幾個(gè)常用啟動(dòng)子

1、幾個(gè)常用的啟動(dòng)子和誘導(dǎo)調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)1.最早應(yīng)用丁的表達(dá)系統(tǒng)的是 Lac乳糖操縱子，由啟動(dòng)子lacP +操縱基因lacO + 結(jié)構(gòu)基因組成。其轉(zhuǎn)錄受CAM調(diào)控和lacI負(fù)調(diào)控。2.lacUV5突變能夠在沒有CAP的存在下更有效地起始轉(zhuǎn)錄，該啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)錄水平 上只受lacI的調(diào)控，因而隨后得到了更廣泛采用。lacI產(chǎn)物是一種阻遏蛋白， 能結(jié)合在操縱基因lacO上從而阻遏轉(zhuǎn)錄起始。乳糖的類似物IPTG可以和lacI 產(chǎn)物結(jié)合，使其構(gòu)象改變離開lacO，從而激活轉(zhuǎn)錄。這種可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控成 為了大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)載體構(gòu)建的常用元件。3.tac啟動(dòng)子是trp啟動(dòng)子和lacUV5的拼接雜合啟動(dòng)子，且轉(zhuǎn)錄水平

2、更高，比lacUV5更優(yōu)越。4.trc啟動(dòng)子是trp啟動(dòng)子和lac啟動(dòng)子的拼合啟動(dòng)子，同樣具有比trp更高的轉(zhuǎn) 錄效率和受lacI阻遏蛋白調(diào)控的強(qiáng)啟動(dòng)子特性。5.在常規(guī)的大腸桿菌中，lacI阻遏蛋白表達(dá)量不高，僅能滿足細(xì)胞自身的 lac操 縱子，無法應(yīng)付多拷貝的質(zhì)粒的需求，導(dǎo)致非誘導(dǎo)條件下較高地表達(dá)，為了讓表達(dá)系統(tǒng)嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控產(chǎn)物表達(dá)，能過量表達(dá)lacI阻遏蛋白的lacIq突變菌株常被選 為 Lac/Tac/trc 表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)菌株?，F(xiàn)在的 Lac/Tac/trc 載體上通常還帶有 lacIq 基因.以表達(dá)更多l(xiāng)acI阻遏蛋白實(shí)現(xiàn)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼T導(dǎo)調(diào)控。6.IPTG廣泛用丁誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，但是IPTG有一

3、定蠹性，有人認(rèn)為在制備醫(yī)療目的 的重組蛋白并不合適，因而也有用乳糖代替 IPTG作為誘導(dǎo)物的研究。另外一種 研究方向是用lacI的溫度敏感突變體,30C下抑制轉(zhuǎn)錄，42C開始發(fā)揮作用。 熱誘導(dǎo)不用添加外來的誘導(dǎo)物，成本低，但是由于發(fā)酵過程中加熱升溫比較慢而 影響誘導(dǎo)效果，而且熱誘導(dǎo)本身會(huì)導(dǎo)致大腸桿菌的熱休克蛋白激活，一些蛋白酶會(huì)影口向產(chǎn)物的穩(wěn)定。7.以入噬菌體轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子PL、PR構(gòu)建的載體也為大家所熟悉。這兩個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子 受控丁入噬菌體cI基因產(chǎn)物。cI基因的溫度敏感突變體cI857(ts)常常被用丁 調(diào)控PL、PR啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。同樣也是30C下阻遏啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄，42CT解除抑制 開始轉(zhuǎn)錄。同樣的

4、，PL、PR表達(dá)載體需要以cI857(ts)作為表達(dá)菌株，現(xiàn)在更常 見的做法是在載體上攜帶cI857(ts)基因,所以可以有更大的宿主選擇范圍。另 外一種思路是通過嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控 cI產(chǎn)物來間接調(diào)控PL、PR啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。比如 Invitrogen 的PL表達(dá)系統(tǒng)，就是將受 trp 啟動(dòng)子嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控的 cI基因溶源化到 宿主菌染色體上，通過加入酪氨酸誘導(dǎo)抑制trp啟動(dòng)子，抑制cI基因的表達(dá)，從而解除強(qiáng)大的PL啟動(dòng)子的抑制。8.T7啟動(dòng)子是當(dāng)今大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的主流，這個(gè)功能強(qiáng)大兼專一性高的啟動(dòng)孑 經(jīng)過巧妙的設(shè)計(jì)而成為原核表達(dá)的首選、 尤其以 Novagen公司的pET系統(tǒng)為杰出 代表。強(qiáng)大的T7啟動(dòng)子

5、完全專一受控于 T7 RN麻合)，而高活性的 T7 RNA聚 合酶合成mRN物速度比大腸桿菌RNA合酶快5倍一一當(dāng)二者同時(shí)存在時(shí)，宿 主本身基因的轉(zhuǎn)錄競(jìng)爭(zhēng)不過 T7表達(dá)系統(tǒng)，幾乎所有的細(xì)胞資源都用于表達(dá)目的 也L;誘導(dǎo)表達(dá)后僅幾個(gè)小時(shí)目的蛋白通?？梢哉嫉郊?xì)胞總蛋白的50咖上。由丁大腸桿菌本身不含T7 RNA聚合酶，需要將外源的T7 RNA聚合酶引入宿主菌， 因而T7 RNA聚合酶的調(diào)控模式就決定了 T7系統(tǒng)的調(diào)控模式一一非誘導(dǎo)條件下， 可以使目的基因完全處丁沉默狀態(tài)而不轉(zhuǎn)錄， 從而避免目的基因毒性對(duì)宿主細(xì)胞 以及質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響；通過控制誘導(dǎo)條件控制T7 RNA聚合酶的量,就可以控制產(chǎn)物表達(dá)量

6、,某些情況下可以提高產(chǎn)物的可溶性部分。有幾種方案可用丁調(diào)控T7 RNA聚合酶的合成，從而調(diào)控 T7表達(dá)系統(tǒng)。1.噬菌體DE3是lambda噬菌體 的衍生株，含有l(wèi)acI抑制基因和位丁 lacUV5啟動(dòng)子下的T7 RNA聚合酶基因。 DE3溶源化的菌株如BL21(DE3)就是最常用的表達(dá)菌株，構(gòu)建好的表達(dá)載體可以直接轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株中，誘導(dǎo)調(diào)控方式和lac 一樣都是IPTG誘導(dǎo)。2.另一種策略是用不含T7 RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可完全避免因目的蛋白對(duì)宿 主細(xì)胞的潛在蠹性而造成的質(zhì)粒不穩(wěn)定。然后用入CE6噬菌體侵染宿主細(xì)胞 CE6是lambda噬菌體含溫度敏感突變（cI857ts）和pL

7、/pR啟動(dòng)子控制T7 RNA 聚合酶表達(dá)的衍生株，在熱誘導(dǎo)條件下可以激活T7 RNA聚合酶的合成。此了噬菌體之外，還可以通過共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒提供 T7 RNA聚合酶。比如有人用受溶氧濃度 控制的啟動(dòng)子 調(diào)控T7 RNA聚合酶合成，據(jù)說這比較適合工業(yè)化發(fā)酵的條件控制。 由丁 T7 RNA聚合酶的調(diào)控方式仍有可能 有痕量的本底表達(dá)，控制基礎(chǔ)表達(dá)的手 段之一是培養(yǎng)基外加葡萄糖，有助T控制本底表達(dá)水平；之二是采用帶有T7 lac 啟動(dòng)子的載體-一在緊鄰T7啟動(dòng)子的下游有一段lacI操縱子序列編碼表達(dá)lac 阻遏蛋白（lacI） , lac阻遏蛋白可以作用丁宿主染色體上 T7 RNA聚合酶前的 lacUV5啟動(dòng)子并抑制其表達(dá)，也作用丁載體T7 lac啟動(dòng)子，以阻斷任何T7 RNA 聚合酶導(dǎo)致的目的基因轉(zhuǎn)錄。pLacI工轉(zhuǎn)化也是同樣的原理。如果這還不夠，更 為嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控手段還有一一在宿主菌中表達(dá)另一個(gè)可以結(jié)合并抑制T7 RNA聚合酶的基因一一T7溶菌酶基因，降低本底。常用的帶溶菌酶質(zhì)粒有pLysS和pLysE,相容的 ori 都不會(huì)影口向后繼的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，前者表達(dá)的溶菌酶的水平