乳酸菌的分離和初步鑒定

1、乳酸菌的分離和初步鑒定劉海音 張超（長(zhǎng)春師范學(xué)院生物系，長(zhǎng)春，130032）摘要：本文采用BCG乳培養(yǎng)基瓊脂平板篩選乳酸菌，經(jīng)過(guò)連續(xù)6次以上的傳代，以達(dá)到分離提純，鏡檢時(shí)觀察到鏈球狀和桿狀兩種形狀。為了鑒定分離出的菌種，做了一系列的生理生化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，如呼噪 試驗(yàn)的反應(yīng)結(jié)果為陰性，糖發(fā)酵試驗(yàn)的反應(yīng)結(jié)果為陽(yáng)性。此外還進(jìn)一步做了小型發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)出了乳 酸的存在。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合乳酸菌的特征，從而證實(shí)該分離出的菌種為乳酸菌，桿狀的叫做短乳桿 菌，鏈球狀的叫做乳鏈球菌。關(guān)鍵詞： 乳酸菌 分離 鑒定孚L酸菌為一群可發(fā)酵碳水化合物以獲取能量，并生成大量乳酸的一類(lèi)細(xì)菌的總稱。利用發(fā)酵技術(shù)保藏食品，最典型的是

2、通過(guò)乳酸菌的發(fā)酵。這在發(fā)酵乳工業(yè)中已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用。利用天然的或經(jīng)篩選的乳酸菌發(fā)酵，已經(jīng)生產(chǎn)出多種不同類(lèi)型的發(fā)酵乳。因而分離和鑒定乳酸菌對(duì)人類(lèi)的生產(chǎn)和生活都具有非常重要的意義。本報(bào)告采用BCG牛乳培養(yǎng)基瓊脂平板篩選和分離乳酸菌， 利用鏡檢觀察到了鏈球狀和桿狀兩種形狀。通過(guò)呵噪試驗(yàn)和糖發(fā)酵試驗(yàn)以及小型發(fā)酵實(shí)驗(yàn)證明該菌種為乳酸菌，桿狀的叫做短乳桿菌， 鏈球狀的叫做乳鏈球菌1. 材料和方法1.1材料1.1.1 選用沈陽(yáng)乳業(yè)有限責(zé)任公司乳品一廠生產(chǎn)的輝山純酸奶1.1.2 培養(yǎng)基BCG牛乳培養(yǎng)基A（溶液）：脫脂奶粉100g,水500 ml,加入1.6%漠甲酚綠（B.C.G ）乙醇溶液1 ml, 80攝

3、氏度滅菌20 min.B（溶液）： 酵母膏10 g,水500 ml,瓊脂20 g, PH : 6.8 121攝氏度滅菌20 min 以無(wú)菌操作趁熱將 A ,B溶液混合均勻后倒平板。乳酸菌培養(yǎng)基牛肉膏5 g ,酵母膏5 g ,蛋白月東10 g，葡萄糖10 g ,乳糖5 g ,氯化鈉5 g , 水 1000 ml , PH : 6.8121攝氏度濕熱滅菌 20 min蛋白月東水培養(yǎng)基蛋白月東10 g ,氯化鈉 5 g ,水1000 ml , PH : 7.2 7.4121攝氏度濕熱滅菌 20 min糖發(fā)酵培養(yǎng)基蛋白月東水培養(yǎng)基 1000 ml , 1.6%漠甲酚紫乙醇溶液12 ml ,PH : 7

4、.6 ,另配20%糖溶液(葡萄糖，蔗糖)各 10 ml.制法：1) .將上述含指示劑的蛋白腺水培養(yǎng)基( PH : 7.6 )分裝于試管中，在每管內(nèi)放一倒置 的小玻璃管(Durhem tube)，使充滿培養(yǎng)液。2) .將已分裝好的蛋白腺水培養(yǎng)基和20%的各種糖溶液分別滅菌，蛋白腺水培養(yǎng)基121攝氏度滅菌 20 min，糖溶液112攝氏度滅菌 30 min .3) .滅菌后，每管以無(wú)菌操作分別加入20%的糖溶液0.5 ml ,則成1%的濃度。1.1.3有關(guān)溶液1.6 %漠甲酚紫乙醇溶液 ：漠甲酚紫1.6 g溶于100 ml乙醇中，貯存于棕色瓶中保存?zhèn)?用。呵噪試劑：對(duì)二甲基氨基苯甲醛8 g , 9

5、5 %乙醇760 ml ,濃鹽酸160 ml.10 %硫酸2 %高鎰酸鉀含氨的硝酸鹽溶液：稱取硝酸銀 2 g ,蒸儲(chǔ)水100 ml ,待硝酸銀溶解后，取出10 ml備用，向其余的90 ml硝酸銀中滴加氨水，即可形成很厚的沉淀，繼續(xù)滴加氨水至沉淀剛剛?cè)芙獬?為澄清溶液為止，再將備用的硝酸銀慢慢滴入，則溶液出現(xiàn)薄霧，但輕輕搖動(dòng)后，薄霧狀的 沉淀又消失，繼續(xù)滴入硝酸銀，直到搖動(dòng)后仍呈現(xiàn)輕微而穩(wěn)定的薄霧狀沉淀為止。1.2 方法1.2.1孚L酸菌的分離提純直接用接種環(huán)蘸取純酸奶平板劃線分離，置40攝氏度培養(yǎng)48小時(shí)。挑選出乳酸菌進(jìn)行連續(xù)6次以上的傳代，以達(dá)到提純。1.2.2 乳酸菌的鑒定口引噪試驗(yàn)1)

6、.試管標(biāo)記：取裝有蛋白腺水培養(yǎng)基的試管2支，分別標(biāo)記乳酸菌和空白對(duì)照。2) .接種培養(yǎng)：以無(wú)菌操作分別接種少量菌苔到標(biāo)記乳酸菌的試管中，標(biāo)記有空白對(duì)照的不接種，置37攝氏度恒溫箱中培養(yǎng) 2448小時(shí)。3) .觀察記錄：在培養(yǎng)基中加入乙酰12 ml ,經(jīng)充分振蕩，使呵噪萃取至乙酰中，靜置片刻后乙酰層浮于培養(yǎng)液的上面，此時(shí)沿管壁緩慢加入510滴呵噪試劑，如有呵噪存在，乙酰層呈玫瑰色，此為呵噪試驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)。糖發(fā)酵試驗(yàn)1) .試管標(biāo)記：取分別裝有葡萄糖，蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)液試管各2支，每種糖發(fā)酵試管中分別 標(biāo)記乳酸菌和空白對(duì)照。2) .接種培養(yǎng)：以無(wú)菌操作分別接種少量菌苔至以上各相應(yīng)試管中，

7、每種糖發(fā)酵培養(yǎng)液的空白對(duì)照均不接菌。將裝有培養(yǎng)液的杜氏小管倒置試管中，置37攝氏度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，觀察結(jié)果。3) .觀察記錄：與對(duì)照管比較，若接種培養(yǎng)液保持原由顏色，其反映結(jié)果為陰性；如果培養(yǎng)液呈黃色，反映結(jié)果為陽(yáng)性。培養(yǎng)液中的杜氏小管內(nèi)有氣泡為陽(yáng)性反應(yīng)，杜氏小管內(nèi)沒(méi)有氣泡為陰性反應(yīng)。1.2.3 乳酸的檢測(cè)選用已經(jīng)分離的菌種做小型發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，取發(fā)酵液的上清液約 10 ml于試管中，加入10%硫酸1 ml ,再加2%高猛酸鉀1 ml ,此時(shí)孚L酸轉(zhuǎn)化為乙醛， 把事先在含氨的硝酸銀溶液中侵泡 的濾紙條搭在試管口中，微火加熱試管至沸，觀察濾紙變化。2. 結(jié)果和分析2.1孚L酸菌的分離提純?cè)谄?/p>

8、板上出現(xiàn)了圓形稍扁平的黃色菌落，周?chē)囵B(yǎng)基變?yōu)辄S色， 初步定為乳酸菌， 取出少量在顯微鏡下觀察到了鏈球狀和桿狀兩種形狀（如圖一）2.2 孚L酸菌的鑒定該菌種的菌落為圓形稍扁平的黃色菌落，有桿狀和鏈球狀兩種形狀。在呵噪試驗(yàn)中，加入菌種的試管無(wú)任何變化，證明為陰性反應(yīng)（如圖二） 。說(shuō)明該菌不具有分解色氨酸產(chǎn)生呵噪的能力。也說(shuō)明此菌種不是大腸桿菌，因?yàn)榇竽c桿菌的呵噪試驗(yàn)證明為陽(yáng)性。 在糖發(fā)酵試驗(yàn)中，在加入葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)液中加入菌種后，培養(yǎng)液變?yōu)辄S色，反應(yīng)結(jié)果為陽(yáng)性，且杜氏小管內(nèi)無(wú)氣泡（如圖三）證明該菌種能分解葡萄糖和蔗糖而產(chǎn)酸。杜氏小管內(nèi)沒(méi)有氣泡，說(shuō)明該菌種分解糖后不產(chǎn)氣。也證明此菌種不是大腸桿菌

9、，因?yàn)槿绻谴竽c桿菌除了產(chǎn)酸反應(yīng)結(jié)果為陽(yáng)性外，而且杜氏小管內(nèi)會(huì)有氣泡，因?yàn)榇竽c桿菌具有分解葡萄糖和蔗糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣的能力。為了進(jìn)一步鑒定該菌種，還做了小型發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，通過(guò)濾紙條變黑，說(shuō)明有乳酸存在（如圖五）（圖五）因?yàn)樵诎l(fā)酵液的上清液中加入10%硫酸1 ml和2%高猛酸鉀1 ml后，此時(shí)上清液中的乳酸轉(zhuǎn)化為乙醛，加熱后使乙醛揮發(fā)，因此使濾紙條變黑。 以上種種特征均符合乳酸菌的特征。 桿狀的即為乳酸菌中的短乳桿菌，鏈球狀的即為乳酸菌中的乳鏈球菌。3.討論通過(guò)對(duì)菌落特征，菌體細(xì)胞形態(tài)以及該菌的生理生化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)和運(yùn)用該菌種做小型發(fā)酵 實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了該菌種為乳酸菌。桿狀的即為短乳桿菌，鏈球狀的即為乳鏈球菌。

10、實(shí)驗(yàn)證明： 用BCG牛乳瓊脂培養(yǎng)基易于得到乳酸菌。為了高效分離篩選乳酸菌，應(yīng)該注意挑取具有典 型特征的黃色菌落。另外，在呵噪試驗(yàn)中，為了保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，在加入呵噪試劑后切勿 搖動(dòng)試管，這樣乙醍層就不至于被破壞。在糖發(fā)酵試驗(yàn)中，應(yīng)該在滅菌時(shí)適當(dāng)延長(zhǎng)煮沸時(shí)間，這樣可以防止倒置杜氏小管內(nèi)有殘留氣泡。注意了上述幾點(diǎn)有利于實(shí)驗(yàn)的成功性。此外隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展， 對(duì)菌種的鑒定也逐漸應(yīng)用了分子生物學(xué)手段，但由于本實(shí)驗(yàn)室條件有限，不能做這個(gè)方面的實(shí)驗(yàn)。如有條件，可以做測(cè)定DNA的G+C含量，限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（RFLP ），隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性分析（RAPD）等等，這樣就能更精確地鑒 定該菌種。參考文獻(xiàn)（1） .黃秀梨