢測器的類型有關，是無論如何也去不掉的值。測試的結果是在本底值之上增加多少的），熒光

10、域值是PCR315個循環(huán)熒光信號標準差的10倍，熒光域值設定在PCR擴增的指數期。04實時熒光定量PCR定量原理基線熒光閾值的設定C代表循環(huán)數、t代表域值。Ct值的含義是：每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環(huán)數，而所涉閾值都很低。Ct值分析實際上就是低濃度的熒光值分析。由于是低濃度，影響因素小，誤差沒有被放大，所以具有良好的重現性。Ct值值醫(yī)學分子生物學技術路線實驗方法及原理實驗目的可能的結果分析及應用PCR過程中，以循環(huán)數為橫坐標，以反應過程中實時熒光強度為縱坐標所作的曲線。S型擴增曲線型擴增曲線04實時熒光定量PCR定量原理醫(yī)學分子生物學技術路線實驗方法及原理實驗目的可能的結

11、果分析及應用 Ct與起始模板量的對數呈反比，即Y=-aX+b，其中X為濃度值對數值，Y 為Ct值。 PCR擴增包含定量對照，即引入一系列已知起始濃度的模板與未知樣品同時進行擴增，配合使用PCR擴增與熒光檢測合二為一的儀器，利用該系列模板Ct值與已知濃度對數作直線回歸得到標準曲線，從而計算出位置樣品的起始模板濃度。 這種定量分析摒棄對PCR終產物的測定，通過監(jiān)測PCR過程中熒光強度的連續(xù)變化，用準確表征PCR對數增長規(guī)律的Ct值進行循環(huán)實時分析。04實時熒光定量PCR定量原理醫(yī)學分子生物學技術路線實驗方法及原理實驗目的可能的結果分析及應用 固定循環(huán)數后，熒光信號與模板數成正比，但當固定熒光信號值

12、后，模板數就與循環(huán)數呈反比。研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可做出標準曲線：橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代表Ct值。因此，只要獲得位置樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數（起始拷貝數就是指某基因(可以是質粒)在某一生物的基因組中的個數.單拷貝就是該基因在該生物基因組中只有一個,多則指有多個）。04實時熒光定量PCR定量原理醫(yī)學分子生物學技術路線實驗方法及原理實驗目的可能的結果分析及應用熒光PCR融匯了PCR的靈敏性、DNA雜交的特異性和光譜技術的定量精確性，具有以下的優(yōu)點：05實時熒

13、光定量PCR優(yōu)缺點優(yōu)點1）封閉反應，直接探測PCR過程中的變化以獲得定量的結果，污染因素少，且無需PCR后處理。2）靈敏度高，假陽性率低，熒光標記探針的最大優(yōu)點在于其特異性非常強，避免了非特異性擴增造成的假陽性信號。3）采用對數期分析，摒棄終點數據，定量準確。7）操作安全快速4）定量范圍寬，可達到10個數量級。5）計算機同步跟蹤，數據化自動處理，在線實時監(jiān)測，結果直觀，避免人為判斷。8）利與自動化和聯網管理6）效率高，可用多種商品畫熒光物質，如TET、FAM、HEX、JOE等作為報告熒光（3端的猝滅基團常用TAMRA），實現一管雙檢或多檢。醫(yī)學分子生物學技術路線實驗方法及原理實驗目的可能的結果

14、分析及應用擴增的循環(huán)數越靠后，定量的重復性越差，可能有以下主要原因：1)熒光定量技術要求在低分子濃度環(huán)境。因為熒光檢測定量原理是在忽略分子間相互作用的情況下建立起來的。如果分子濃度過高，影響作用復雜，而PCR擴增產物時高濃度的，因此重復性變差也很容易理解。2)由于擴增末期，擴增效率可能因為大量的靶序列而產生不可控的影響。05實時熒光定量PCR優(yōu)缺點缺點醫(yī)學分子生物學技術路線實驗方法及原理實驗目的可能的結果分析及應用二、二、TaKaRa One Step SYBR QRT-PCR試劑盒試劑盒醫(yī)學分子生物學技術路線實驗方法及原理實驗目的可能的結果分析及應用01制品內容醫(yī)學分子生物學技術路線實驗方法

15、及原理實驗目的可能的結果分析及應用原理：原理：本制品利用反轉錄酶PrimeScriptRTase將RNA反轉錄成cDNA，在以cDNA為模板利用TaKaRaExTaqHS在同一反應管內連續(xù)進行RT-PCR擴增反應（利用SYBRGreenI嵌合熒光法）。采用如圖所示的OneStepRT-PCR方法，反轉錄以總RNA為模板，利用反應引物合成cDNA，在以此為模板，利用引物進行PCR擴增反應。01制品原理醫(yī)學分子生物學實驗目的技術路線實驗方法及原理可能的結果分析及應用用用TRIzol試劑盒提取試劑盒提取RNATRIzol是一種新型總RNA抽提試劑，可以直接從細胞或組織中提取總RNA。其含有苯酚、異硫

16、氰酸胍等物質，能迅速破碎細胞并抑制細胞釋放出的核酸酶。醫(yī)學分子生物學實驗目的技術路線實驗方法及原理可能的結果分析及應用醫(yī)學分子生物學實驗目的技術路線實驗方法及原理可能的結果分析及應用醫(yī)學分子生物學實驗目的技術路線實驗方法及原理可能的結果分析及應用醫(yī)學分子生物學實驗目的技術路線實驗方法及原理可能的結果分析及應用引物、探針的設計和合成引物、探針的設計和合成應用生物信息學知識,從基因庫中查閱出AFP的DNA和mRNA序列。根據引物設計原則,并利用PrimerExpress2.0設計軟件,設計出擴增AFPmRNA基因片段的上下游引物和探針。PCR實驗成功的最關鍵環(huán)節(jié)就是引物的設計。甲胎蛋白甲胎蛋白DN

17、A序列序列醫(yī)學分子生物學實驗目的技術路線實驗方法及原理可能的結果分析及應用引物、探針的設計和合成引物、探針的設計和合成上游引物序列:5-TGGGACCCGAACTTTCCAAG-3下游引物序列:5-CCTGCAGACAATCCAGCACAT-3探針序列：5-TGTCCCTCTTCAGCAAAGCAGACT-3醫(yī)學分子生物學實驗目的技術路線實驗方法及原理可能的結果分析及應用RT-PCR擴增擴增AFP mRNA用上述提取的的總RNA,進行逆轉錄PCR。反應體系:主要包含上下游引物、各種酶、底物、模板和Mg2+5種物質。現在以TaKaRaOneStepSYBRQRT-PCR試劑盒為例作為整個反應體系

18、。反應條件:針對不同的引物，設定最佳的退火溫度是QRT-PCR反應順利進行的關鍵。具體反應程序包括反轉錄、預變性、變形、退火、延伸等。所有過程的反應溫度和作用時間均應經過篩選確定最佳反應條件。具體反應條件的參考值見表1，可在參考值范圍內加減選擇最佳條件。根據擴增片段長度,擴增產物用不同濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳,在紫外燈下割取特異性的條帶,用QIAquickGelExtractionKit(德國Qiagen公司)試劑盒（用于純化DNA）進行純化。醫(yī)學分子生物學實驗目的技術路線實驗方法及原理可能的結果分析及應用標準曲線的制作標準曲線的制作用RNaseFreedH2O（用于溶解難溶于水的RNA）將總RNA稀釋到0.2g/l，作為濃度最高的模板（20,1號）。然后取11個容量為150l的離心管（212號），分別加入10lRNaseFreedH2O。從1號管中取10l加到2號管中，稀釋倍數為1。以此類推，如圖所示，將1號主機2倍稀釋成