體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗

1、九、體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗In Vitro Mammalian Cells Chromosome Aberration Testi 范圍本規(guī)范規(guī)定了體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗的基本原則、要求和方法。本規(guī)范適用于檢測化妝品原料及其產(chǎn)品的致突變性。2規(guī)范性引用文件OECD Guidelines for Testing of Chemicals ( No.473, July 1997)3 試驗目的本試驗是用于檢測培養(yǎng)的哺乳動物細胞染色體畸變，以評價受試物致突變的可能性。4 定義染色體型畸變(Chromosome-type aberration):染色體結(jié)構(gòu)損傷，表現(xiàn)為在兩個染色單體相 同

2、位點均出現(xiàn)斷裂或斷裂重組的改變。染色單體型畸變(Chromatid-type aberration):染色體結(jié)構(gòu)損傷，表現(xiàn)為染色單體斷裂或染 色單體斷裂重組的損傷。染色體數(shù)目改變(Numerical aberration):所用細胞株的正常染色體數(shù)目的變化。結(jié)構(gòu)畸變(Structural aberration):在細胞分裂的中期相階段，用顯微鏡檢出的染色體結(jié)構(gòu)改變，表現(xiàn)為缺失、斷片、互換等。有絲分裂指數(shù)(Mitotic index):中期相細胞數(shù)與所觀察的細胞總數(shù)之比值；是一項反映細 胞增殖程度的指標。5試驗基本原則在加入和不加入代謝活化系統(tǒng)的條件下，使培養(yǎng)的哺乳動物細胞暴露于受試物中。用中

3、期分裂相阻斷劑(如秋水仙素或秋水仙胺)處理，使細胞停止在中期分裂相，隨后收獲細胞， 制片，染色，分析染色體畸變。6試驗方法6.1 試劑和受試物制備6.1.1 陽性對照物：可根據(jù)受試物的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)選擇適宜的陽性對照物，陽性對照物應是已 知的斷裂劑，能引起可檢出的、并可重復的陽性結(jié)果。當外源性活化系統(tǒng)不存在時，可使用甲磺酸甲酯 (methyl methanesulphonate (MMS)、甲磺酸乙酯(ethyl methanesulphonate(EMS)、 乙 基亞硝基月尿(ethyl nitrosourea)、絲裂霉素 C(mitomycin C)、4-硝 基喳咻-N-氧化物(4-nitro

4、quinoline-N-oxide )。當外源性活化系統(tǒng)存在時，可使用苯并(a)葩benzo(a)pyrene、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)。6.1.2 陰性對照物：應設(shè)陰性對照，即僅含和受試物組相同的溶劑，不含受試物，其它處理 和受試物組完全相同。此外，如未能證實所選溶劑不具有致突變性，溶劑對照與本實驗室空 白對照背景資料有明顯差異，還應設(shè)空白對照。6.1.3 受試物6.1.3.1受試物的配制：固體受試物需溶解或懸浮于溶劑中，用前稀釋至適合濃度；液體受試 物可以直接加入試驗系統(tǒng)和/或用前稀釋至適合濃度。受試物應在使用前新鮮配制，否則就必須證實貯存不影響其穩(wěn)定性。6.1.3.2

5、 溶劑的選擇：溶劑必須是非致突變物，不與受試物發(fā)生化學反應，不影響細胞存活和S9活性。首選溶劑是培養(yǎng)液(不含血清)或水。二甲基亞硯( DMSO)也是常用溶劑，使用時 濃度不應大于0.5%。6.1.3.3 受試物濃度設(shè)置(1) 最高濃度的選擇：決定最高濃度的因素是細胞毒性、受試物在試驗系統(tǒng)中的溶 解度以及pH或滲克分子濃度(osmolality)的改變。(2) 細胞毒性的確定：應使用指示細胞完整性和生長情況的指標，在活化系統(tǒng)存在或不存在的兩種條件下確定細胞毒性，例如細胞覆蓋程度 (degree of confluency )、存活細胞計數(shù)(viable cell counts)或有絲分裂指數(shù)(m

6、itotic index)。應在預試驗中確 定細胞毒性和溶解度。(3) 劑量設(shè)置：至少應設(shè)置3個可供分析的濃度。當有細胞毒性時，其濃度范圍應包括從最大毒性至幾乎無毒性；通常濃度間隔系數(shù)不大于2而。 在收獲細胞時，最高濃度應能明顯降低細胞覆蓋程度、細胞計 數(shù)或有絲分裂指數(shù)(均應大于 50% )。 對于那些相對無細胞毒性的化合物，最高濃度應是5 l/mL ,5mg/mL 或 0.01mol/L。 對于相對不溶解的物質(zhì)，當濃度低于不溶解濃度時仍無毒性， 則最高劑量應是，當處理期結(jié)束時，在最終培養(yǎng)液中溶解度限 值以上的一個濃度。在某些情況下(即僅當高于最低不溶解濃度時才發(fā)生細胞毒性)，應使用一個以上可

7、看見沉淀的濃度。最 好在試驗處理開始和結(jié)束時均評價溶解度，因為由于細胞、S9等的存在，在試驗系統(tǒng)內(nèi)在暴露過程中溶解度可能變化。不溶 解性可用肉眼鑒別，但沉淀不能影響觀察。6.1.4 培養(yǎng)液：采用MEM(Eagle)，并加入非必需氨基酸和抗菌素(青、鏈霉素，按100IU/mL ),胎牛血清或小牛血清按 10%加入。也可選用其它合適的培養(yǎng)液。6.1.5 活化系統(tǒng)通常使用的是 &混合物(S9 mix)。S9是從經(jīng)酶誘導劑(Aroclor 1254或苯巴比妥鈉和3 - 荼黃酮聯(lián)合使用)處理的嚙齒動物肝臟獲得的。S9的制備同Ames試驗。&的使用濃度為1%10% (終濃度)。S9 mix

8、中所加輔助因子的量由各實驗室自行決定，但需對S9mix的活性進行鑒定，必須能明顯活化陽性對照物。也可使用下述0.125mlMgC1 2(0.4 mol/L )KC1 (1.65mol/L)葡萄糖-6-磷酸輔酶(氧化型，NADP)用無血清MEM培養(yǎng)液補足至1mL.0.02 ml0.02 ml1.791mg3.0615mg6.2 試驗步驟6.2.1細胞：使用中國地鼠卵巢(CHO )細胞株或中國地鼠肺(CHL)細胞株。6.2.2 試驗時，應同時設(shè)陽性對照物，陰性對照物和至少3個可供分析的受試物濃度組。6.2.3 試驗前一天，將一定數(shù)量的細胞接種于培養(yǎng)皿(瓶)中，放CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。6.2.4 試驗

9、需在加入和不加入 S9 mix的條件下進行。試驗時，吸去培養(yǎng)皿(瓶)中的培養(yǎng)液,加入一定濃度的受試物、S9 mix （不加S9 mix時，需用培養(yǎng)液補足）以及一定量不含血清的培養(yǎng)液，放培養(yǎng)箱中處理 2h6h。結(jié)束后，吸去含受試物的培養(yǎng)液，用Hanks液洗細胞3次，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，放回培養(yǎng)箱，于24h內(nèi)收獲細胞。于收獲前 2h4h,加入細胞分裂中期阻斷劑（如用秋水仙素，作用時間為 4h,終濃度為1g/mL ）。當受試物為原料時，如果在上述加入和不加入 S9 mix的條件下均獲得陰性結(jié)果，則尚需補 加另外的試驗，即在不加 S9 mix的條件下，使受試物與試驗系統(tǒng)的接觸時間延長至24h

10、。當難以得出明確結(jié)論時，應更換試驗條件，如改變代謝活化條件、受試物與試驗系統(tǒng)接 觸時間等重復試驗。6.2.5收獲細胞時，用0.25%胰蛋白酶溶液消化細胞，待細胞脫落后，加入含10%胎?；蛐∨?血清的培養(yǎng)液終止胰蛋白酶的作用，混勻，放入離心管以1000r/min1200r/min的速度離心5min7min ,棄去上清液，加入0.075mol/L KC1溶液低滲處理， 繼而以新配制的甲醇和冰醋酸 液（容積比為3:1）進行固定。按常規(guī)制片，用姬姆薩染液染色。6.2.6 作染色體分析時，對每一處理組選200個（陽性對照可選 100個）分散良好的中期分裂相（染色體數(shù)為2n± 2）進行染色體畸變

11、分析。 在分析時應記錄每一觀察細胞的染色體數(shù)目， 對于畸變細胞還應記錄顯微鏡視野的坐標位置及畸變類型。6.3統(tǒng)計處理：對染色體畸變細胞率用X2檢驗，以評價受試物的致突變性。6.4 結(jié)果評價：在下列兩種情況下可判定受試物在本試驗系統(tǒng)中具有致突變性：（1）受試物引起染色體結(jié)構(gòu)畸變數(shù)的增加具有統(tǒng)計學意義，并有與劑量相關(guān)的增加。（2）受試物在任何一個劑量條件下，引起具有統(tǒng)計學意義，并有可重復性的陽性反應。在評價時應把生物學和統(tǒng)計學意義結(jié)合考慮。7試驗報告試驗報告應包括以下內(nèi)容：（1）受試物名稱、有關(guān)的理化性狀、所用溶劑及其配制、劑量選擇（應說明受試物對細胞毒 性的測定方法、溶解情況等）；（2）細胞株名

12、稱；（3）實驗條件和方法 代謝活化系統(tǒng)：制備 S9時所用酶的誘導劑、選用的動物品種和來源、S9mix的配方； 對照物：陽性對照物名稱和選用濃度；陰性（溶劑）對照物名稱及使用濃度。 培養(yǎng)液：所用培養(yǎng)液名稱、血清類別和使用濃度； 接種時的細胞密度以及所用培養(yǎng)皿（瓶）的規(guī)格； 中期分裂阻斷劑：名稱、所用濃度、作用時間； 處理時間：受試物與試驗系統(tǒng)的接觸時間； 簡述制片方法、分析的中期分裂相數(shù)目、結(jié)果評價方法。（4）結(jié)果 受試物最高劑量的確定及試驗結(jié)果：細胞毒性的測定（建議的表格見表1）;溶解情況（建議的表格見表 2）;對pH和滲克分子（osmolality ）濃度的影響（如果有影響）。 各處理組和對照組染色體畸變率（建議的表格見表3）。 本實驗室的陽性對照組和陰性對照組（常用溶劑，如 DMSO）在本實驗室歷史上的染色體畸變率范圍、均值和標準差（說明樣品數(shù)）。（5）結(jié)論。表1受試物對細胞的毒性受試物濃度g/mL活細胞計數(shù)法分裂指數(shù)法細胞覆蓋 程度接種細胞數(shù)/mL活細胞數(shù)/mL存活率