六君子湯對環(huán)磷酰胺的增效減毒作用研究

1、六君子湯對環(huán)磷酰胺的增效減毒作用研究編輯。作者：劉智勤，朱惠學(xué)，陳鵲汀蔣玉鳳，孫宏麗，黃啟?！菊?目的探討六君子湯對環(huán)磷酰胺的增效減毒作用。方法建立s180荷瘤小鼠模型后，隨機(jī)分為4組，即荷瘤 對照組、ctx組、六君子湯髙劑量+ctx組、六君子湯低劑量+ctx組，每組10只。造模次日開始給藥，共10d,停藥次 日處死，觀察荷瘤小鼠腫瘤生長情況及對小鼠免疫系統(tǒng)和抗 氧化酶的影響。結(jié)果六君子湯可提高ctx的抑瘤率及血清sod、gsh px活性，降低mda含量，同時(shí)還能增強(qiáng)化療荷瘤小鼠 脾臟淋巴細(xì)胞增殖能力和自然殺傷細(xì)胞(nk)活性(p【關(guān)鍵 詞】六君子湯環(huán)磷酰胺增效減毒腫瘤化療abs trac

2、t : object ivetoobserve thesynergyan dattenuation ofcyclophosp hamidum(ctx) activitiesby liujunzitumo rbearingmice modelswerees tahlishedand thendividedr andomlyintof outgroups, includingeontr olgroupwitht umor, ctxgrou p, liujunzide coction(high andlowdose)c ombinedwithc txgroupseac hgrouphadlom ic

3、eafterlod aysoftreatme nt, themicein thefourgroup swereallkill ed. theeffect sofliujunzid ecoctionontu morweight, im munefunction andantioxida tiveenzymewe remeasuredre spectively. r esuitsliujun zidecoctioncouldpromotespleenlymthoc yteprolifera tion, nkactiv ityandincrea setumorweig ht-inhibitin gr

4、ates, activ ityofsod, gsh -px, anddecre asedtheconce ntrationofmd asignificant lycomparedwi thctxgroup(p keywords： liu junzidecoction ；cycloph osphamide ；synergyandat tenuation；t umor chemoth erapy腫瘤是目前嚴(yán)重危害人類生命健康的常見病。當(dāng)前對腫 瘤的治療仍是以手術(shù)為主的綜合治療，其中術(shù)后化療是預(yù)防 轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的重要治療手段，然而化療常引起如臟器損害和 免疫力低下等毒副反應(yīng)，使患者難以堅(jiān)持治療。近年來

5、的研 究顯示，中醫(yī)藥在支持患者完成化療療程、增強(qiáng)療效、防止 毒副反應(yīng)上有著重要的作用，臨床運(yùn)用廣泛。六君子湯源自 婦人良方，主治脾胃氣虛兼有痰濕，癥見惡心嘔吐、胸 月完痞悶、四肢無力等癥狀，其所治療諸癥恰恰為化療中常見, 但六君子湯在腫瘤化療中的增效減毒作用報(bào)道較少，且缺乏 系統(tǒng)性和規(guī)范性。本研究通過建立s180荷瘤小鼠模型，探 討六君子湯聯(lián)合化療藥物環(huán)磷酰胺治療腫瘤是否具有減毒 增效作用，以期為該方的臨床應(yīng)用提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1 材料與儀器動物和瘤株清潔級昆明小鼠40只，810周齡，雌雄 各半，體重18遼2g,由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供， 合格證編號704113o動物在實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性馴養(yǎng)1

6、周。飼料和 墊料由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。實(shí)驗(yàn)期間自由采食 飲水。腹水型s180瘤株由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供， l929細(xì)胞株由北京市中醫(yī)研究所提供。藥物六君子湯主要由人參、白術(shù)、茯苓、甘草、陳 皮、半夏等藥物組成，由河北大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房提供，所 有藥品均經(jīng)中藥專家鑒定。取上述中藥自來水浸泡lh后， 分別加8, 6, 4倍量的水煎煮3次，時(shí)間分別為藥液熬開后 4 0, 30, 20min,將3次煎煮的藥液混合，離心，取上清， 8ctc水浴濃縮至每毫升含生藥g,高溫消毒后置4£冰箱保存?zhèn)溆谩；熕幬餅樽⑸溆铆h(huán)磷酰胺、丙二醛(mda)、谷 胱甘肽過氧化物酶(gs h px)

7、測試盒(南京建成生物工程研 究所)。儀器酶標(biāo)分析儀，c02培養(yǎng)箱，超凈工作臺(蘇凈集團(tuán), 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品)，倒置顯微鏡。ae240電子 天平。22 pc分光光度計(jì)。2方法動物模型的建立1 無菌條件下抽取傳代第8天的 s180小鼠的腹水，按1:3比例用生理鹽水稀釋，反復(fù)沖打、 充分混勻，在顯微鏡下計(jì)數(shù)，用生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度為1 xio 7/ml,取ml于每鼠右側(cè)腋窩下碘酊消毒后皮下接種。 瘤株接種前，均用臺盼藍(lán)染色，計(jì)算活細(xì)胞數(shù)為95%98%。 從抽取腹水時(shí)開始，到移植完最后一只小鼠的總時(shí)間控制在 60 min 內(nèi)。分組及給藥小鼠接種24h后按體重和性別隨機(jī)分成荷 瘤對照組、ct

8、x組、六君子湯+ctx組。荷瘤對照組用生理鹽 水灌胃，ctx組腹腔注射ctxg鹿-1d-l,同時(shí)用生理鹽水 灌胃，六君子湯高、低劑量+ctx組的化療藥物劑量、給藥途 徑及時(shí)間與ctx組相同，六君子湯高、低劑量分別給予16, 4gkg-1d-1灌胃，各組灌胃容積均為ml/10g, 1次/d, 連續(xù)10d。各組于瘤細(xì)胞接種后第2天開始用藥，于實(shí)驗(yàn)第 12天眼球采血后處死小鼠，取脾臟、腫瘤檢測各項(xiàng)指標(biāo)。抑瘤率計(jì)算于實(shí)驗(yàn)第12天，將各組小鼠眼球采血后 處死，稱重，依次用碘酊酒精消毒操作部位皮膚，于超凈工 作臺上，以無菌操作從腋部皮下完整剝?nèi)∧[瘤組織，剝離干 凈后于電子天平稱瘤體重量并按公式計(jì)算抑瘤率2

9、。抑瘤率=x10 0%nk細(xì)胞活性測定3無菌摘取脾臟，按常規(guī)制備脾 細(xì)胞懸液，用含10%小牛血清的rpmi 1640培養(yǎng)液配成1 x 107/ml濃度作為效應(yīng)細(xì)胞。取傳代培養(yǎng)的l9 29細(xì)胞，用 胰酶消化液消化2min,加入完全r pmi 1640培養(yǎng)液，調(diào) 細(xì)胞濃度為2x105/ml作為靶細(xì)胞，在96孔平底板上每孔加入靶細(xì)胞懸液100 ul, 37°c. 5%c02培養(yǎng)90min,使其貼 壁成單層細(xì)胞，然后實(shí)驗(yàn)孔加入100111效應(yīng)細(xì)胞懸液，做4 個(gè)復(fù)孔，靶細(xì)胞對照孔加完全rpmi1640培養(yǎng)液100 hl；然后將96孔板放在3 7°c, 5%c02孵箱中孵育20h,去上

10、清， 用生理鹽水輕輕注滿各孔，反復(fù)3次，以除去效應(yīng)細(xì)胞和被 殺傷脫落的靶細(xì)胞，在濾紙上吸干孔內(nèi)水分；每孔加入的 中性紅染液100 ul,孵育30min,棄去染液，用生理鹽水洗 3遍，每孔加1001x1細(xì)胞裂解液，使含有中性紅的靶細(xì)胞溶 解，搖勻，用酶標(biāo)儀在450 nm測0d值，用以下公式計(jì)算殺 傷率。殺傷率(%)=(靶細(xì)胞od值-實(shí)驗(yàn)組od值)/靶細(xì)胞0d值x 100%t淋巴細(xì)胞增殖能力的測定4 無菌摘取脾臟，常 規(guī)制作脾細(xì)胞懸液，用含10%小牛血清的rpmi 1640培養(yǎng) 基重懸細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞濃度至5x106/l,加入9 6孔細(xì)胞培 養(yǎng)板100卩1/孔，再分別加入cona 100 u 1/孔使

11、其終濃度為 6 p g/ml,將上述加好的培養(yǎng)板置371、5%c02培養(yǎng)箱68h, 取出，每孔吸出10ul,加g /lmttloul/孔，置培養(yǎng)箱內(nèi) 4h,取出，加10%sds hcl溶液100卩1/孔，振蕩過夜，酶 標(biāo)儀測570nm波長的吸光度(0d)值。以各樣本a值代表其t 淋巴細(xì)胞增殖能力?？寡趸笢y定荷瘤小鼠血清sod, gsh px和mda 含量的測定嚴(yán)格按說明書進(jìn)行操作。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理各組數(shù)據(jù)以土s表示，采用fo rwindows 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，多組間比較用one wayanova方差分 析，p 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3結(jié)果六君子湯對化療荷瘤小鼠一般狀況的影響小鼠接種 瘤細(xì)胞前，神情佳，被

12、毛光澤，能自動覓食和飲水。瘤細(xì)胞 接種后4 d,于小鼠右腋下接種部位可觸及米粒大小的瘤結(jié) 節(jié)，之后逐漸長大。ctx組及六君子湯各治療組小鼠腫瘤生 長的勢頭均不及荷瘤對照組。ctx組在腹腔注射ctx后，狀 況明顯不及荷瘤對照組，小鼠出現(xiàn)毛無光澤而稀疏脫落，少 動，懶于覓食，且這種狀況日益加重，而六君子湯治療組上 述狀況較輕。編輯。六君子湯對化療荷瘤小鼠瘤重及抑瘤率的影響由表1 可以看出，ctx組、六君子湯高、低劑量組的瘤重與荷瘤對 照組相比差異顯著；ctx組有明顯的抑制腫瘤生長作用，抑 瘤率達(dá);六君子湯高、低劑量+ctx組抑瘤率分別可達(dá)%和, ctx組與六君子湯高劑量+ctx組相比差異顯著。六君

13、子湯對化療荷瘤小鼠免疫系統(tǒng)的影響荷瘤小 鼠用ctx化療后脾臟t淋巴細(xì)胞增殖活力及nk細(xì)胞殺傷活 性均下降，而ctx聯(lián)合六君子湯治療后荷瘤小鼠淋巴細(xì)胞的 增殖反應(yīng)和nk細(xì)胞殺傷活性均有所提高，與ctx組比較差異 顯著（p六君子湯對化療荷瘤小鼠血清抗氧化系統(tǒng)功能的 影響荷瘤小鼠用ctx聯(lián)合六君子湯治療后血清sod,gsh px 活力明顯升高，mda含量下降，與ctx組比較差異顯著（p表 1六君子湯對化療小鼠瘤重及抑瘤率的影響與荷瘤對照組比較,*p < ;與ctx組比較,p< ； n=10表2六君子湯對化療荷瘤小鼠nk細(xì)胞殺傷率和淋巴細(xì) 胞增殖的影響與 ctx 組比較 p< , p

14、<； n=10表3六君子湯對化療荷瘤小鼠血清sod, gsh px,mda的影響與ctx組比較op < ； n=104討論六君子湯源自婦人良方，功善健脾益氣，燥濕化痰， 和胃消痞，降逆止嘔。方中人參為君，甘苦溫相用，大補(bǔ)元 氣，益助脾胃；白術(shù)為臣，甘苦溫相用，補(bǔ)氣健脾，溫中燥 濕；茯苓為佐，甘淡平相用，滲濕健脾；陳皮健脾和中，行 氣止痛；半夏化痰濕、補(bǔ)脾氣；甘草調(diào)中，補(bǔ)益脾胃之氣。諸藥合用標(biāo)本兼顧，培正固本，從而可預(yù)防和改善諸種化療 副反應(yīng)，提髙患者化療期間的生活質(zhì)量。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證 實(shí)5,六君子湯不僅具有抗腫瘤作用，還可調(diào)節(jié)免疫功能， 保護(hù)臟器免受有害毒物損傷。本研究通過觀察六

15、君子湯聯(lián)合ctx抗s18 0荷瘤小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，六君子湯高劑量聯(lián)合ctx 組腫瘤抑制率高于ctx組，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)六君子湯對ctx引起 的荷瘤小鼠毛發(fā)無光澤、稀疏脫落，少動，懶于覓食等狀況 有改善作用，提示六君子湯對ctx抗移植瘤生長具有一定增 效減毒作用。腫瘤患者的免疫功能與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)6, 7。腫瘤的存在抑制機(jī)體免疫功能8,而化療藥物應(yīng)用可 加重機(jī)體的免疫抑制。因此提高腫瘤患者的免疫功能，尤其 是化療后出現(xiàn)的嚴(yán)重免疫功能抑制，成為抗腫瘤治療的一個(gè) 主要方面。在抗腫瘤免疫方面，細(xì)胞免疫占主導(dǎo)地位，t細(xì) 胞為細(xì)胞免疫的主要方面，是機(jī)體抗腫瘤免疫的核心力量, t淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)率是一個(gè)能

16、夠代表機(jī)體免疫能力的重要 免疫因素9 o nk細(xì)胞是細(xì)胞免疫中的非特異性成分，主 要發(fā)揮免疫監(jiān)視功能和抗腫瘤作用，它不僅可以直接殺傷腫 瘤細(xì)胞，也可以通過產(chǎn)生il 2、干擾素等增強(qiáng)其他細(xì)胞的 抗腫瘤作用，在機(jī)體免疫反應(yīng)中起重要作用。因此nk細(xì)胞殺 傷活性可有效地反映機(jī)體的免疫功能。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，荷瘤小 鼠應(yīng)用ct x后t淋巴細(xì)胞增殖和nk細(xì)胞殺傷活性均下降， 而ctx聯(lián)合六君子湯治療后，二者均有所升高，提示六君子 湯可對抗化療藥物ctx所致的免疫抑制，促進(jìn)機(jī)體免疫功能 的恢復(fù)，從而可提高機(jī)體的抗腫瘤作用。自由基的研究屬于新興的亞分子生物學(xué)范疇，機(jī)體內(nèi)自 由基的含量與腫瘤的關(guān)系非常密切。sod和g

17、sh p x是體 內(nèi)重要的抗氧化酶，sod的主要作用是清除體內(nèi)氧自由基， 防止活性氧對細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用。gsh的作用是防止脂質(zhì)過 氧化物形成。mda是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化物的終產(chǎn)物，測試mda 的量常?？煞从硻C(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反應(yīng)出細(xì) 胞損傷的程度。癌癥的發(fā)生發(fā)展與氧化損傷密切相關(guān)。有資 料顯示，腫瘤組織中過氧化脂質(zhì)增加，而抗氧化物酶的活性 下降。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)六君子湯可提高化療荷瘤小鼠血清sod活 性與gsh px水平，降低mda的含量，提示六君子湯可提高 化療小鼠的抗氧化酶活性和減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的生成，從 而可清除體內(nèi)自由基，減輕氧化損傷的程度。綜上所述，六君子湯與化療藥物ctx合用

18、具有增效減毒 作用，其作用可能是通過提高機(jī)體免疫力和抗氧化系統(tǒng)功能 兩途徑實(shí)現(xiàn)的。這為六君子湯在腫瘤化療中的應(yīng)用提供了一 定實(shí)驗(yàn)依據(jù)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 陳鵲汀，劉智勤，蔣玉鳳，等.當(dāng)歸補(bǔ)血湯對化 療藥物5 fu增效減毒的實(shí)驗(yàn)研究j 北京中醫(yī)藥大學(xué) 學(xué)報(bào)，xx, 30:7 57.2 李儀奎.中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)，第2版m.上海: 上海科學(xué)技術(shù)出版社，xx： 777.3 付于，夏天.消瘤湯治療腫瘤及調(diào)節(jié)免疫功能的實(shí)驗(yàn)研究j 中西醫(yī)結(jié)合雜志，xx, 2:11 14.4 陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)，第2版m 北京: 人民衛(wèi)生出版社，xx： 748.5 沈映君.中藥藥理學(xué)m .北京：人民衛(wèi)生出版 社，2000:958.6 kastelanz, lukace, derzi cd , etal. lymp hocytesubset slymphocyter eactivitytom itogensnkcel lactivityand neutrophilan dmon